Estrategias para mejorar el cultivo de bacterias anaeróbicas del tracto gastrointestinal de pollo

Resumen

El protocolo presenta dos metodologías para mejorar el aislamiento de bacterias intestinales anaerobias. El primero se centra en el aislamiento de una amplia gama de bacterias utilizando diferentes medios de cultivo. El segundo se centra en los pasos de cultivo de un grupo microbiano específico, posiblemente asimilando mioinositol, para comprender completamente su significado ecológico.

Resumen

El tracto gastrointestinal (TGI) del pollo es un ecosistema complejo que alberga billones de microbios que desempeñan un papel fundamental en la fisiología, la digestión, la absorción de nutrientes, la maduración del sistema inmunitario y la prevención de la intrusión de patógenos del huésped. Para una salud y productividad óptimas de los animales, es imperativo caracterizar estos microorganismos y comprender su función. Si bien el TGI de las aves de corral contiene un reservorio de microorganismos con posibles aplicaciones probióticas, la mayor parte de la diversidad permanece inexplorada. Para mejorar nuestra comprensión de la diversidad microbiana no cultivada, se requieren esfuerzos concertados para llevar estos microorganismos al cultivo. El aislamiento y el cultivo de microorganismos colonizadores de GIT producen material reproducible, incluidas células, ADN y metabolitos, que ofrecen nuevos conocimientos sobre los procesos metabólicos en el medio ambiente. Sin el cultivo, el papel de estos organismos en su entorno natural sigue siendo poco claro y limitado a un nivel descriptivo. Nuestro objetivo es implementar estrategias de cultivo destinadas a mejorar el aislamiento de una amplia gama de microbios anaeróbicos del TGI del pollo, aprovechando el conocimiento multidisciplinario de la fisiología animal, la nutrición animal, la metagenómica, la bioquímica de los piensos y las estrategias modernas de cultivo. Además, nuestro objetivo es implementar el uso de prácticas adecuadas para el muestreo, el transporte y la preparación de los medios, que se sabe que influyen en el éxito del aislamiento. Las metodologías apropiadas deben garantizar un entorno constante sin oxígeno, condiciones atmosféricas óptimas, una temperatura de incubación adecuada del huésped y la provisión de requisitos nutricionales específicos en consonancia con sus necesidades distintivas. Al seguir estas metodologías, el cultivo no solo producirá resultados reproducibles para el aislamiento, sino que también facilitará los procedimientos de aislamiento, fomentando así una comprensión integral del intrincado ecosistema microbiano dentro del TGI del pollo.

Introducción

El resurgimiento del cultivo en el estudio de microorganismos ha complementado los conocimientos de los estudios metagenómicos al proporcionar material para probar hipótesis metabólicas que anteriormente solo se describían y cuantificaban parcialmente. El cultivo de bacterias intestinales proporciona material para sustentar futuras investigaciones sobre las interacciones microbiano-huésped, facilitar estudios de colonización dirigidos y mejorar los estudios de interacción molecular ^1,2,3. Los conocimientos adquiridos sobre los microorganismos gastrointestinales han mejorado la nutrición y el bienestar de los animales al influir en las formulaciones de las dietas y aumentar la disponibilidad de nutrientes⁴. Esta comprensión ha contribuido a mejorar el rendimiento en la utilización de la interacción entre prebióticos y probióticos. Sin embargo, se requiere una investigación en profundidad para obtener una comprensión completa de cómo las condiciones bioquímicas y fisicoquímicas interactúan e impactan el perfil microbiano y su estructura. Para lograr este objetivo, el cultivo sigue siendo imperativo, ya que sirve como una herramienta crucial para profundizar en la intrincada dinámica de las comunidades microbianas dentro del entorno gastrointestinal.

En contraste con la extensa investigación sobre microbios asociados con el intestino humano y los estudios clínicos de cultivo⁵, los informes sobre microorganismos del ganado han utilizado predominantemente una gama limitada de medios para el aislamiento, lo que podría restringir la diversidad de aislados ^2,3. Además, las mejoras en la formulación de medios y los estudios sobre la interacción del fosfato y las sales con el agar, como lo dilucidaron Tanaka et al. y Kawasaki et al., aún no se han implementado para los estudios del microbioma intestinal 6,7,8,9.

