鶏の消化管からの嫌気性細菌の培養を強化するための戦略

要約

このプロトコルは、嫌気性腸内細菌の分離を改善するための2つの方法論を提示します。1つ目は、さまざまな培地を使用してさまざまな細菌を分離することに焦点を当てています。2つ目は、特定の微生物群、おそらくミオイノシトールを同化して、その生態学的意義を完全に理解するための培養ステップに焦点を当てています。

要約

ニワトリの消化管(GIT)は、宿主の生理機能、消化、栄養素の吸収、免疫系の成熟、病原体の侵入防止に極めて重要な役割を果たす数兆個の微生物が生息する複雑な生態系です。動物の健康と生産性を最適化するためには、これらの微生物の特性を評価し、その役割を理解することが不可欠です。家禽のGITは、プロバイオティクスへの応用が可能な微生物の貯蔵庫を保持していますが、その多様性のほとんどは未踏のままです。未培養微生物の多様性についての理解を深めるためには、これらの微生物を培養するための協調的な取り組みが必要です。GITコロニー形成微生物の単離と培養により、細胞、DNA、代謝物などの再現性のある物質が得られ、環境中の代謝プロセスに関する新たな知見が得られます。栽培しなければ、これらの生物の自然環境における役割は不明瞭なままであり、記述レベルに限定されています。私たちの目的は、動物生理学、動物栄養学、メタゲノミクス、飼料生化学、および現代の栽培戦略からの学際的な知識を活用して、鶏のGITからの多様な嫌気性微生物の分離を改善することを目的とした培養戦略を実装することです。さらに、分離の成功に影響を与えることが知られているサンプリング、輸送、および培地調製のための適切な慣行の使用を実装することを目指しています。適切な方法論は、一貫した無酸素環境、最適な大気条件、適切な宿主のインキュベーション温度、および彼らの独特のニーズに沿った特定の栄養要件の提供を確保する必要があります。これらの方法論に従うことにより、培養は単離のための再現性のある結果をもたらすだけでなく、単離手順も容易にし、鶏のGIT内の複雑な微生物生態系の包括的な理解を促進します。

概要

微生物の研究における培養の復活は、メタゲノム研究からの洞察を補完し、以前は部分的にしか記述および定量化されていなかった代謝仮説を検証するための材料を提供しました。腸内細菌の培養は、微生物と宿主の相互作用に関する将来の研究を維持し、標的コロニー形成研究を促進し、分子相互作用研究を改善するための材料を提供します^1,2,3。消化管微生物について得られた知識は、食事の処方に影響を与え、栄養素の利用可能性を高めることにより、動物の栄養と福祉を改善しました⁴。この理解は、プレバイオティクスとプロバイオティクスの相互作用を利用する際のパフォーマンスの向上に貢献しています。しかし、生化学的および物理化学的条件がどのように相互作用し、微生物プロファイルとその構造に影響を与えるかを完全に理解するには、詳細な研究が必要です。この目標を達成するためには、培養が依然として不可欠であり、胃腸環境内の微生物群集の複雑なダイナミクスを掘り下げるための重要なツールとして機能します。

ヒトの腸に関連する微生物に関する広範な研究や臨床培養研究⁵とは対照的に、家畜からの微生物に関する報告は、主に限られた範囲の培地を単離に利用しており、分離株の多様性を制約する可能性があります^2,3。さらに、田中らと川崎らによって解明された培地の処方の改善や、リン酸塩と寒天との相互作用に関する研究は、腸内細菌^叢研究6,7,8,9ではまだ実施されていません。

