Strategien zur Verbesserung der Kultivierung anaerober Bakterien aus dem Magen-Darm-Trakt von Hühnern

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt zwei Methoden vor, um die Isolierung von anaeroben Darmbakterien zu verbessern. Die erste konzentriert sich auf die Isolierung einer Vielzahl von Bakterien mit unterschiedlichen Nährmedien. Die zweite konzentriert sich auf die Kultivierungsschritte einer bestimmten mikrobiellen Gruppe, die möglicherweise Myo-Inositol assimiliert, um ihre ökologische Bedeutung vollständig zu verstehen.

Zusammenfassung

Der Magen-Darm-Trakt (GIT) von Hühnern ist ein komplexes Ökosystem, das Billionen von Mikroben beherbergt, die eine entscheidende Rolle für die Physiologie des Wirts, die Verdauung, die Nährstoffaufnahme, die Reifung des Immunsystems und die Verhinderung des Eindringens von Krankheitserregern spielen. Für eine optimale Tiergesundheit und Produktivität ist es unerlässlich, diese Mikroorganismen zu charakterisieren und ihre Rolle zu verstehen. Während der GIT von Geflügel ein Reservoir an Mikroorganismen mit potenziellen probiotischen Anwendungen enthält, ist der größte Teil der Vielfalt noch unerforscht. Um unser Verständnis der unkultivierten mikrobiellen Vielfalt zu verbessern, sind konzertierte Anstrengungen erforderlich, um diese Mikroorganismen in Kultur zu bringen. Die Isolierung und Kultivierung von GIT-besiedelnden Mikroorganismen liefert reproduzierbares Material, einschließlich Zellen, DNA und Metaboliten, das neue Einblicke in Stoffwechselprozesse in der Umwelt bietet. Ohne Kultivierung bleibt die Rolle dieser Organismen in ihrer natürlichen Umgebung unklar und auf eine deskriptive Ebene beschränkt. Unser Ziel ist es, Kultivierungsstrategien zu implementieren, die darauf abzielen, die Isolierung einer Vielzahl von anaeroben Mikroben aus dem GIT des Huhns zu verbessern, indem wir multidisziplinäres Wissen aus der Tierphysiologie, Tierernährung, Metagenomik, Futtermittelbiochemie und modernen Kultivierungsstrategien nutzen. Darüber hinaus sind wir bestrebt, die Anwendung geeigneter Praktiken für die Probenahme, den Transport und die Medienvorbereitung zu implementieren, von denen bekannt ist, dass sie den Erfolg der Isolierung beeinflussen. Geeignete Methoden sollten eine gleichbleibend sauerstofffreie Umgebung, optimale atmosphärische Bedingungen, eine angemessene Inkubationstemperatur des Wirts und Vorkehrungen für spezifische Ernährungsbedürfnisse in Übereinstimmung mit ihren besonderen Bedürfnissen gewährleisten. Durch die Befolgung dieser Methoden wird die Kultivierung nicht nur reproduzierbare Ergebnisse für die Isolierung liefern, sondern auch die Isolierungsverfahren erleichtern und so ein umfassendes Verständnis des komplizierten mikrobiellen Ökosystems innerhalb des GIT des Huhns fördern.

Einleitung

Das Wiederaufleben der Kultivierung bei der Untersuchung von Mikroorganismen hat Erkenntnisse aus metagenomischen Studien ergänzt, indem es Material zum Testen von metabolischen Hypothesen lieferte, die zuvor nur teilweise beschrieben und quantifiziert wurden. Die Kultivierung von Darmbakterien liefert Material, um die zukünftige Forschung zu mikrobiellen Wirt-Interaktionen zu unterstützen, gezielte Besiedlungsstudien zu erleichtern und molekulare Interaktionsstudien zu verbessern ^1,2,3. Die gewonnenen Erkenntnisse über gastrointestinale Mikroorganismen haben die Ernährung und das Wohlergehen der Tiere verbessert, indem sie die Futterformulierungen beeinflusst und die Nährstoffverfügbarkeit erhöht^{haben 4}. Dieses Verständnis hat zu Leistungsverbesserungen bei der Nutzung präbiotischer und probiotischer Wechselwirkungen beigetragen. Es bedarf jedoch eingehender Forschung, um ein vollständiges Verständnis dafür zu erlangen, wie biochemische und physikalisch-chemische Bedingungen zusammenwirken und sich auf das mikrobielle Profil und seine Struktur auswirken. Um dieses Ziel zu erreichen, ist der Anbau nach wie vor unerlässlich und dient als entscheidendes Instrument, um die komplizierte Dynamik der mikrobiellen Gemeinschaften im Magen-Darm-Milieu zu erforschen.