Considerado una sustancia semi-esencial, se ha reportado que el mio-inositol (MI) desempeña un papel fundamental en diversos procesos metabólicos, fisiológicos y regulatorios^10,11. Estos incluyen la participación en la mineralización ósea, el desarrollo muscular de la mama, la señalización celular, la promoción de la ovulación y la fertilidad, la modulación de la señalización neuronal y la actuación como regulador de la homeostasis de la glucosa y la regulación de la insulina en las aves de corral^10,11. El IM desempeña un papel como precursor a través de su interconversión dentro de procesos bioquímicos fundamentales, incluido el proceso de glucólisis/gluconeogénesis, el ciclo del ácido cítrico y la vía del fosfato de pentosa. Además, también sirve como precursor del fosfatidilinositol (PI), que está involucrado en el metabolismo de los glicerofosfolípidos¹². Pocas investigaciones han reportado que la metabolización del IM conduce a alteraciones en la estabilidad ósea y el rendimiento animal. Esto incluye mejoras en la tasa de conversión alimenticia y la ganancia de peso corporal, demostrando su impacto después de la absorción y utilización dentro del animal^13,14. Sin embargo, la vía para la metabolización del IM y su impacto en el metabolismo de las aves de corral sigue siendo difícil de alcanzar¹⁵. Además, pocos estudios proponen un papel potencial de las bacterias en la utilización del IM, particularmente en regiones de alta actividad metabólica como el íleon 16,17,18,19.

Los esfuerzos en el cultivo de bacterias a partir del tracto gastrointestinal de los animales tienen como objetivo mejorar las bases de datos genómicos y ampliar la investigación, verificar las hipótesis basadas en el genoma y comprender la importancia ecológica de estos recursos²⁰. El objetivo de este trabajo es mejorar las estrategias de cultivo bacteriano a partir del TGI de pollo para potenciar la diversidad de aislamiento y el aislamiento focalizado de un grupo ecológico de interés que asimilan y metabolizan el mioinositol.

Protocolo

El protocolo se divide en cuatro partes: muestreo, aislamiento bacteriano, identificación y conservación de los microorganismos obtenidos. Los permisos aprobados para el uso de animales fueron emitidos por la comisión de ética de Regierungspräsidium Tübingen, Alemania, con los números de aprobación HOH50/17 TE y HOH67-21TE.