準必須物質と考えられているミオイノシトール(MI)は、多様な代謝、生理学的、および調節プロセスにおいて極めて重要な役割を果たすと報告されています^10,11。これらには、骨の石灰化、乳房筋の発達、細胞シグナル伝達、排卵と生殖能力の促進、ニューロンシグナル伝達の調節、および家禽のグルコース恒常性とインスリン調節の調節因子としての作用への関与が含まれます^10,11。MIは、解糖/糖新生プロセス、クエン酸回路、ペントースリン酸経路などの重要な生化学的プロセス内での相互変換を通じて、前駆体としての役割を果たします。さらに、グリセロリン脂質代謝にさらに関与するホスファチジルイノシトール(PI)の前駆体としても機能します¹²。心筋梗塞の代謝が骨の安定性と動物の能力の変化につながることを報告した研究はほとんどありません。これには、飼料の転換率と体重増加の増加が含まれ、動物内での吸収と利用後の影響を示しています^13,14。しかし、心筋梗塞代謝の経路とその家禽代謝への影響は、依然としてとらえどころのない^{ままです15}。さらに、心筋梗塞の利用、特に回腸16,17,18,19などの代謝活性の高い領域における細菌の潜在的な役割を提案する研究はほとんどありません。

動物のGITから細菌を培養する取り組みは、ゲノムデータベースの強化と研究の拡大、ゲノムに基づく仮説の検証、およびこれらの資源の生態学的重要性の理解を目的としています²⁰。この研究の目的は、ミオイノシトールを同化および代謝する関心のある生態学的グループの分離の多様性と標的分離を強化するために、鶏のGITからの細菌培養の戦略を改善することです。

プロトコル

プロトコールは、サンプリング、細菌の分離、得られた微生物の同定、および保存の4つの部分に分かれています。動物の使用に関する承認された許可は、ドイツのテュービンゲン王立協会の倫理委員会によって、承認番号HOH50/17TEおよびHOH67-21TEで発行されました。

1. 嫌気性細菌の培養用サンプルの採取

1. 動物のメンテナンス
   1. 動物を 商業 的なトウモロコシベースの食事(Legehennen/ Junghennenfutter; 資料表を参照)で維持し、ホーエンハイム大学の実験ステーションに住まわせます。
2. 輸送液の調製
   1. サンプル収集の1〜2日前に、1.00 g / Lチオグリコール酸ナトリウム、0.10 g / L塩化カルシウム二水和物(CaCl_{2.2H 2}O)、および0.5%のシステイン²¹ および0.1%のレサズリンナトリウム溶液を含む輸送溶液を準備します。
   2. 培地のpHを25°Cで6.0±0.2に調整し、121°Cで15psiの圧力で15分間オートクレーブします。
   3. 培地が約50°Cに冷却された後、培地ボトルのキャップをボアとゴム栓付きの滅菌スクリューキャップに交換します。滅菌シリンジの針2本をラバーストッパーの異なる位置に挿入し、疎水性シリンジフィルター(0.22μm)を針の1本に貼り付けます。
      注意: キャップの交換と針とフィルターの挿入は、層流(LAF)内で行う必要があります。
   4. 100%窒素(N₂)チューブをシリンジフィルターに取り付け、N₂ ガスをボトルに1psiで10分間散布します。
   5. 続いて、培地ボトルと滅菌Hungateチューブを嫌気性ステーションに移し、輸送培地をHungateチューブに無菌的に移します。Hungateチューブを上部まで完全に満たし、内部に空気が入らないようにします。
3. 屠殺とサンプル収集
   1. 屠殺プロセス中は、手袋、マスク、プラスチック製の実験用エプロン、および滅菌手術器具を使用して、汚染を避けるために無菌状態を維持します。さらに、エタノールとティッシュを使用して作業台を適切に消毒し、無菌環境を維持します。
   2. 実験ステーションでは、10、50週齢のLohmann産卵鶏に、35%_N2、35%CO₂、および30%_O2 からなるボトル入りガス混合物を使用して麻酔をかけ、すぐに首を切ってください。
      注:麻酔と犠牲は、動物福祉と科学的手順に精通した実験動物技術者が行う必要があります。これにより、犠牲化の手続きが倫理基準、法的規制、および安全ガイドラインに準拠していることが保証されます。
   3. GIT切片の解剖を進める前に、滅菌ケリー止血剤(ケリークランプとも呼ばれます。 図1)。
      注:動物の解剖は、獣医師または鶏の解剖学に精通した十分な訓練を受けた人が行う必要があります。
   4. 各セクションを輸送媒体で満たされた別々のハンゲートチューブに移し、蓋を適切に閉じます。必要に応じて、チューブに輸送媒体を追加して、残っている空気を置換します。
      注:セクションの移動は重要なステップであり、酸素への長時間の曝露を防ぐために、セクションの遅延や開放を最小限に抑えることが不可欠です
4. サンプルの輸送
   1. Hungateチューブの輸送は注意して取り扱い、破損のリスクを防ぐために発泡スチロールの箱の中に入れてください。外気温が15°C未満の場合は、温かいパックを使用してサンプルの温度を維持してください。輸送時間が4時間を超えないようにしてください。
   2. チューブを嫌気性ステーション内で慎重に移し、さらなる処理を行います。

