Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم البروتوكول منهجيتين لتحسين عزل البكتيريا المعوية اللاهوائية. يركز الأول على عزل مجموعة متنوعة من البكتيريا باستخدام وسائط استزراع مختلفة. ويركز الثاني على خطوات زراعة مجموعة ميكروبية معينة ، وربما استيعاب ميو-إينوزيتول ، لفهم أهميتها البيئية بشكل كامل.

Abstract

الجهاز الهضمي (GIT) للدجاج هو نظام بيئي معقد يؤوي تريليونات من الميكروبات التي تلعب دورا محوريا في فسيولوجيا المضيف ، والهضم ، وامتصاص العناصر الغذائية ، ونضج الجهاز المناعي ، ومنع تسرب مسببات الأمراض. من أجل صحة وإنتاجيته المثلى ، من الضروري توصيف هذه الكائنات الحية الدقيقة وفهم دورها. في حين أن الجهاز الهضمي للدواجن يحتوي على خزان من الكائنات الحية الدقيقة مع تطبيقات بروبيوتيك محتملة ، فإن معظم التنوع لا يزال غير مستكشف. لتعزيز فهمنا للتنوع الميكروبي غير المزروع ، هناك حاجة إلى جهود متضافرة لجلب هذه الكائنات الحية الدقيقة إلى الثقافة. ينتج عن عزل وزراعة الكائنات الحية الدقيقة المستعمرة للجهاز الهضمي مواد قابلة للتكاثر ، بما في ذلك الخلايا والحمض النووي والمستقلبات ، مما يوفر رؤى جديدة لعمليات التمثيل الغذائي في البيئة. بدون زراعة ، يظل دور هذه الكائنات في بيئاتها الطبيعية غير واضح ويقتصر على المستوى الوصفي. هدفنا هو تنفيذ استراتيجيات الزراعة التي تهدف إلى تحسين عزل مجموعة متنوعة من الميكروبات اللاهوائية من الجهاز الهضمي للدجاج ، والاستفادة من المعرفة متعددة التخصصات من فسيولوجيا ، وتغذية ، وعلم الميتاجينوميات ، والكيمياء الحيوية للأعلاف ، واستراتيجيات الزراعة الحديثة. بالإضافة إلى ذلك ، نهدف إلى تنفيذ استخدام الممارسات المناسبة لأخذ العينات والنقل وإعداد الوسائط ، والتي من المعروف أنها تؤثر على نجاح العزلة. يجب أن تضمن المنهجيات المناسبة بيئة متسقة خالية من الأكسجين ، والظروف الجوية المثلى ، ودرجة حرارة حضانة المضيف المناسبة ، وتوفير متطلبات غذائية محددة تتماشى مع احتياجاتهم المميزة. باتباع هذه المنهجيات ، لن تسفر الزراعة عن نتائج قابلة للتكرار للعزل فحسب ، بل ستسهل أيضا إجراءات العزل ، وبالتالي تعزيز فهم شامل للنظام البيئي الميكروبي المعقد داخل الجهاز الهضمي للدجاج.

Introduction

استكملت عودة الزراعة في دراسة الكائنات الحية الدقيقة رؤى من الدراسات الميتاجينومية من خلال توفير المواد لاختبار الفرضيات الأيضية التي تم وصفها وتحديدها جزئيا في السابق. توفر زراعة البكتيريا المعوية مادة للحفاظ على الأبحاث المستقبلية حول التفاعلات بين الميكروبات والمضيف ، وتسهيل دراسات الاستعمار المستهدفة ، وتحسين دراسات التفاعل الجزيئي1،2،3. أدت المعرفة المكتسبة حول الكائنات الحية الدقيقة المعدية المعوية إلى تحسين تغذية ورفاهيته من خلال التأثير على تركيبات النظام الغذائي وتعزيز توافر المغذيات4. وقد ساهم هذا الفهم في تحسين الأداء في استخدام تفاعل البريبايوتك والبروبيوتيك. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى بحث متعمق للحصول على فهم كامل لكيفية تفاعل الظروف البيوكيميائية والفيزيائية والكيميائية وتأثيرها على الملف الميكروبي وهيكله. لتحقيق هذا الهدف ، تظل الزراعة ضرورية ، وتعمل كأداة حاسمة للتعمق في الديناميات المعقدة للمجتمعات الميكروبية داخل بيئة الجهاز الهضمي.