1. Obtención de muestras para el cultivo de bacterias anaerobias

1. Mantenimiento de animales
   1. Mantener a los animales con una dieta comercial ad libitum a base de maíz (Legehennen/Junghennenfutter; ver Tabla de Materiales) y alojarlos en la estación experimental de la Universidad de Hohenheim.
2. Preparación de la solución de transporte
   1. 1-2 días antes de la recogida de la muestra, prepare la solución de transporte que contenga 1,00 g/L de tioglicolato de sodio, 0,10 g/L de cloruro de calcio dihidratado (CaCl_{2,2H 2}O), 0,5% de cisteína²¹ y 0,1% de solución de resazurina sódica.
   2. Ajuste el pH del medio a 6,0 ± 0,2 a 25 °C y autoclave a 121 °C durante 15 min a una presión de 15 psi.
   3. Después de que el medio se haya enfriado a aproximadamente 50 °C, reemplace la tapa del frasco mediano con un tapón de rosca estéril con un orificio y un tapón de goma. Inserte dos agujas de jeringa estériles en el tapón de goma en diferentes posiciones y coloque un filtro de jeringa hidrofóbico (0,22 μm) en una de las agujas.
      NOTA: El reemplazo de las tapas y la inserción de las agujas y el filtro deben realizarse dentro de un flujo de aire laminar (LAF).
   4. Conecte el tubo de nitrógeno (_N2) al 100% del filtro de la jeringa y rocíe el gas N₂ en la botella durante 10 minutos a 1 psi.
   5. A continuación, transfiera el frasco mediano y los tubos estériles de Hungate a la estación anaeróbica y transfiera asépticamente el medio de transporte a los tubos de Hungate. Llene completamente los tubos de Hungate hasta la parte superior, asegurándose de que no haya aire en el interior.
3. Sacrificio y recogida de muestras
   1. Durante el proceso de sacrificio, mantenga las condiciones axénicas para evitar la contaminación mediante el uso de guantes, mascarilla, delantal de laboratorio de plástico e instrumentos quirúrgicos estériles durante todo el procedimiento. Además, desinfecte adecuadamente el banco de trabajo con etanol y pañuelos desechables para mantener un ambiente estéril.
   2. En la estación experimental, anestesiar 10 gallinas ponedoras Lohmann de 50 semanas de edad utilizando una mezcla de gas embotellado que consta de 35% de N₂, 35 % de CO₂ y 30% de_O2 y decapitarlas inmediatamente.
      NOTA: La anestesia y el sacrificio deben ser realizados por un técnico en animales de laboratorio bien versado en el bienestar animal y los procedimientos científicos. Esto garantiza que el procedimiento de sacrificio se adhiera a los estándares éticos, las regulaciones legales y las pautas de seguridad.
   3. Antes de proceder a la disección de la sección del tracto gastrointestinal, asegure el segmento intestinal requerido, es decir, el buche, el íleon y el yeyuno, utilizando hemostático de Kelly estéril (también conocido como pinza de Kelly; Figura 1).
      NOTA: La disección del animal debe ser realizada por un veterinario o una persona bien entrenada que esté familiarizada con la anatomía de los pollos.
   4. Transfiera cada sección individual a un tubo Hungate separado lleno de medio de transporte y cierre la tapa correctamente. Si es necesario, agregue medio de transporte adicional al tubo para desplazar el aire restante.
      NOTA: La transferencia de la sección es un paso crucial, y es esencial minimizar cualquier retraso o apertura de la sección para evitar la exposición prolongada al oxígeno
4. Transporte de la muestra
   1. Manipule con cuidado el transporte de los tubos de Hungate, colocándolos dentro de una caja de espuma de poliestireno para evitar cualquier riesgo de rotura. En caso de que la temperatura exterior sea inferior a 15 °C, mantenga la temperatura de la muestra utilizando compresas calientes. Asegúrese de que el tiempo de transporte no exceda las 4 h.
   2. Transfiera los tubos con cuidado dentro de la estación anaeróbica para su posterior procesamiento.