2. 嫌気性細菌の分離

1. 培地調製
   注:概説された方法は、培地調製に関するさまざまな考慮事項を示しています。 表1 は、微生物の多様な分離のために溶液がどのように分割されるかの例を示しています。
   1. 使用する培地製剤の成分を、炭素源、窒素源、寒天、ミネラル源の4つの溶液グループに分けます。Brain-Heart Infusion(BHI)のようなリッチメディアでは、分離が常に可能であるとは限りません( 表1の培地2の例を参照)。このような場合は、寒天または追加の溶液を別々に調製し、オートクレーブするようにしてください。
   2. 必要な培地の最終容量の1/^4th で炭水化物溶液を調製します。たとえば、250 mLで、総容量1 Lの培地です。 表1の培地1の例に従って、2 gのデキストロースと0.5 gのデンプンを250 mLの蒸留水に溶解します。
   3. 必要な培地の最終^容量の1 /4でタンパク質溶液を調製します(例:250 mLで、総容量1 Lの培地)。 表1の培地1の例に従って、10 gのペプトンを250 mLの蒸留水に溶解します。
   4. 培地の最終容量の45%〜48%、例えば、総容量1 Lの培地に対して450〜480 mLで寒天溶液を調製します。 表1のメディウ1の例に倣い、15gの寒天を450〜480mLの蒸留水に溶解します。
   5. 最終培地量が1 Lの場合、左の20〜50 mLの培地にミネラル溶液を調製します。 表1の培地1の例に従って、0.5 gのK₂HPO₄ を20〜50 mLの蒸留水に溶解します。
   6. タンパク質溶液、寒天溶液、およびミネラル溶液を121°Cで15分間、21psiの圧力でオートクレーブします。炭水化物溶液を110°Cで5psiで30分間オートクレーブします。
   7. すべての溶液が無菌になったら、50°Cまで冷却し、無菌条件下で、穴とゴム栓のあるキャップが付いた適切なオートクレーブ処理されたガラス瓶に混合します。この後、手順1.2.3と1.2.4に従います。
      注:溶液の混合はLAF内で行う必要があります。
   8. 培地を混合して脱気したら、嫌気性ステーション内の滅菌ペトリ皿またはチューブに注ぎます。
2. 嫌気性細菌の分離
   注:次の方法論は、鶏の消化管に生息する広範囲の嫌気性細菌を培養するための分離戦略を説明しています。
   1. サンプルを、商業供給業者から提供された80%_N2 (品質レベル5.0)、15%CO₂ (品質レベル3.0)、および5%_H2 (品質レベル5.0)で構成されるボトル入りガス混合物を含む嫌気性ステーションに移します( 材料の表を参照)。
   2. 嫌気性ステーション内で、オートクレーブ滅菌鉗子を使用して、ハンゲートチューブから滅菌ペトリ皿に切片を移します。
   3. 滅菌ハサミを使用して切片を慎重に切り開き、滅菌ヘラを使用して腸側から約1gの消化物含有量を抽出します。
      注:1 gの消化物含有量を摂取した後、残りの消化物をスクラップして、標的分離のためにそれぞれの輸送培地チューブに移します。
   4. 滅菌生理液(0.85% NaCl)を用いて10倍段階希釈を行います。