على النقيض من الأبحاث المكثفة حول الميكروبات المرتبطة بأمعاء الإنسان ودراسات الزراعة السريرية5 ، استخدمت التقارير المتعلقة بالكائنات الحية الدقيقة من الماشية في الغالب مجموعة محدودة من الوسائط للعزل ، مما قد يحد من تنوع العزلات 2,3. علاوة على ذلك ، لم يتم بعد تنفيذ التحسينات في صياغة الوسائط والدراسات حول تفاعل الفوسفات والأملاح مع الأجار ، كما أوضحها تاناكا وآخرون وكاواساكي وآخرون ، لدراسات ميكروبيوم الأمعاء6،7،8،9.

تعتبر مادة شبه أساسية, ميو-اينوزيتول (MI) وقد ذكرت أن تلعب دورا محوريا في مختلف العمليات الأيضية, الفسيولوجية, والعمليات التنظيمية10,11. وتشمل هذه المشاركة في تمعدن العظام ، وتنمية عضلات الثدي ، والإشارات الخلوية ، وتعزيز الإباضة والخصوبة ، وتعديل الإشارات العصبية ، والعمل كمنظم لتوازن الجلوكوز وتنظيم الأنسولين في الدواجن10،11. يلعب MI دورا كسلائف من خلال تحويله داخل العمليات الكيميائية الحيوية المحورية ، بما في ذلك عملية تحلل السكر / تكوين الجلوكوز ، ودورة حامض الستريك ، ومسار فوسفات البنتوز. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يعمل أيضا كسلائف للفوسفاتيديلينوسيتول (PI) ، والذي يشارك أيضا في استقلاب الغليسيروفوسفوليبيد12. أفادت بعض التحقيقات أن استقلاب MI يؤدي إلى تغيرات في استقرار العظام وأداء. وهذا يشمل التحسينات في معدل تحويل الأعلاف وزيادة وزن الجسم ، مما يدل على تأثيره بعد الامتصاص والاستخدام داخل13،14. ومع ذلك ، فإن مسار استقلاب MI وتأثيره على استقلاب الدواجن لا يزال بعيد المنال15. علاوة على ذلك ، تقترح دراسات قليلة دورا محتملا للبكتيريا في استخدام MI ، خاصة في المناطق ذات النشاط الأيضي العالي مثل الدقاق16،17،18،19.

تهدف الجهود المبذولة لزراعة البكتيريا من الجهاز الهضمي للحيوانات إلى تعزيز قواعد البيانات الجينومية وتوسيع نطاق البحث ، والتحقق من الفرضية القائمة على الجينوم ، وفهم الأهمية البيئية لهذه الموارد20. الهدف من هذا العمل هو تحسين استراتيجيات الزراعة البكتيرية من الجهاز الهضمي للدجاج لتعزيز تنوع العزلة والعزلة المستهدفة لمجموعة بيئية ذات أهمية تستوعب واستقلاب ميو-إينوزيتول.

Protocol

ينقسم البروتوكول إلى أربعة أجزاء: أخذ العينات ، والعزل البكتيري ، وتحديد ، والحفاظ على الكائنات الحية الدقيقة التي تم الحصول عليها. تم إصدار الأذونات المعتمدة بشأن استخدام من قبل اللجنة الأخلاقية في Regierungspräsidium Tübingen ، ألمانيا مع أرقام الموافقة HOH50 / 17 TE و HOH67-21TE.