Im Gegensatz zu den umfangreichen Forschungen über Mikroben, die mit dem menschlichen Darm in Verbindung gebracht werden, und klinischen Kultivierungsstudien⁵ wurde bei Berichten über Mikroorganismen aus Nutztieren überwiegend eine begrenzte Anzahl von Medien zur Isolierung verwendet, was die Vielfalt der Isolate möglicherweise einschränkt ^2,3. Darüber hinaus wurden Verbesserungen in der Formulierung von Medien und Studien zur Wechselwirkung von Phosphat und Salzen mit Agar, wie sie von Tanaka et al. und Kawasaki et al. erläutert wurden, noch nicht für Darm-Mikrobiom-Studien implementiert 6,7,8,9.

Es wurde berichtet, dass Myo-Inositol (MI) als semi-essentielle Substanz eine zentrale Rolle bei verschiedenen metabolischen, physiologischen und regulatorischen Prozessen spielt^10,11. Dazu gehören die Beteiligung an der Knochenmineralisierung, der Entwicklung der Brustmuskulatur, der zellulären Signalgebung, der Förderung des Eisprungs und der Fertilität, der Modulation der neuronalen Signalübertragung und der Rolle als Regulator der Glukosehomöostase und der Insulinregulation bei Geflügel^10,11. MI spielt eine Rolle als Vorläufer durch seine Umwandlung innerhalb zentraler biochemischer Prozesse, einschließlich des Glykolyse-/Glukoneogeneseprozesses, des Zitronensäurezyklus und des Pentosephosphatwegs. Darüber hinaus dient es auch als Vorläufer von Phosphatidylinositol (PI), das weiter am Glycerophospholipidstoffwechsel beteiligt ist¹². Nur wenige Untersuchungen haben berichtet, dass die Metabolisierung von MI zu Veränderungen der Knochenstabilität und der Leistung der Tiere führt. Dazu gehören Verbesserungen der Futterverwertungsrate und der Körpergewichtszunahme, was die Auswirkungen nach der Aufnahme und Verwertung im Tier zeigt^13,14. Der Weg der MI-Metabolisierung und ihre Auswirkungen auf den Geflügelstoffwechsel sind jedoch nach wie vor schwer fassbar¹⁵. Darüber hinaus deuten nur wenige Studien auf eine mögliche Rolle von Bakterien bei der MI-Nutzung hin, insbesondere in Regionen mit hoher metabolischer Aktivität wie dem Ileum 16,17,18,19.

Die Bemühungen zur Kultivierung von Bakterien aus dem GIT von Tieren zielen darauf ab, genomische Datenbanken zu verbessern und die Forschung auszuweiten, genombasierte Hypothesen zu verifizieren und die ökologische Bedeutung dieser Ressourcen zu verstehen²⁰. Das Ziel dieser Arbeit ist es, Strategien für die bakterielle Kultivierung aus dem GIT von Hühnern zu verbessern, um die Isolationsvielfalt und die gezielte Isolierung einer ökologischen Interessengruppe, die Myo-Inositol assimiliert und metabolisiert, zu verbessern.

