استراتيجيات لتعزيز زراعة البكتيريا اللاهوائية من الجهاز الهضمي للدجاج

Summary

يقدم البروتوكول منهجيتين لتحسين عزل البكتيريا المعوية اللاهوائية. يركز الأول على عزل مجموعة متنوعة من البكتيريا باستخدام وسائط استزراع مختلفة. ويركز الثاني على خطوات زراعة مجموعة ميكروبية معينة ، وربما استيعاب ميو-إينوزيتول ، لفهم أهميتها البيئية بشكل كامل.

Abstract

الجهاز الهضمي (GIT) للدجاج هو نظام بيئي معقد يؤوي تريليونات من الميكروبات التي تلعب دورا محوريا في فسيولوجيا المضيف ، والهضم ، وامتصاص العناصر الغذائية ، ونضج الجهاز المناعي ، ومنع تسرب مسببات الأمراض. من أجل صحة وإنتاجيته المثلى ، من الضروري توصيف هذه الكائنات الحية الدقيقة وفهم دورها. في حين أن الجهاز الهضمي للدواجن يحتوي على خزان من الكائنات الحية الدقيقة مع تطبيقات بروبيوتيك محتملة ، فإن معظم التنوع لا يزال غير مستكشف. لتعزيز فهمنا للتنوع الميكروبي غير المزروع ، هناك حاجة إلى جهود متضافرة لجلب هذه الكائنات الحية الدقيقة إلى الثقافة. ينتج عن عزل وزراعة الكائنات الحية الدقيقة المستعمرة للجهاز الهضمي مواد قابلة للتكاثر ، بما في ذلك الخلايا والحمض النووي والمستقلبات ، مما يوفر رؤى جديدة لعمليات التمثيل الغذائي في البيئة. بدون زراعة ، يظل دور هذه الكائنات في بيئاتها الطبيعية غير واضح ويقتصر على المستوى الوصفي. هدفنا هو تنفيذ استراتيجيات الزراعة التي تهدف إلى تحسين عزل مجموعة متنوعة من الميكروبات اللاهوائية من الجهاز الهضمي للدجاج ، والاستفادة من المعرفة متعددة التخصصات من فسيولوجيا ، وتغذية ، وعلم الميتاجينوميات ، والكيمياء الحيوية للأعلاف ، واستراتيجيات الزراعة الحديثة. بالإضافة إلى ذلك ، نهدف إلى تنفيذ استخدام الممارسات المناسبة لأخذ العينات والنقل وإعداد الوسائط ، والتي من المعروف أنها تؤثر على نجاح العزلة. يجب أن تضمن المنهجيات المناسبة بيئة متسقة خالية من الأكسجين ، والظروف الجوية المثلى ، ودرجة حرارة حضانة المضيف المناسبة ، وتوفير متطلبات غذائية محددة تتماشى مع احتياجاتهم المميزة. باتباع هذه المنهجيات ، لن تسفر الزراعة عن نتائج قابلة للتكرار للعزل فحسب ، بل ستسهل أيضا إجراءات العزل ، وبالتالي تعزيز فهم شامل للنظام البيئي الميكروبي المعقد داخل الجهاز الهضمي للدجاج.

Introduction

استكملت عودة الزراعة في دراسة الكائنات الحية الدقيقة رؤى من الدراسات الميتاجينومية من خلال توفير المواد لاختبار الفرضيات الأيضية التي تم وصفها وتحديدها جزئيا في السابق. توفر زراعة البكتيريا المعوية مادة للحفاظ على الأبحاث المستقبلية حول التفاعلات بين الميكروبات والمضيف ، وتسهيل دراسات الاستعمار المستهدفة ، وتحسين دراسات التفاعل الجزيئي^1،2،3. أدت المعرفة المكتسبة حول الكائنات الحية الدقيقة المعدية المعوية إلى تحسين تغذية ورفاهيته من خلال التأثير على تركيبات النظام الغذائي وتعزيز توافر المغذيات⁴. وقد ساهم هذا الفهم في تح....

Protocol

ينقسم البروتوكول إلى أربعة أجزاء: أخذ العينات ، والعزل البكتيري ، وتحديد ، والحفاظ على الكائنات الحية الدقيقة التي تم الحصول عليها. تم إصدار الأذونات المعتمدة بشأن استخدام من قبل اللجنة الأخلاقية في Regierungspräsidium Tübingen ، ألمانيا مع أرقام الموافقة HOH50 / 17 TE و HOH67-21TE.

1. الحصول على عينات لزراعة البكتيريا اللاهوائية

1. صيانة
   1. الحفاظ على على نظام غذائي تجاري قائم على الذرة (Legehennen / Junghennenfutter ؛ انظر جدول المواد) والمنزل في المحطة التجريبية لجامعة هوهنهايم.
2. إعداد حل النقل
   1. في 1-2 أيام قبل جمع العينة، ت....

النتائج

مراقبة الظروف اللاهوائية أثناء النقل
بسبب إضافة resazurin الصوديوم ، يشير التغيير في لون محلول النقل إلى اللون الوردي قبل نقل العينة إلى الأنبوب إلى حدوث اضطراب أو فشل في الحفاظ على الظروف اللاهوائية. ومن ثم، امتنع الأنبوب الذي يظهر تغيرا في اللون عن استخدامه أثن?.......

Discussion

الغرض من هذه المنهجية هو تعزيز زراعة البكتيريا المعوية اللاهوائية من خلال تحسين جودة ظروف أخذ العينات ومعالجة العينات وصياغة الوسائط وإعدادها. يجب أن تؤخذ الظروف الفيزيائية والكيميائية للعينات (درجة الحموضة ، وتوافر الكربون ، والنيتروجين ، والعوامل المساعدة) في الاعت?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1