1. الحصول على عينات لزراعة البكتيريا اللاهوائية

  1. صيانة
    1. الحفاظ على على نظام غذائي تجاري قائم على الذرة (Legehennen / Junghennenfutter ؛ انظر جدول المواد) والمنزل في المحطة التجريبية لجامعة هوهنهايم.
  2. إعداد حل النقل
    1. في 1-2 أيام قبل جمع العينة، تحضير محلول النقل الذي يحتوي على 1.00 جم/لتر ثيوغليكولات الصوديوم، 0.10 جم/لتر ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl 2.2H 2O)، و0.5٪ من السيستين21 و0.1٪ محلول ريزازورين الصوديوم.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني للوسط على 6.0 ± 0.2 عند 25 درجة مئوية والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة عند ضغط 15 رطل لكل بوصة مربعة.
    3. بعد أن يبرد الوسط إلى حوالي 50 درجة مئوية ، استبدل غطاء الزجاجة المتوسطة بغطاء لولبي معقم بتجويف وسدادة مطاطية. أدخل إبرتي حقنة معقمتين في السدادة المطاطية في مواضع مختلفة وألصق مرشح حقنة كاره للماء (0.22 ميكرومتر) على إحدى الإبر.
      ملاحظة: يجب أن يتم استبدال الأغطية وإدخال الإبر والفلتر داخل تدفق الهواء الصفحي (LAF).
    4. قم بتوصيل أنبوب النيتروجين بنسبة 100٪ (N2) بمرشح المحقنة ، وقم بنثر غاز N2 في الزجاجة لمدة 10 دقائق عند 1 رطل / بوصة مربعة.
    5. بعد ذلك ، قم بنقل الزجاجة المتوسطة وأنابيب Hungate المعقمة إلى المحطة اللاهوائية ونقل وسيط النقل بشكل معقم إلى أنابيب Hungate. املأ أنابيب Hungate بالكامل إلى الأعلى ، مما يضمن عدم وجود أي هواء بالداخل.
  3. الذبح وجمع العينات
    1. أثناء عملية الذبح ، حافظ على الظروف المحورية لتجنب التلوث باستخدام القفازات والقناع ومئزر المختبر البلاستيكي والأدوات الجراحية المعقمة طوال العملية بأكملها. علاوة على ذلك ، قم بتعقيم مقعد العمل بشكل صحيح باستخدام الإيثانول والأنسجة لدعم بيئة معقمة.
    2. في المحطة التجريبية ، قم بتخدير 10 ، 50 أسبوعا من الدجاج البياض Lohmann باستخدام خليط غاز معبأ يتكون من 35٪ N2 و 35٪ CO2 و 30٪ O2 وقطع رأسها على الفور.
      ملاحظة: يجب إجراء التخدير والتضحية من قبل فني مختبر على دراية جيدة برعاية والإجراءات العلمية. هذا يضمن أن إجراءات التضحية تلتزم بالمعايير الأخلاقية واللوائح القانونية وإرشادات السلامة.
    3. قبل الشروع في تشريح قسم الجهاز الهضمي ، قم بتأمين الجزء المعوي المطلوب ، أي المحصول ، الدقاق ، والصائم ، باستخدام مرقئ كيلي المعقم (المعروف أيضا باسم مشبك كيلي. الشكل 1).
      ملاحظة: يجب أن يتم تشريح إما من قبل طبيب بيطري أو شخص مدرب تدريبا جيدا على دراية بتشريح الدجاج.
    4. انقل كل قسم على حدة إلى أنبوب Hungate منفصل مملوء بوسيط نقل وأغلق الغطاء بشكل صحيح. إذا لزم الأمر ، أضف وسيط نقل إضافي إلى الأنبوب لإزاحة أي هواء متبقي.
      ملاحظة: يعد نقل القسم خطوة حاسمة ، ومن الضروري تقليل أي تأخير أو فتح للقسم لمنع التعرض الطويل للأكسجين
  4. نقل العينة
    1. تعامل مع نقل أنابيب Hungate بعناية ، وضعها داخل صندوق الستايروفوم لمنع أي خطر للكسر. في حالة انخفاض درجة الحرارة الخارجية عن 15 درجة مئوية ، حافظ على درجة حرارة العينة باستخدام عبوات دافئة. تأكد من أن وقت النقل لا يتجاوز 4 ساعات.
    2. انقل الأنابيب بعناية داخل المحطة اللاهوائية لمزيد من المعالجة.