Protokoll

Das Protokoll gliedert sich in vier Teile: Probenahme, Isolierung der Bakterien, Identifizierung und Konservierung der gewonnenen Mikroorganismen. Die genehmigten Erlaubnisse für die Verwendung von Tieren wurden von der Ethikkommission des Regierungspräsidiums Tübingen mit den Zulassungsnummern HOH50/17 TE und HOH67-21TE erteilt.

1. Gewinnung von Proben für die Kultivierung von anaeroben Bakterien

1. Haltung von Tieren
   1. Haltung der Tiere auf ad libitum kommerziellem Maisfutter (Legehennen/ Junghennenfutter; siehe Materialtabelle) und Unterbringung in der Versuchsstation der Universität Hohenheim.
2. Vorbereitung der Transportlösung
   1. 1-2 Tage vor der Probenentnahme ist die Transportlösung vorzubereiten, die 1,00 g/l Natriumthioglykolat, 0,10 g/l Calciumchloriddihydrat (CaCl_{2,2H 2}O) und 0,5 % Cystein²¹ und 0,1 % Natriumresazurinlösung enthält.
   2. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums auf 6,0 ± 0,2 bei 25 °C ein und autoklavieren Sie es 15 Minuten lang bei 121 °C bei 15 psi Druck.
   3. Nachdem das Medium auf ca. 50 °C abgekühlt ist, ersetzen Sie den Verschluss der Mediumflasche durch einen sterilen Schraubverschluss mit einer Bohrung und einem Gummistopfen. Führen Sie zwei sterile Spritzennadeln an unterschiedlichen Positionen in den Gummistopfen ein und befestigen Sie einen hydrophoben Spritzenvorsatzfilter (0,22 μm) auf einer der Nadeln.
      HINWEIS: Der Austausch der Kappen und das Einsetzen von Nadeln und Filter sollte innerhalb einer laminaren Luftströmung (LAF) erfolgen.
   4. Befestigen Sie den Schlauch mit 100 % Stickstoff (N₂) an den Spritzenvorsatzfilter und gießen Sie N₂ -Gas 10 Minuten lang bei 1 psi in die Flasche.
   5. Anschließend werden die Mediumflasche und die sterilen Hungate-Röhrchen in die anaerobe Station überführt und das Transportmedium aseptisch in die Hungate-Röhrchen überführt. Füllen Sie die Hungate-Rohre vollständig bis zum Rand und stellen Sie sicher, dass sich keine Luft im Inneren befindet.
3. Schlachtung und Probenentnahme
   1. Halten Sie während des Schlachtprozesses axenische Bedingungen aufrecht, um eine Kontamination zu vermeiden, indem Sie während des gesamten Verfahrens Handschuhe, Maske, Laborschürze aus Kunststoff und sterile chirurgische Instrumente verwenden. Desinfizieren Sie außerdem die Arbeitsbank ordnungsgemäß mit Ethanol und Taschentüchern, um eine sterile Umgebung zu gewährleisten.
   2. In der Versuchsstation werden 10 50 Wochen alte Lohmann-Legehennen mit einem Flaschengasgemisch aus 35 % N₂, 35 % CO₂ und 30 % O₂ betäubt und sofort enthauptet.
      HINWEIS: Die Betäubung und Opferung sollte von einem Versuchstiertechniker durchgeführt werden, der sich mit Tierschutz und wissenschaftlichen Verfahren auskennt. Dadurch wird sichergestellt, dass das Opferverfahren den ethischen Standards, gesetzlichen Vorschriften und Sicherheitsrichtlinien entspricht.
   3. Bevor Sie mit der Dissektion des GIT-Schnitts fortfahren, sichern Sie das erforderliche Darmsegment, nämlich den Kropf, das Ileum und das Jejunum, mit einem sterilen Kelly-Hämostat (auch bekannt als Kelly-Klemme; Abbildung 1).
      HINWEIS: Die Sektion des Tieres sollte entweder von einem Tierarzt oder einer gut ausgebildeten Person durchgeführt werden, die mit der Anatomie von Hühnern vertraut ist.
   4. Füllen Sie jeden einzelnen Abschnitt in ein separates, mit Transportmedium gefülltes Hungate-Röhrchen und schließen Sie den Deckel ordnungsgemäß. Geben Sie bei Bedarf zusätzliches Transportmedium in das Rohr, um die verbleibende Luft zu verdrängen.
      HINWEIS: Die Übertragung des Abschnitts ist ein entscheidender Schritt, und es ist wichtig, eine Verzögerung oder Öffnung des Abschnitts zu minimieren, um eine längere Exposition gegenüber Sauerstoff zu vermeiden
4. Transport der Probe
   1. Gehen Sie vorsichtig mit dem Transport der Hungate-Rohre vor und legen Sie sie in eine Styroporbox, um jegliche Bruchgefahr zu vermeiden. Falls die Außentemperatur unter 15 °C liegt, halten Sie die Temperatur der Probe mit Warmpackungen aufrecht. Stellen Sie sicher, dass die Transportzeit 4 Stunden nicht überschreitet.
   2. Übertragen Sie die Schläuche vorsichtig in die anaerobe Station für die weitere Verarbeitung.

