鶏の消化管からの嫌気性細菌の培養を強化するための戦略

要約

このプロトコルは、嫌気性腸内細菌の分離を改善するための2つの方法論を提示します。1つ目は、さまざまな培地を使用してさまざまな細菌を分離することに焦点を当てています。2つ目は、特定の微生物群、おそらくミオイノシトールを同化して、その生態学的意義を完全に理解するための培養ステップに焦点を当てています。

要約

ニワトリの消化管(GIT)は、宿主の生理機能、消化、栄養素の吸収、免疫系の成熟、病原体の侵入防止に極めて重要な役割を果たす数兆個の微生物が生息する複雑な生態系です。動物の健康と生産性を最適化するためには、これらの微生物の特性を評価し、その役割を理解することが不可欠です。家禽のGITは、プロバイオティクスへの応用が可能な微生物の貯蔵庫を保持していますが、その多様性のほとんどは未踏のままです。未培養微生物の多様性についての理解を深めるためには、これらの微生物を培養するための協調的な取り組みが必要です。GITコロニー形成微生物の単離と培養により、細胞、DNA、代謝物などの再現性のある物質が得られ、環境中の代謝プロセスに関する新たな知見が得られます。栽培しなければ、これらの生物の自然環境における役割は不明瞭なままであり、記述レベルに限定されています。私たちの目的は、動物生理学、動物栄養学、メタゲノミクス、飼料生化学、および現代の栽培戦略からの学際的な知識を活用して、鶏のGITからの多様な嫌気性微生物の分離を改善することを目的とした培養戦略を実装することです。さらに、分離の成功に影響を与えることが知られているサンプリング、輸送、および培地調製のための適切な慣行の使用を実装することを目指しています。適切な方法論は、一貫した無酸素環境、最適な大気条件、適切な宿主のインキュベーション温度、および彼らの独特のニーズに沿った特定の栄養要件の提供を確保する必要があります。これらの方法論に従うことにより、培養は単離のための再現性のある結果をもたらすだけでなく、単離手順も容易にし、鶏のGIT内の複雑な微生物生態系の包括的な理解を促進します。

概要

微生物の研究における培養の復活は、メタゲノム研究からの洞察を補完し、以前は部分的にしか記述および定量化されていなかった代謝仮説を検証するための材料を提供しました。腸内細菌の培養は、微生物と宿主の相互作用に関する将来の研究を維持し、標的コロニー形成研究を促進し、分子相互作用研究を改善するための材料を提供します^1,2,3。消化管微生物について得られた知識は、食事の処方に影響を与え、栄養素の利用可能性を高めることにより、動物の栄養と福祉を改善しました⁴。この理解は、プレバイオティクスとプロバイオティクスの相互作用を利用する際のパフォーマンスの向上に貢献しています。しかし、生化学的および物理化学的条件がどのように相互作用し、微生物プロファイルとその構造に影響を与えるかを完全に理解するには、詳細な研究が必要です。この目標を達成するためには、培養が依然として不可欠であり、胃腸環境内の微生物群集の複雑なダイナミクスを掘り下げるための重要なツールとして機能します。

ヒトの腸に関連する微生物に関する広範な研究や臨床培養研究⁵とは対照的に、家畜からの....

プロトコル

プロトコールは、サンプリング、細菌の分離、得られた微生物の同定、および保存の4つの部分に分かれています。動物の使用に関する承認された許可は、ドイツのテュービンゲン王立協会の倫理委員会によって、承認番号HOH50/17TEおよびHOH67-21TEで発行されました。

1. 嫌気性細菌の培養用サンプルの採取

1. 動物のメンテナンス
   1. 動物を 商業 的なトウモロコシベースの食事(Legehennen/ Junghennenfutter; 資料表を参照)で維持し、ホーエンハイム大学の実験ステーションに住まわせます。
2. 輸送液の調製
   1. サンプル収集の1〜2日前に、1.00 g / Lチオグリコール酸ナトリウム、0.10 g / L塩化カルシウム二水和物(CaCl_{2.2H 2}O)、および0.5%のシステイン²¹ および0.1%のレサズリンナトリウム溶液を含む輸送溶液を準備します。
   2. 培地のpHを25°Cで6.0±0.2に調整し、121°Cで15psiの圧力で15分間オートクレーブします。
   3. 培地が約50°Cに冷却された後、培地....

ディスカッション

この方法論の目的は、サンプリング条件、サンプル処理、培地の製剤と調製の品質を向上させることにより、嫌気性腸内細菌の培養を強化することです。培地を調製する際には、サンプルの物理化学的条件(pH、炭素、窒素、補因子の利用可能性)を考慮する必要があります。ブタ、ヒト、またはマウスから得られた細菌培養コレクション^1,26,27

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1