2. عزل البكتيريا اللاهوائية

  1. إعداد الإعلام الثقافي
    ملاحظة: تقدم الطريقة الموضحة اعتبارات مختلفة لإعداد وسائل الإعلام الثقافية. يوضح الجدول 1 مثالا على كيفية تقسيم الحلول للعزل المتنوع للكائنات الحية الدقيقة.
    1. قسم مكونات تركيبة الوسائط لاستخدامها في أربع مجموعات من المحاليل: مصدر الكربون ، ومصدر النيتروجين ، والأجار ، ومصدر المعادن. بالنسبة للوسائط الغنية مثل ضخ الدماغ والقلب (BHI) ، لا يكون الفصل ممكنا دائما (انظر مثال الوسيط 2 في الجدول 1). في مثل هذه الحالات ، تأكد من إعداد منفصل وتعقيم أجار أو حلول إضافية.
    2. قم بإعداد محلول الكربوهيدرات في 1/4عشر من الحجم النهائي للوسائط المطلوبة ، على سبيل المثال ، في 250 مل لحجم إجمالي قدره 1 لتر من الوسائط. باتباع مثال الوسط 1 في الجدول 1 ، قم بإذابة 2 جم من سكر العنب و 0.5 جم من النشا في 250 مل من الماء المقطر.
    3. تحضير محلول البروتين في 1/4عشر من الحجم النهائي للوسائط المطلوبة ، على سبيل المثال ، في 250 مل لحجم إجمالي قدره 1 لتر من الوسائط. باتباع مثال الوسط 1 في الجدول 1 ، قم بإذابة 10 جم من الببتون في 250 مل من الماء المقطر.
    4. تحضير محلول أجار في 45٪ إلى 48٪ من الحجم النهائي للوسائط ، على سبيل المثال ، في 450 إلى 480 مل لحجم إجمالي قدره 1 لتر من الوسائط. باتباع مثال mediu 1 في الجدول 1 ، قم بإذابة 15 جم من أجار في 450 إلى 480 مل من الماء المقطر.
    5. تحضير المحلول المعدني في حجم الوسائط الأيسر من 20 إلى 50 مل عندما يكون الحجم النهائي للوسائط 1 L. باتباع مثال الوسط 1 في الجدول 1 ، قم بإذابة 0.5 جم من K2HPO4 في 20 إلى 50 مل من الماء المقطر.
    6. الأوتوكلاف محلول البروتين ومحلول أجار والمحاليل المعدنية عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة عند ضغط 21 رطل لكل بوصة مربعة. الأوتوكلاف محلول الكربوهيدرات عند 110 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند 5 رطل / بوصة مربعة.
    7. بمجرد أن تصبح جميع المحاليل معقمة ، قم بتبريدها إلى 50 درجة مئوية واخلطها في ظروف معقمة في زجاجة زجاجية معقمة مناسبة مع غطاء به تجويف وسدادة مطاطية. بعد ذلك ، اتبع الخطوتين 1.2.3 و 1.2.4.
      ملاحظة: يجب أن يتم خلط المحاليل داخل الجيش اللبناني.
    8. بمجرد خلط الوسائط وتفريغها ، صب في أطباق أو أنابيب بتري معقمة داخل المحطة اللاهوائية.
  2. عزل البكتيريا اللاهوائية
    ملاحظة: تشرح المنهجية التالية استراتيجية العزل لزراعة مجموعة واسعة من البكتيريا اللاهوائية التي تعيش في الجهاز الهضمي للدجاج.
    1. نقل العينات إلى محطة لاهوائية تحتوي على خليط غاز معبأ يتكون من 80٪ N2 (مستوى الجودة 5.0) و 15٪ CO2 (مستوى الجودة 3.0) و 5٪ H2 (مستوى الجودة 5.0) مقدم من مورد تجاري (انظر جدول المواد).
    2. داخل المحطة اللاهوائية ، انقل القسم من أنبوب hungate إلى طبق بتري المعقم باستخدام ملقط معقم.
    3. قم بقص القسم بعناية باستخدام مقص معقم واستخراج حوالي 1 غرام من محتوى الهضم من الجزء المعوي باستخدام ملعقة معقمة.
      ملاحظة: بعد أخذ 1 غرام من محتوى الهضم ، قم بالتخلص من الملخصات المتبقية ونقلها إلى أنبوب وسائط النقل الخاص بها للعزل المستهدف.
    4. إجراء تخفيف تسلسلي 10 أضعاف باستخدام محلول فسيولوجي معقم (0.85٪ كلوريد الصوديوم).