2. Isolierung von anaeroben Bakterien

1. Vorbereitung von Nährmedien
   HINWEIS: Die beschriebene Methode stellt verschiedene Überlegungen zur Vorbereitung von Nährmedien dar. Tabelle 1 zeigt beispielhaft die Aufteilung von Lösungen für die vielfältige Isolierung von Mikroorganismen.
   1. Unterteilen Sie die Bestandteile der zu verwendenden Medienformulierung in vier Lösungsgruppen: Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Agar und Mineralquelle. Bei Rich Media wie der Gehirn-Herz-Infusion (BHI) ist eine Trennung nicht immer möglich (siehe Beispiel für Medium 2 in Tabelle 1). Stellen Sie in solchen Fällen sicher, dass Agar oder zusätzliche Lösungen separat vorbereitet und autoklaviert werden.
   2. Bereiten Sie die Kohlenhydratlösung in 1/^{4 des erforderlichen} Endvolumens des Mediums vor, z. B. in 250 mL für ein Gesamtvolumen von 1 l des Mediums. Nach dem Beispiel von Medium 1 in Tabelle 1 werden 2 g Dextrose und 0,5 g Stärke in 250 ml destilliertem Wasser gelöst.
   3. Bereiten Sie die Proteinlösung in 1/^{4 des erforderlichen} Endvolumens des Mediums vor, z. B. in 250 mL für ein Gesamtvolumen von 1 l Medium. Nach dem Beispiel von Medium 1 in Tabelle 1 werden 10 g Pepton in 250 ml destilliertem Wasser gelöst.
   4. Bereiten Sie die Agarlösung in 45 % bis 48 % des Endvolumens des Mediums vor, z. B. in 450 bis 480 mL für ein Gesamtvolumen von 1 l des Mediums. Nach dem Beispiel von mediu 1 in Tabelle 1 werden 15 g Agar in 450 bis 480 ml destilliertem Wasser gelöst.
   5. Bereiten Sie die mineralische Lösung im linken Volumen von 20 bis 50 ml des Mediums vor, wenn das endgültige Volumen des Mediums 1 l beträgt. Nach dem Beispiel von Medium 1 in Tabelle 1 werden 0,5 g K₂HPO₄ in 20 bis 50 mL destilliertem Wasser gelöst.
   6. Die Proteinlösung, die Agarlösung und die mineralischen Lösungen 15 Minuten lang bei 121 °C und 21 psi Druck autoklavieren. Autoklavieren Sie die Kohlenhydratlösung bei 110 °C für 30 min bei 5 psi.
   7. Sobald alle Lösungen steril sind, kühlen Sie sie auf 50 °C ab und mischen Sie sie unter sterilen Bedingungen in eine geeignete autoklavierte Glasflasche mit einem Verschluss mit Bohrung und einem Gummistopfen. Führen Sie anschließend die Schritte 1.2.3 und 1.2.4 aus.
      HINWEIS: Das Mischen der Lösungen sollte in einem LAF erfolgen.
   8. Nachdem das Medium gemischt und entgast wurde, gießen Sie es in sterile Petrischalen oder Röhrchen in der anaeroben Station.
2. Isolierung von anaeroben Bakterien
   HINWEIS: Die folgende Methodik erläutert eine Isolationsstrategie für die Kultivierung eines breiten Spektrums anaerober Bakterien, die den Verdauungstrakt von Hühnern bewohnen.
   1. Die Proben werden in eine anaerobe Station überführt, die ein Flaschengasgemisch enthält, das aus 80 % N₂ (Qualitätsstufe 5.0), 15 % CO₂ (Qualitätsstufe 3.0) und 5 % H₂ (Qualitätsstufe 5.0) besteht und von einem kommerziellen Lieferanten bereitgestellt wird (siehe Materialtabelle).
   2. Übertragen Sie in der anaeroben Station den Schnitt aus dem Zündrohr mit einer autoklavierten Pinzette in die sterile Petrischale.
   3. Schneiden Sie den Abschnitt vorsichtig mit einer sterilen Schere auf und extrahieren Sie mit einem sterilen Spatel ca. 1 g Digesta-Inhalt aus dem Darmsegment.
      HINWEIS: Nach der Entnahme von 1 g Digesta-Inhalt den restlichen Digesta verschrotten und zur gezielten Isolierung in das entsprechende Transportmediumröhrchen überführen.
   4. Führen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung mit einer sterilen physiologischen Lösung (0,85 % NaCl) durch.
