닭의 위장관에서 혐기성 박테리아의 배양을 강화하기 위한 전략

요약

이 프로토콜은 혐기성 장내 세균의 분리를 개선하기 위한 두 가지 방법론을 제시합니다. 첫 번째는 다양한 배양 배지를 사용하여 다양한 범위의 박테리아를 분리하는 데 중점을 둡니다. 두 번째는 생태학적 중요성을 완전히 이해하기 위해 미오이노시톨을 동화시킬 수 있는 특정 미생물 그룹의 배양 단계에 초점을 맞춥니다.

초록

닭의 위장관(GIT)은 숙주의 생리, 소화, 영양소 흡수, 면역 체계 성숙 및 병원체 침입 방지에 중추적인 역할을 하는 수조 개의 미생물이 서식하는 복잡한 생태계입니다. 최적의 동물 건강과 생산성을 위해서는 이러한 미생물의 특성을 분석하고 그 역할을 이해하는 것이 필수적입니다. 가금류의 GIT는 프로바이오틱스 응용 분야가 될 수 있는 미생물의 보고를 보유하고 있지만, 대부분의 다양성은 아직 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 배양되지 않은 미생물 다양성에 대한 이해를 높이려면 이러한 미생물을 배양하기 위한 공동의 노력이 필요합니다. GIT 집락 미생물의 분리 및 배양은 세포, DNA 및 대사 산물을 포함한 재현 가능한 물질을 생성하여 환경의 대사 과정에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 배양하지 않으면 자연 환경에서 이러한 유기체의 역할은 불분명하고 설명 수준에 국한됩니다. 우리의 목표는 동물 생리학, 동물 영양학, 균유전체학, 사료 생화학 및 현대 재배 전략의 다학제 지식을 활용하여 닭의 GIT에서 다양한 범위의 혐기성 미생물의 분리를 개선하는 것을 목표로 하는 재배 전략을 구현하는 것입니다. 또한, 우리는 격리 성공에 영향을 미치는 것으로 알려진 샘플링, 운송 및 미디어 준비를 위한 적절한 관행의 사용을 구현하는 것을 목표로 합니다. 적절한 방법론은 일관된 무산소 환경, 최적의 대기 조건, 적절한 숙주 배양 온도 및 고유한 요구 사항에 부합하는 특정 영양 요구 사항에 대한 제공을 보장해야 합니다. 이러한 방법론을 따름으로써 배양은 분리에 대한 재현 가능한 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 분리 절차를 용이하게 하여 닭의 GIT 내 복잡한 미생물 생태계에 대한 포괄적인 이해를 촉진할 수 있습니다.

서문

미생물 연구에서 배양의 부활은 이전에는 부분적으로만 설명되고 정량화되었던 대사 가설을 테스트하기 위한 자료를 제공함으로써 메타게놈 연구의 통찰력을 보완했습니다. 장내 세균의 배양은 미생물-숙주 상호작용에 대한 향후 연구를 지속하고, 표적 집락화 연구를 촉진하며, 분자 상호작용 연구를 개선할 수 있는 자료를 제공한다 ^1,2,3. 위장 미생물에 대해 얻은 지식은 식단 공식에 영향을 미치고 영양소 가용성을 향상시킴으로써 동물의 영양과 복지를 개선했습니다⁴. 이러한 이해는 프리바이오틱스와 프로바이오틱 상호작용을 활용하는 성능 향상에 기여했습니다. 그러나 생화학적 및 물리화학적 조건이 어떻게 상호 작용하고 미생물 프로필과 그 구조에 영향을 미치는지에 대한 완전한 이해를 얻으려면 심층적인 연구가 필요합니다. 이 목표를 달성하기 위해서는 배양이 필수적이며, 위장 환경 내 미생물 군집의 복잡한 역학을 탐구하는 데 중요한 도구 역할을 합니다.

인간의 장과 관련된 미생물에 대한 광범위한 연구 ....

프로토콜

프로토콜은 샘플링, 박테리아 분리, 식별 및 얻은 미생물의 보존의 네 부분으로 나뉩니다. 독일 튀빙겐 레지에룽스프레시디움(Regierungspräsidium Tübingen)의 윤리 위원회에서 동물 사용에 대한 승인 허가를 발급했으며, 승인 번호는 HOH50/17 TE 및 HOH67-21TE입니다.

1. 혐기성 박테리아 배양을 위한 샘플 획득

1. 동물의 유지 관리
   1. 임시 상업적인 옥수수 기반 식단 (Legehennen / Junghennenfutter; 재료 표 참조)으로 동물을 유지하고 Hohenheim 대학의 실험 기지에서 사육합니다.
2. 수송 용액의 준비
   1. 검체 채취 1-2일 전에 1.00g/L 티오글리콜산나트륨, 0.10g/L 염화칼슘 이수화물(CaCl_{2.2H 2O}), 시스테인²¹ 0.5% 및 0.1% 레사주린 나트륨 용액을 함유한 수송 용액을 준비합니다.
   2. 매체의 pH를 25°C에서 6.0 ± 0.2로 조정하고 121°C에서 15....

토론

이 방법론의 목적은 샘플링 조건, 샘플 처리, 배지 배합 및 준비의 품질을 개선하여 혐기성 장내 박테리아의 배양을 향상시키는 것입니다. 배양 배지를 배합할 때 샘플의 물리화학적 조건(pH, 탄소, 질소 및 보조 인자의 가용성)을 고려해야 합니다. 돼지, 인간 또는 생쥐에서 얻은 박테리아 배양 수집과 비교했을 때^1,26,27 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1