    5. قم بتوزيع 0.1 مل من العينة من التخفيفات 10−4 إلى 10−7 في أطباق وسائط أطباق بتري معقمة وموسومة بشكل صحيح وانتشرت باستخدام ملعقة Drigalski معقمة.
    6. احتضان الألواح داخل المحطة اللاهوائية لمدة 24-48 ساعة عند 39 درجة مئوية.
      ملاحظة: عند الحضانة داخل حاضنة ، انقل أطباق بتري إلى صندوق محكم الإغلاق قبل إخراج أطباق بتري من المحطة اللاهوائية.
  3. العزل المستهدف لمجموعة بكتيرية معينة.
    ملاحظة: تشرح المنهجية التالية استراتيجية عزل البكتيريا اللاهوائية التي يمكن أن تستوعب MI.
    1. لإعداد وسط التخصيب ، والحد الأدنى من وسط الآجار ، والحد الأدنى من وسط المرق ، اتبع التركيبة المحددة في الجدول 2 والجدول 3 ، مع الالتزام بالإرشادات الموضحة في الخطوة 2.1. أضف 0.2 مل / لتر من خليط الفيتامينات المعقم بالفلتر (كما هو موضح في التركيبة) إلى الحد الأدنى من وسائط أجار والحد الأدنى من وسائط المرق بعد عملية التعقيم.
    2. تجانس العينة الأولية باستخدام خلاط دوامة لمدة 10-15 ثانية. بعد ذلك، نقل العينة المتجانسة إلى الأنبوب المحتوي على وسط إثراء بمعدل 5٪ (على سبيل المثال، إذا كان حجم وسائط التخصيب 10 مل، قم بتلقيح 0.5 مل من العينة المتجانسة) باستخدام ماصة. احتضان العينة الملقحة حديثا لمدة 24 ساعة عند 39 درجة مئوية داخل المحطة اللاهوائية.
    3. بعد الحضانة ، امزج الأنبوب المخصب جيدا إما باستخدام خلاط دوامة لمدة 10-15 ثانية أو عن طريق الماصة. بعد ذلك ، انقل العينة المختلطة إلى وسط مرق صغير معقم بمعدل 5٪ ثم احتضانها لمدة 24 ساعة عند 39 درجة مئوية.
    4. قم بتخفيف العينات بشكل متسلسل في محلول ملحي معقم (أي 0.85٪ كلوريد الصوديوم) ، بدءا من تخفيف 1:10 واستمر حتى تخفيف 1: 1000. بعد كل تخفيف ، قم بتجانس العينة جيدا في درجة حرارة الغرفة باستخدام خلاط دوامة لمدة 10-15 ثانية أو عن طريق الماصة.
    5. في ظل ظروف معقمة ولاهوائية ، انقل 1 مل من العينة المخففة إلى طبق بتري. صب ما يقرب من 15-20 مل من وسط أجار الحد الأدنى المذاب في طبق بتري وحركه برفق أفقيا لخلط منتظم.
      ملاحظة: يجب أن تكون درجة حرارة أجار حوالي 45 درجة مئوية حتى لا توجد كتل ولمنع العينة من القتل بالحرارة. يجب أن يتم صب المتوسطة تحت الظروف اللاهوائية.
    6. عند تصلب الآجار ، احتضان أطباق بتري لمدة 24 ساعة عند 39 درجة مئوية في وضع مقلوب داخل محطة لاهوائية أو في حاضنة. بعد 24 ساعة من الحضانة ، تظهر المستعمرات البكتيرية كنقاط صغيرة متميزة مدمجة في الوسائط.
      ملاحظة: عند احتضان طبق بتري داخل حاضنة ، انقل الألواح إلى صندوق محكم الإغلاق قبل إخراجها من المحطة اللاهوائية.
    7. باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، اختر بعناية مستعمرة بكتيرية فردية وانقلها إلى أنابيب منفصلة من الحد الأدنى من وسط المرق.
    8. بعد نقل المستعمرات إلى أنابيب فردية ، احتضان الأنابيب الملقحة لاهوائيا عند 39 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، ستشير زيادة التعكر في الوسائط إلى نمو البكتيريا.
      ملاحظة: في كل مرة قبل نقل زجاجات الوسائط داخل المحطة اللاهوائية ، يجب تفريغها كما هو مذكور سابقا في الخطوة 2.1.7. يجب تنفيذ الخطوات 2-8 داخل المحطة اللاهوائية.