   5. 希釈液10-4から10-7までのサンプル0.1mLを滅菌済みで適切に標識されたペトリ皿培地プレートに分注し、滅菌済みのDrigalskiスペテルで広げます。
   6. プレートを嫌気性ステーション内で39°Cで24〜48時間インキュベートします。
      注:インキュベーター内でインキュベートする場合は、ペトリ皿を嫌気性ステーションから取り出す前に、ペトリ皿を密閉ボックスに移してください。
3. 特定の細菌群の標的分離。
   注:次の方法論は、心筋梗塞を吸収する可能性のある嫌気性細菌の分離戦略を説明しています。
   1. 濃縮培地、最小寒天培地、および最小ブロス培地の調製については、ステップ2.1で概説したガイドラインを遵守し、 表2 および 表3で指定された組成に従ってください。オートクレーブ処理後、0.2 mL/Lのフィルター滅菌ビタミン混合物(組成物に概説されているとおり)を最小限の寒天培地と最小限のブロス培地に加えます。
   2. ボルテックスミキサーを使用して初期サンプルを10〜15秒間均質化します。その後、均質化されたサンプルを濃縮媒体の入ったチューブに5%の割合で移します(例えば、濃縮媒体の容量が10 mLの場合、0.5 mLの均質化されたサンプルを接種します)。新たに接種したサンプルを、嫌気性ステーション内で39°Cで24時間インキュベートします。
   3. インキュベーション後、ボルテックスミキサーを使用して10〜15秒間、またはピペッティングして、濃縮チューブを完全に混合します。その後、混合サンプルを滅菌した最小限のブロス培地に5%の割合で移し、39°Cで24時間インキュベートします。
   4. サンプルを滅菌生理食塩水(0.85%NaCl)で、1:10の希釈から始めて1:1000の希釈まで連続希釈します。各希釈後、ボルテックスミキサーを使用して10〜15秒間、またはピペッティングにより、サンプルを室温で完全に均質化します。
   5. 滅菌および嫌気性条件下で、希釈したサンプル1 mLをペトリ皿に移します。約15〜20mLの溶かした最小限の寒天培地をペトリ皿に注ぎ、水平に静かに渦巻いて均一に混合します。
      注:寒天の温度は、しこりが存在せず、サンプルが熱によって殺されるのを防ぐために、約45°Cにする必要があります。中程度の注ぎは、嫌気性条件下で行う必要があります。
   6. 寒天が固まったら、ペトリ皿を逆さにした位置で39°Cで24時間インキュベートします。24時間のインキュベーション後、細菌のコロニーは培地に埋め込まれた明確な小さな点として現れます。
      注:インキュベーター内でペトリ皿をインキュベートする場合は、プレートを気密ボックスに移してから、嫌気性ステーションから取り出してください。
   7. 滅菌接種ループを使用して、個々の細菌コロニーを慎重に選択し、最小限のブロス培地の別々のチューブに移します。
   8. コロニーを個々のチューブに移した後、接種したチューブを39°Cで24時間嫌気的にインキュベートします。インキュベーション後、培地の濁度が増加すると、細菌の増殖を示します。
      注:嫌気性ステーション内でメディアボトルを移すたびに、ステップ2.1.7で前述したように、メディアボトルを脱気する必要があります。ステップ2〜8は、嫌気性ステーション内で実行する必要があります。