   5. 0,1 mL der Probe aus den Verdünnungen 10-4 bis 10-7 in sterile und ordnungsgemäß beschriftete Petrischalen geben und mit einem sterilen Drigalski-Spatel bestreuen.
   6. Inkubieren Sie die Platten in der anaeroben Station für 24–48 Stunden bei 39 °C.
      HINWEIS: Wenn Sie in einem Inkubator inkubieren, geben Sie die Petrischalen in eine luftdichte Box, bevor Sie die Petrischalen aus der anaeroben Station nehmen.
3. Gezielte Isolierung einer bestimmten Bakteriengruppe.
   HINWEIS: Die folgende Methodik erläutert eine Isolationsstrategie für anaerobe Bakterien, die möglicherweise MI assimilieren können.
   1. Für die Herstellung von Anreicherungsmedium, Minimal-Agar-Medium und Minimal-Bouillon-Medium ist die in Tabelle 2 und Tabelle 3 angegebene Zusammensetzung unter Einhaltung der in Schritt 2.1 dargelegten Richtlinien zu befolgen. Geben Sie nach dem Autoklaviervorgang 0,2 ml/l filtersterile Vitaminmischung (wie in der Zusammensetzung beschrieben) in Minimal-Agar-Medien und Minimal-Brühe-Medien.
   2. Homogenisieren Sie die Ausgangsprobe mit einem Vortex-Mischer für 10-15 s. Anschließend wird die homogenisierte Probe mit einer Pipette mit einer Geschwindigkeit von 5 % in das Röhrchen mit dem Anreicherungsmedium überführt (z. B. wenn das Volumen des Anreicherungsmediums 10 ml beträgt, 0,5 ml homogenisierte Probe inokulieren). Die frisch beimpfte Probe wird 24 Stunden lang bei 39 °C in der anaeroben Station inkubiert.
   3. Mischen Sie das angereicherte Röhrchen nach der Inkubation gründlich, indem Sie entweder einen Vortex-Mischer für 10-15 s verwenden oder pipettieren. Anschließend wird die gemischte Probe mit einer Geschwindigkeit von 5 % in ein steriles Minimalbouillonmedium überführt und anschließend 24 Stunden lang bei 39 °C inkubiert.
   4. Verdünnen Sie die Proben seriell in steriler Kochsalzlösung (d. h. 0,85 % NaCl), beginnend mit einer Verdünnung von 1:10 und bis zur Verdünnung von 1:1000. Nach jeder Verdünnung wird die Probe mit einem Vortex-Mischer 10-15 s lang oder durch Pipettieren gründlich bei Raumtemperatur homogenisiert.
   5. Unter sterilen und anaeroben Bedingungen 1 ml der verdünnten Probe in eine Petrischale geben. Gießen Sie ca. 15-20 ml geschmolzenes minimales Agarmedium in die Petrischale und schwenken Sie es vorsichtig horizontal, um eine gleichmäßige Mischung zu erzielen.
      HINWEIS: Die Temperatur des Agars sollte etwa 45 °C betragen, damit keine Klumpen vorhanden sind und die Probe nicht durch Hitze abgetötet wird. Das mittlere Gießen sollte unter anaeroben Bedingungen erfolgen.
   6. Nach der Erstarrung des Agars werden die Petrischalen 24 Stunden lang bei 39 °C in umgekehrter Position in einer anaeroben Station oder im Inkubator inkubiert. Nach 24 Stunden Inkubation erscheinen Bakterienkolonien als deutliche, kleine Punkte, die in das Medium eingebettet sind.
      HINWEIS: Wenn Sie die Petrischale in einem Inkubator inkubieren, bringen Sie die Platten in eine luftdichte Box, bevor Sie sie aus der anaeroben Station nehmen.
   7. Nehmen Sie mit einer sterilen Impfschlaufe vorsichtig die einzelnen Bakterienkolonien heraus und geben Sie sie in separate Röhrchen mit minimalem Brühemedium.
   8. Nachdem die Kolonien in einzelne Röhrchen überführt wurden, werden die beimpften Röhrchen 24 h lang bei 39 °C anaerob inkubiert. Nach der Inkubation deutet eine erhöhte Trübungen im Medium auf Bakterienwachstum hin.
      HINWEIS: Jedes Mal, bevor Sie die Medienflaschen in die anaerobe Station befördern, sollten sie entgast werden, wie bereits in Schritt 2.1.7 erwähnt. Die Schritte 2-8 sollten innerhalb der anaeroben Station durchgeführt werden.