3. تحديد البكتيريا اللاهوائية

  1. استخراج الحمض النووي من الثقافات من 24 ساعة إلى 48 ساعة وقت الحضانة ، بعد بروتوكول التحلل الأنزيمي22.
  2. قم بطرد المزرعة عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
  3. اغسل الحبيبات 2x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق تعليقه في 2 مل من PBS. تجانس العينة باستخدام خلاط دوامة لمدة 10-15 ثانية. كرر خطوة الطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية بعناية.
  4. تعليق حبيبات الخلية في 0.2 مل من PBS pH 7.4 واحتضانها عند 50 درجة مئوية مع 1 U من الليزوزيم و 1 U من الطفرات المؤتلف لمدة 30 دقيقة ، تليها حضانة لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية مع 5 ميكرولتر من البروتيناز K.
  5. أضف وحدة 4 ميكرولتر من RNAseA إلى كل أنبوب واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أنابيب الطرد المركزي في 21168 × ز لمدة 1 دقيقة. استعادة الطافية وتنقيتها باستخدام الخرز المغناطيسي.
  6. قم بإجراء القياس الكمي للحمض النووي باستخدام طريقة الفلورومتري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمجموعة القياس الكمي dsDNA (المذكورة في جدول المواد).
    ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي المستخرج في -20 درجة مئوية.
  7. استخدم عينات الحمض النووي كقوالب لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات 27f و 1492r23 باتباع الشروط الموضحة في الجدول 4. لضمان نجاح تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز وفقا لطريقة الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز القياسية باستخدام 1X TAE buffer و 1٪ agarose.
  8. قم بتنقية منتج PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR التجارية للتخلص من البادئات والنيوكليوتيدات والملوثات الأخرى.
  9. أرسل منتج PCR لتسلسل Sanger إلى مزود خدمة التسلسل المناسب.
    ملاحظة: إلى جانب التسلسل ، يمكن لمقدمي الخدمة أيضا تقديم الخدمات بما في ذلك تنقية منتج PCR برسوم إضافية. يمكن تخزين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عند 4 درجات مئوية أو عند -20 درجة مئوية.
  10. بعد الحصول على نتائج التسلسل بتنسيق FASTA جنبا إلى جنب مع ملف chromatogram (عادة بتنسيق ABI أو SCF) ، قم بتحليل التسلسلات باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية. استخدم برنامج تحليل التسلسل لفتح ملف chromatogram وتصوره.
    ملاحظة: تم فحص الجودة الشاملة للكروماتوجرام بناء على قمم واضحة ومميزة دون ضوضاء مفرطة
  11. قارن بين amplicons ومحاذاة الأنواع ذات الصلة الوثيقة في قاعدة بيانات GenBank 16S الريبوسومية RNA غير الزائدة عن الحاجة من المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) باستخدام أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST)الأداة 24 وقاعدة بيانات الجينوم Refseq.
    ملاحظة: عند استخدام NCBI BLAST، انسخ تسلسل FASTA بالكامل في شريط البحث.

4. الحفاظ على الثقافات البكتيرية النقية

  1. حصاد الخلايا البكتيرية من مزرعة جيدة النمو من 24 ساعة إلى 48 ساعة إما عن طريق الطرد المركزي (3000 × غرام لمدة 10 دقائق) أو جمع الكتلة الحيوية من ثقافة محورية على طبق.
  2. تعليق المزرعة البكتيرية في محلول معقم متساوي التوتر مناسب (كلوريد الصوديوم 0.85٪) وغسله عن طريق الطرد المركزي للمحلول البكتيري عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في حجم صغير من محلول متساوي التوتر معقم (0.5 مل). لضمان إزالة أي بقايا متوسطة النمو ، كرر 1x.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 0.8 مل إلى 1 مل من وسط الاستزراع المعقم وتجانسها إما باستخدام خلاط دوامة لمدة 5-10 ثوان أو عن طريق السحب برفق.
  5. انقل 0.5 مل من معلق الخلية إلى 1 مل كريوفيال معقم والمسمى بشكل صحيح وأضف 0.5 مل من محلول الجلسرين المعقم بنسبة 50٪. قم بتجانس المبرد باستخدام خلاط دوامة ، وقم بتخزينه في رف الفريزر عند -80 درجة مئوية (الشكل 3).
    ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات قبل نقل cryovials إلى -80 °C داخل المحطة اللاهوائية.

النتائج

مراقبة الظروف اللاهوائية أثناء النقل
بسبب إضافة resazurin الصوديوم ، يشير التغيير في لون محلول النقل إلى اللون الوردي قبل نقل العينة إلى الأنبوب إلى حدوث اضطراب أو فشل في الحفاظ على الظروف اللاهوائية. ومن ثم، امتنع الأنبوب الذي يظهر تغيرا في اللون عن استخدامه أثن?...