2. Aislamiento de bacterias anaerobias

1. Preparación de los medios de cultivo
   NOTA: El método descrito presenta varias consideraciones para la preparación de los medios de cultivo. La Tabla 1 ilustra un ejemplo de cómo se dividen las soluciones para el aislamiento diverso de microorganismos.
   1. Divida los ingredientes de la formulación del medio que se utilizará en cuatro grupos de soluciones: fuente de carbono, fuente de nitrógeno, agar y fuente mineral. En el caso de los medios enriquecidos, como la infusión cerebro-corazón (BHI), la separación no siempre es posible (véase el ejemplo del medio 2 en la Tabla 1). En tales casos, asegúrese de que el agar o las soluciones adicionales se preparen por separado y se utilicen en autoclave.
   2. Prepare la^{solución de carbohidratos} en 1/4 del volumen final de medio requerido, por ejemplo, en 250 ml para un volumen total de 1 litro de medio. Siguiendo el ejemplo del medio 1 de la Tabla 1, disuelva 2 g de dextrosa y 0,5 g de almidón en 250 mL de agua destilada.
   3. Prepare la^{solución de proteínas} en 1/4 del volumen final de medio requerido, por ejemplo, en 250 ml para un volumen total de 1 litro de medio. Siguiendo el ejemplo del medio 1 de la Tabla 1, disolver 10 g de peptona en 250 mL de agua destilada.
   4. Prepare la solución de agar en el 45% al 48% del volumen final de medio, por ejemplo, en 450 a 480 mL para un volumen total de 1 L de medio. Siguiendo el ejemplo de la media 1 de la Tabla 1, disolver 15 g de agar en 450 a 480 mL de agua destilada.
   5. Prepare la solución mineral en el volumen izquierdo de 20 a 50 mL de medio cuando el volumen final de medio sea de 1 L. Siguiendo el ejemplo del medio 1 de la Tabla 1, disuelva 0,5 g de K₂HPO₄ en 20 a 50 mL de agua destilada.
   6. Autoclave la solución de proteína, la solución de agar y las soluciones minerales a 121 °C durante 15 min a una presión de 21 psi. Autoclave la solución de carbohidratos a 110 °C durante 30 min a 5 psi.
   7. Una vez que todas las soluciones estén estériles, enfriarlas a 50 °C y mezclarlas en condiciones estériles en un frasco de vidrio adecuado para esterilizar en autoclave con un tapón con orificio y un tapón de goma. Después de esto, siga los pasos 1.2.3 y 1.2.4.
      NOTA: La mezcla de soluciones debe realizarse dentro de un LAF.
   8. Una vez que los medios se hayan mezclado y desgasificado, viértalos en placas de Petri o tubos estériles dentro de la estación anaeróbica.
2. Aislamiento de bacterias anaerobias
   NOTA: La siguiente metodología explica una estrategia de aislamiento para cultivar una amplia gama de bacterias anaeróbicas que habitan en el tracto digestivo de los pollos.
   1. Transfiera las muestras a una estación anaeróbica que contenga una mezcla de gas envasado compuesta por un 80% de_N2 (nivel de calidad 5.0), un 15% de_CO2 (nivel de calidad 3.0) y un 5% de_H2 (nivel de calidad 5.0) proporcionada por un proveedor comercial (ver Tabla de Materiales).
   2. Dentro de la estación anaeróbica, transfiera la sección del tubo de hungate a la placa de Petri estéril utilizando pinzas esterilizadas en autoclave.
   3. Abra con cuidado la sección con unas tijeras estériles y extraiga aproximadamente 1 g de contenido de digesta del segmento intestinal con una espátula estéril.
      NOTA: Después de tomar 1 g de contenido de digesta, desechar y transferir la digesta restante a su respectivo tubo de medio de transporte para el aislamiento objetivo.
   4. Realizar una dilución en serie de 10 veces utilizando una solución fisiológica estéril (NaCl al 0,85%).
   5. Dispense 0,1 mL de la muestra de las diluciones 10-4 a 10-7 en placas de Petri estériles y debidamente etiquetadas y extiéndalas con una pala Drigalski estéril.
   6. Incubar las placas dentro de la estación anaeróbica durante 24-48 h a 39 °C.
      NOTA: Al incubar dentro de una incubadora, transfiera las placas de Petri a una caja hermética antes de sacar las placas de Petri de la estación anaeróbica.
3. Aislamiento selectivo de un grupo bacteriano específico.
   NOTA: La siguiente metodología explica una estrategia de aislamiento para bacterias anaerobias que potencialmente pueden asimilar el IM.
   1. Para la preparación del medio de enriquecimiento, el medio de agar mínimo y el medio de caldo mínimo, siga la composición especificada en la Tabla 2 y la Tabla 3, siguiendo las pautas descritas en el paso 2.1. Agregue 0.2 mL/L de mezcla de vitaminas estériles con filtro (como se describe en la composición) en un medio de agar mínimo y un medio de caldo mínimo después del proceso de autoclave.
   2. Homogeneizar la muestra inicial utilizando un mezclador de vórtice durante 10-15 s. A continuación, transfiera la muestra homogeneizada al tubo que contiene el medio de enriquecimiento a una tasa del 5% (por ejemplo, si el volumen del medio de enriquecimiento es de 10 ml, inocule 0,5 ml de muestra homogeneizada) utilizando una pipeta. Incubar la muestra recién inoculada durante 24 h a 39 °C dentro de la estación anaeróbica.
   3. Después de la incubación, mezcle bien el tubo enriquecido utilizando un mezclador de vórtice durante 10-15 s o pipeteando. Posteriormente, transfiera la muestra mezclada a un medio de caldo mínimo estéril a una tasa del 5% y luego incube durante 24 h a 39 °C.
   4. Diluir las muestras en serie en solución salina estéril (es decir, NaCl al 0,85%), comenzando con una dilución 1:10 y continuando hasta una dilución 1:1000. Después de cada dilución, homogeneice completamente la muestra a temperatura ambiente utilizando un mezclador de vórtice durante 10-15 s o pipeteando.
   5. En condiciones estériles y anaeróbicas, transfiera 1 ml de muestra diluida a una placa de Petri. Vierta aproximadamente 15-20 ml de medio de agar mínimo derretido en la placa de Petri y agite suavemente horizontalmente para una mezcla uniforme.
      NOTA: La temperatura del agar debe estar en torno a los 45 °C para que no queden grumos y para evitar que la muestra se mate por el calor. El vertido medio debe realizarse en condiciones anaeróbicas.
   6. Tras la solidificación del agar, incubar las placas de Petri durante 24 h a 39 °C en posición invertida dentro de una estación anaeróbica o en una incubadora. Después de 24 h de incubación, las colonias bacterianas aparecen como pequeños puntos distintos incrustados en el medio.
      NOTA: Al incubar la placa de Petri dentro de una incubadora, transfiera las placas a una caja hermética antes de sacarlas de la estación anaeróbica.
   7. Usando un asa de inoculación estéril, elija cuidadosamente la colonia bacteriana individual y transfiérala a tubos separados de medio de caldo mínimo.
   8. Después de transferir las colonias a tubos individuales, incubar anaeróbicamente los tubos inoculados a 39 °C durante 24 h. Después de la incubación, el aumento de la turbidez en el medio indicará crecimiento bacteriano.
      NOTA: Cada vez que se transfieren las botellas de medios dentro de la estación anaeróbica, se deben desgasificar como se mencionó anteriormente en el paso 2.1.7. Los pasos 2-8 deben llevarse a cabo dentro de la estación anaeróbica.