3. Identifizierung von anaeroben Bakterien

1. Extraktion von DNA aus Kulturen mit einer Inkubationszeit von 24 bis 48 Stunden nach einem enzymatischen Lyseprotokoll²².
2. Die Kultur wird bei 3000 x g 10 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette verworfen.
3. Waschen Sie das Pellet 2x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), indem Sie es in 2 mL PBS suspendieren. Homogenisieren Sie die Probe mit einem Vortex-Mischer für 10-15 s. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt bei 3000 x g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
4. Das Zellpellet wird in 0,2 mL PBS pH 7,4 suspendiert und 30 Minuten lang bei 50 ΰC mit 1 μl Lysozym und 1 μμ rekombinantem Mutanolysin inkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 56 μC mit 5 μl Proteinase K.
5. Geben Sie 4 μl RNAseA in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugenröhrchen bei 21168 x g für 1 min. Den Überstand zurückgewinnen und mit magnetischen Kügelchen reinigen.
6. Durchführung der DNA-Quantifizierung mit einer fluorometrischen Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers für das dsDNA-Quantifizierungskit (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Extrahierte DNA kann bei -20 °C gelagert werden.
7. DNA-Proben als Templates für die PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer 27f und 1492r²³ gemäß den in Tabelle 4 gezeigten Bedingungen verwenden. Um sicherzustellen, dass die PCR-Reaktion erfolgreich war, führen Sie die Agarose-Gelelektrophorese gemäß der Standard-Agarose-Gelelektrophoresemethode mit 1X TAE-Puffer und 1% Agarose durch.
8. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem kommerziellen PCR-Aufreinigungskit, um Primer, Nukleotide und andere Verunreinigungen zu entfernen.
9. Senden Sie das PCR-Produkt für die Sanger-Sequenzierung an den geeigneten Sequenzierdienstleister.
   HINWEIS: Neben der Sequenzierung können Dienstleister auch Dienstleistungen wie die Aufreinigung des PCR-Produkts gegen zusätzliche Gebühren anbieten. PCR-Produkte können bei 4 °C oder -20 °C gelagert werden.
10. Nachdem Sie die Sequenzierungsergebnisse im FASTA-Format zusammen mit der Chromatogrammdatei (üblicherweise im ABI- oder SCF-Format) erhalten haben, analysieren Sie die Sequenzen mit bioinformatischen Tools. Verwenden Sie eine Sequenzanalysesoftware, um die Chromatogrammdatei zu öffnen und zu visualisieren.
    HINWEIS: Die Gesamtqualität des Chromatogramms wurde auf der Grundlage klarer und deutlicher Peaks ohne übermäßiges Rauschen überprüft
11. Vergleichen Sie Amplikons und richten Sie sie mit den eng verwandten Spezies in der nicht redundanten ribosomalen RNA-Datenbank GenBank 16S des National Center for Biotechnology Information (NCBI) aus, indem Sie das Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Tool²⁴ und die Refseq-Genomdatenbank verwenden.
    HINWEIS: Wenn Sie NCBI BLAST verwenden, kopieren Sie die gesamte FASTA-Sequenz in die Suchleiste.