Discussion

الغرض من هذه المنهجية هو تعزيز زراعة البكتيريا المعوية اللاهوائية من خلال تحسين جودة ظروف أخذ العينات ومعالجة العينات وصياغة الوسائط وإعدادها. يجب أن تؤخذ الظروف الفيزيائية والكيميائية للعينات (درجة الحموضة ، وتوافر الكربون ، والنيتروجين ، والعوامل المساعدة) في الاعت?...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم أي مصالح مالية أو شخصية متنافسة تتعلق بالعمل المذكور في هذا السيناريو.

Acknowledgements

يقر المؤلفون ببرنامج شراكة رحوفوت هوهنهايم و Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059 / 7-2. تم تطوير هذا المشروع كجزء من وحدة الأبحاث P-FOWL (FOR 2601).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidVWR20104.334
AgarVWR97064-332
Ammonium chlorideCarl RothP726.1
Anaerobic stationDon Whitley ScientificA35 HEPA
Butyric acidMerck8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate VWR97061-904
CentrifugeEppendorf5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)VWR1.05281.0010
CysteineVWR97061-204
DextroseVWR90000-908
Di-potassium hydrogen phosphateCarl RothP749.1
EDTACarl Roth8043.2
Legehennen/ JunghennenfutterDeutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany-
MagAttract HMW DNA KitQiagen67563
Magnesium chlorideCarl Roth2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))Westfalen Gase GmbH, Germany-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)A&A Biotechnology1017-10L
Myo-inositolCarl Roth4191.2
PBS 1XChemSolute8418.01
Potassium dihydrogen phosphateCarl Roth3904.2
Propionic acidCarl Roth6026.1
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2671
RNAse A QIAGEN Ribonuclease A (RNase A) 19101
Sodium chlorideVWR27800.291
Sodium resazurinVWR85019-296
Sodium thioglycolateSigma-Aldrich102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-FreeVWR97064-186
ThermocyclerBio-RadT100
TryptoneCarl Roth8952.1
Tween80Carl Roth9139.2
Vitamin mix (supplement)VWR968290NL
VortexStar Lab07127/92930
Yeast ExtractCarl Roth9257.05
β-D-FructoseVWR53188-23-1