3. 嫌気性細菌の同定

1. 酵素溶解プロトコル²²に従って、24時間から48時間のインキュベーション時間の培養物からDNAを抽出します。
2. 培養物を3000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄します。
3. ペレットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、2mLのPBSに懸濁します。ボルテックスミキサーを使用してサンプルを10〜15秒間均質化します。3000 x g で4°Cで10分間遠心分離ステップを繰り返し、上清を慎重に廃棄します。
4. 細胞ペレットを0.2 mLのPBS pH 7.4に懸濁し、1 Uのリゾチームおよび1 Uの組換えムタノリジンと共に50°Cで30分間インキュベートした後、56°Cで50分間インキュベートし、5 μLのプロテイナーゼKをインキュベートします。
5. 各チューブに4 μLユニットのRNAseAを加え、室温で10分間インキュベートします。チューブを21168 x g で1分間遠心分離します。上清を回収し、磁気ビーズを使用して精製します。
6. dsDNA定量キットの製造元の指示に従って、蛍光法でDNAの定量を行います( 材料表に記載)。
   注:抽出したDNAは-20°Cで保存できます。
7. 表4に示す条件に従って、プライマー27fおよび1492r²³を使用してPCR増幅のためのテンプレートとしてDNAサンプルを使用する。PCR反応が成功したことを確認するために、1X TAEバッファーと1%アガロースを使用した標準的なアガロースゲル電気泳動法に従って、アガロースゲル電気泳動を実施します。
8. 市販のPCR精製キットを使用してPCR産物を精製し、プライマー、ヌクレオチド、その他の汚染物質を取り除きます。
9. サンガーシーケンシング用のPCR産物を適切なシーケンシングサービスプロバイダーに送付してください。
   注:シーケンシングに加えて、サービスプロバイダーは追加料金でPCR産物の精製を含むサービスも提供できます。PCR産物は、4°Cまたは-20°Cで保存できます。
10. シーケンシング結果をFASTA形式とクロマトグラムファイル(通常はABIまたはSCF形式)で取得した後、バイオインフォマティクスツールを使用して配列を解析します。シーケンス解析ソフトウェアを使用して、クロマトグラムファイルを開き、可視化します。
    注:クロマトグラムの全体的な品質は、過度のノイズのない明瞭で明瞭なピークに基づいてチェックされました
11. National Center for Biotechnology Information(NCBI)のNon-redundant GenBank 16S ribosomal RNAデータベースで、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)ツール²⁴ とRefseqゲノムデータベースを使用して、アンプリコンを比較し、近縁種にアラインメントします。
    注:NCBI BLASTを使用する場合は、検索バーでFASTAシーケンス全体をコピーしてください。

4. 純粋な細菌培養物の保存

1. 24時間から48時間のよく成長した培養物から、遠心分離(3000 x g で10分間)またはプレート上の無酸素培養物からのバイオマス収集のいずれかによって細菌細胞を回収します。
2. 細菌培養物を適切な等張性滅菌溶液(NaCl 0.85%)に懸濁し、細菌溶液を3000 x g で4°Cで10分間遠心分離して洗浄します。
3. 上清を捨て、細菌ペレットを少量の滅菌等張溶液(0.5 mL)に再懸濁します。.増殖培地の残留物を確実に除去するために、1回繰り返します。
4. ペレットを0.8 mL〜1 mLの滅菌培地濃縮物に再懸濁し、ボルテックスミキサーで5〜10秒間、またはピペッティングして均質化します。
5. 0.5 mLの細胞懸濁液を滅菌済みで適切に標識された1 mLクライオバイアルに移し、0.5 mLのオートクレーブ処理した50%グリセロール溶液を加えます。ボルテックスミキサーを使用してクライオバイアルを均質化し、-80°Cのフリーザーラックに保管します(図3)。
   注:クライオバイアルを-80°Cに移す前のすべてのステップは、嫌気性ステーション内で行う必要があります。

結果

輸送中の嫌気性状態のモニタリング
ナトリウムレサズリンの添加により、サンプルをチューブに移す前に輸送溶液の色がピンク色に変化することは、嫌気性条件の維持の中断または失敗を示しています。そのため、図 2に示すように、色の変化を示すチューブは輸送中に使用せず、色の変化がないチューブのみを使用しました。<...

ディスカッション

この方法論の目的は、サンプリング条件、サンプル処理、培地の製剤と調製の品質を向上させることにより、嫌気性腸内細菌の培養を強化することです。培地を調製する際には、サンプルの物理化学的条件(pH、炭素、窒素、補因子の利用可能性)を考慮する必要があります。ブタ、ヒト、またはマウスから得られた細菌培養コレクション^1,26,27

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1