4. Konservierung von reinen Bakterienkulturen

1. Ernten Sie Bakterienzellen aus einer gut gewachsenen Kultur von 24 h bis 48 h entweder durch Zentrifugation (3000 x g für 10 min) oder Biomassesammlung aus einer axenischen Kultur auf einer Platte.
2. Die Bakterienkultur wird in einer geeigneten isotonischen sterilen Lösung (NaCl 0,85 %) suspendiert und durch Zentrifugieren der Bakterienlösung bei 3000 x g für 10 min bei 4 °C gewaschen.
3. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in einem kleinen Volumen steriler isotonischer Lösung (0,5 ml). Um die Entfernung von Rückständen des Wachstumsmediums sicherzustellen, wiederholen Sie dies 1x.
4. Resuspendieren Sie das Pellet in 0,8 mL bis 1 mL sterilem Nährmediumkonzentrat und homogenisieren Sie es entweder mit einem Vortex-Mischer für 5-10 s oder durch vorsichtiges Pipettieren.
5. Übertragen Sie 0,5 ml Zellsuspension in ein steriles und ordnungsgemäß markiertes 1 ml-Kryoröhrchen und fügen Sie 0,5 ml autoklavierte 50%ige Glycerinlösung hinzu. Homogenisieren Sie das Kryofläschchen mit einem Vortex-Mischer und lagern Sie es in einem Gefrierschrank bei -80 °C (Abbildung 3).
   HINWEIS: Alle Schritte vor dem Transfer der Kryoröhrchen auf -80 °C sollten in der anaeroben Station durchgeführt werden.

Ergebnisse

Überwachung der anaeroben Bedingungen während des Transports
Aufgrund der Zugabe von Natriumresazurin deutet die Änderung der Farbe der Transportlösung zu rosa vor dem Transfer der Probe in das Röhrchen auf eine Störung oder ein Versagen bei der Aufrechterhaltung der anaeroben Bedingungen hin. Daher wurde auf die Verwendung der Röhre mit Farbänderung während des Transports verzichtet und es wurden nur die Röhren verwendet, die keine Farbänderung zeigten, wi...

Diskussion

Der Zweck dieser Methodik besteht darin, die Kultivierung anaerober Darmbakterien zu verbessern, indem die Qualität der Probenahmebedingungen, der Probenverarbeitung sowie der Medienformulierung und -vorbereitung verbessert wird. Bei der Formulierung der Nährmedien müssen die physikalisch-chemischen Bedingungen der Proben (pH-Wert, Verfügbarkeit von Kohlenstoff, Stickstoff und Cofaktoren) berücksichtigt werden. Im Vergleich zu Bakterienkultursammlungen von Schweinen, Menschen oder M...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1