References

  1. Wylensek, D., et al. A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity. Nat Comm. 11 (1), 6389 (2020).
  2. Medvecky, M., et al. Whole genome sequencing and function prediction of 133 gut anaerobes isolated from chicken caecum in pure cultures. BMC Geno. 19 (1), 561 (2018).
  3. Zenner, C., et al. Early-life immune system maturation in chickens using a synthetic community of cultured gut bacteria. mSystems. 6 (3), 1110-1128 (2021).
  4. Borda-Molina, D., et al. Effects on the ileal microbiota of phosphorus and calcium utilization, bird performance, and gender in japanese quail. Animals. 10 (5), 885 (2020).
  5. Bonnet, M., Lagier, J. C., Raoult, D., Khelaifia, S. Bacterial culture through selective and non-selective conditions: The evolution of culture media in clinical microbiology. New Micro New Infect. 34, 100622 (2020).
  6. Tanaka, T., et al. A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability. Appl Environ Microbiol. 80 (24), 7659-7666 (2014).
  7. Kawasaki, K., Kamagata, Y. Phosphate-catalyzed hydrogen peroxide formation from agar, gellan, and κ-carrageenan and recovery of microbial cultivability via catalase and pyruvate. Appl Environ Microbiol. 83 (21), e01366-e01417 (2017).
  8. Kato, S., et al. Isolation of previously uncultured slow-growing bacteria by using a simple modification in the preparation of agar media. Appl Environ Microbiol. 84 (19), e00807-e00818 (2018).
  9. Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nat Rev Microbiol. 19 (4), 225-240 (2021).
  10. Su, X. B., Ko, A. L. A., Saiardi, A. Regulations of myo-inositol homeostasis: Mechanisms, implications, and perspectives. Adv Biol Regul. 87, 2212-4926 (2023).
  11. Monastra, G., Dinicola, S., Unfer, V. . Physiological and pathophysiological roles of inositols in A clinical guide to inositols. , (2023).
  12. Kanehisa, M. Toward understanding the origin and evolution of cellular organisms. Prot Sci. 28 (11), 1947-1951 (2019).
  13. Lee, S. A., Nagalakshmi, D., Raju, M. V., Rao, S. V. R., Bedford, M. R. Effect of phytase superdosing, myo-inositol and available phosphorus concentrations on performance and bone mineralisation in broilers. Animal Nutri. 3 (3), 247-251 (2017).
  14. Farhadi, D., Karimi, A., Sadeghi, G., Rostamzadeh, J., Bedford, M. Effects of a high dose of microbial phytase and myo-inositol supplementation on growth performance, tibia mineralization, nutrient digestibility, litter moisture content, and foot problems in broiler chickens fed phosphorus-deficient diets. Poultry Sci. 96 (10), 3664-3675 (2017).
  15. Weber, M., Fuchs, T. M. Metabolism in the niche: A large-scale genome-based survey reveals inositol utilization to be widespread among soil, commensal, and pathogenic bacteria. Microbio Spect. 10 (4), e02013-e02022 (2022).
  16. Kawsar, H. I., Ohtani, K., Okumura, K., Hayashi, H., Shimizu, T. Organization and transcriptional regulation of myo-inositol operon in Clostridium perfringens. FEMS Microbiol Lett. 235 (2), 289-295 (2004).
  17. Hellinckx, J., Heermann, R., Felsl, A., Fuchs, T. M. High binding affinity of repressor IolR avoids costs of untimely induction of myo-inositol utilization by Salmonella Typhimurium. Sci Rep. 7 (1), 44362 (2017).
  18. Yebra, M. J., et al. Identification of a gene cluster enabling Lactobacillus casei BL23 to utilize myo-inositol. Appl Environ Microbiol. 73 (12), 3850-3858 (2007).
  19. Zhang, W. Y., et al. Comparative analysis of iol clusters in Lactobacillus casei strains. World J Microbiol Biotechnol. 26, 1949-1955 (2010).
  20. Labeda, D. P. . Bergey's manual of systematic bacteriology. , (2001).
  21. Peterson, L. R. Effect of media on transport and recovery of anaerobic bacteria. Clin Infect Dis. 25, 134-136 (1997).
  22. Ulrich, R. L., Hughes, T. A. A rapid procedure for isolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and other Gram-positive bacteria. Lett Appl Microbiol. 32 (1), 52-56 (2008).
  23. Relman, D. Universal bacterial 16s rRNA amplification and sequencing. Diag Mol Microbiol. , 489-495 (1993).
  24. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs. Nuc Acid Res. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  25. Rios-Galicia, B., et al. Novel taxonomic and functional diversity of eight bacteria from the upper digestive tract of chicken. Int J Syst Evol Microbiol. 74 (1), 006210 (2024).
  26. Lagier, J. C., et al. Microbial culturomics: Paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin Microbiol Infect. 18 (12), 1185-1193 (2012).
  27. Lagkouvardos, I., et al. The mouse intestinal bacterial collection (mibc) provides host-specific insight into cultured diversity and functional potential of the gut microbiota. Nat Microbiol. 1 (10), 1-15 (2016).
  28. Gilroy, R., et al. Extensive microbial diversity within the chicken gut microbiome revealed by metagenomics and culture. PeerJ. 9, e10941 (2021).
  29. Huang, P., et al. The chicken gut metagenome and the modulatory effects of plant-derived benzylisoquinoline alkaloids. Microbiome. 6 (1), 1-17 (2018).
  30. Zhang, Y., et al. Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads. GigaScience. 11, 116 (2022).
  31. Segura-Wang, M., Grabner, N., Koestelbauer, A., Klose, V., Ghanbari, M. Genome-resolved metagenomics of the chicken gut microbiome. Front Microbiol. 12, 726923 (2021).
  32. Borrelli, R. C., Fogliano, V., Monti, S. M., Ames, J. M. Characterization of melanoidins from a glucose-glycine model system. Euro Food Res Technol. 215, 210-215 (2002).
  33. Ferrario, C., et al. Untangling the cecal microbiota of feral chickens by culturomic and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 19 (11), 4771-4783 (2017).
  34. Crhanova, M., et al. Systematic culturomics shows that half of chicken caecal microbiota members can be grown in vitro except for two lineages of clostridiales and a single lineage of bacteroidetes. Microorganisms. 7 (11), 496 (2019).
  35. Rubio, L., et al. Lactobacilli counts in crop, ileum and caecum of growing broiler chickens fed on practical diets containing whole or dehulled sweet lupin (lupinus angustifolius) seed meal. British Poult Sci. 39 (3), 354-359 (1998).
  36. Bjerrum, L., et al. Microbial community composition of the ileum and cecum of broiler chickens as revealed by molecular and culture-based techniques. Poult Sci. 85 (7), 1151-1164 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved