Estrategias para mejorar el cultivo de bacterias anaeróbicas del tracto gastrointestinal de pollo

Resumen

El protocolo presenta dos metodologías para mejorar el aislamiento de bacterias intestinales anaerobias. El primero se centra en el aislamiento de una amplia gama de bacterias utilizando diferentes medios de cultivo. El segundo se centra en los pasos de cultivo de un grupo microbiano específico, posiblemente asimilando mioinositol, para comprender completamente su significado ecológico.

Resumen

El tracto gastrointestinal (TGI) del pollo es un ecosistema complejo que alberga billones de microbios que desempeñan un papel fundamental en la fisiología, la digestión, la absorción de nutrientes, la maduración del sistema inmunitario y la prevención de la intrusión de patógenos del huésped. Para una salud y productividad óptimas de los animales, es imperativo caracterizar estos microorganismos y comprender su función. Si bien el TGI de las aves de corral contiene un reservorio de microorganismos con posibles aplicaciones probióticas, la mayor parte de la diversidad permanece inexplorada. Para mejorar nuestra comprensión de la diversidad microbiana no cultivada, se requieren esfuerzos concertados para llevar estos microorganismos al cultivo. El aislamiento y el cultivo de microorganismos colonizadores de GIT producen material reproducible, incluidas células, ADN y metabolitos, que ofrecen nuevos conocimientos sobre los procesos metabólicos en el medio ambiente. Sin el cultivo, el papel de estos organismos en su entorno natural sigue siendo poco claro y limitado a un nivel descriptivo. Nuestro objetivo es implementar estrategias de cultivo destinadas a mejorar el aislamiento de una amplia gama de microbios anaeróbicos del TGI del pollo, aprovechando el conocimiento multidisciplinario de la fisiología animal, la nutrición animal, la metagenómica, la bioquímica de los piensos y las estrategias modernas de cultivo. Además, nuestro objetivo es implementar el uso de prácticas adecuadas para el muestreo, el transporte y la preparación de los medios, que se sabe que influyen en el éxito del aislamiento. Las metodologías apropiadas deben garantizar un entorno constante sin oxígeno, condiciones atmosféricas óptimas, una temperatura de incubación adecuada del huésped y la provisión de requisitos nutricionales específicos en consonancia con sus necesidades distintivas. Al seguir estas metodologías, el cultivo no solo producirá resultados reproducibles para el aislamiento, sino que también facilitará los procedimientos de aislamiento, fomentando así una comprensión integral del intrincado ecosistema microbiano dentro del TGI del pollo.

Introducción

El resurgimiento del cultivo en el estudio de microorganismos ha complementado los conocimientos de los estudios metagenómicos al proporcionar material para probar hipótesis metabólicas que anteriormente solo se describían y cuantificaban parcialmente. El cultivo de bacterias intestinales proporciona material para sustentar futuras investigaciones sobre las interacciones microbiano-huésped, facilitar estudios de colonización dirigidos y mejorar los estudios de interacción molecular ^1,2,3. Los conocimientos adquiridos sobre los microorganismos....

Protocolo

El protocolo se divide en cuatro partes: muestreo, aislamiento bacteriano, identificación y conservación de los microorganismos obtenidos. Los permisos aprobados para el uso de animales fueron emitidos por la comisión de ética de Regierungspräsidium Tübingen, Alemania, con los números de aprobación HOH50/17 TE y HOH67-21TE.

1. Obtención de muestras para el cultivo de bacterias anaerobias

1. Mantenimiento de animales
   1. Mantener a los animales con una dieta comercial ad libitum a base de maíz (Legehennen/Junghennenfutter; ver Tabla de Materiales) y alojar....

Discusión

El propósito de esta metodología es mejorar el cultivo de bacterias intestinales anaeróbicas mediante la mejora de la calidad de las condiciones de muestreo, el procesamiento de muestras y la formulación y preparación de medios. Las condiciones fisicoquímicas de las muestras (pH, disponibilidad de carbono, nitrógeno y cofactores) deben tenerse en cuenta a la hora de formular los medios de cultivo. En comparación con las colecciones de cultivos bacterianos obtenidas de cerdos, hum.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1