3. Identificación de bacterias anaerobias

1. Extraer ADN de cultivos de 24 h a 48 h de tiempo de incubación, siguiendo un protocolo de lisis enzimática²².
2. Centrifugar el cultivo a 3000 x g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante con una pipeta.
3. Lave el pellet 2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) suspendiéndolo en 2 mL de PBS. Homogeneizar la muestra utilizando un mezclador de vórtice durante 10-15 s. Repita el paso de centrifugación a 3000 x g durante 10 min a 4 °C y deseche el sobrenadante con cuidado.
4. Suspender el pellet celular en 0,2 mL de PBS pH 7,4 e incubar a 50 °C con 1 U de lisozima y 1 U de mutanolisina recombinante durante 30 min, seguido de una incubación de 30 min a 56 °C con 5 μL de proteinasa K.
5. Añadir 4 μL de unidad de ARNasa a cada tubo e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Tubos de centrífuga a 21168 x g durante 1 min. Recuperar el sobrenadante y purificar con perlas magnéticas.
6. Realice la cuantificación de ADN con un método fluorométrico de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit de cuantificación de dsDNA (mencionado en la Tabla de materiales).
   NOTA: El ADN extraído puede almacenarse a -20 °C.
7. Utilice muestras de ADN como plantillas para la amplificación por PCR utilizando los cebadores 27f y 1492r²³ siguiendo las condiciones que se muestran en la Tabla 4. Para asegurarse de que la reacción de PCR fue exitosa, realice la electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con el método estándar de electroforesis en gel de agarosa utilizando tampón TAE 1X y agarosa al 1%.
8. Purifique el producto de PCR utilizando un kit de purificación de PCR comercial para eliminar cebadores, nucleótidos y otros contaminantes.
9. Envíe el producto de PCR para la secuenciación de Sanger al proveedor de servicios de secuenciación adecuado.
   NOTA: Junto con la secuenciación, los proveedores de servicios también pueden proporcionar servicios que incluyen la purificación del producto PCR con tarifas adicionales. Los productos PCR pueden almacenarse a 4 °C o a -20 °C.
10. Después de obtener los resultados de la secuenciación en formato FASTA junto con el archivo de cromatograma (comúnmente en formato ABI o SCF), analice las secuencias utilizando herramientas bioinformáticas. Utilice un software de análisis de secuencia para abrir y visualizar el archivo de cromatograma.
    NOTA: La calidad general del cromatograma se comprobó sobre la base de picos claros y distintos sin ruido excesivo
11. Compare los amplicones y alinee con las especies estrechamente relacionadas en la base de datos de ARN ribosómico GenBank 16S no redundante del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) utilizando la herramienta²⁴ de la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica (BLAST) y la base de datos del genoma Refseq.
    NOTA: Cuando utilice NCBI BLAST, copie toda la secuencia de FASTA en la barra de búsqueda.

4. Conservación de cultivos bacterianos puros

1. Recolectar células bacterianas de un cultivo bien cultivado de 24 h a 48 h, ya sea por centrifugación (3000 x g durante 10 min) o recolección de biomasa de un cultivo axénico en una placa.
2. Suspender el cultivo bacteriano en una solución estéril isotónica adecuada (NaCl 0,85%) y lavar centrifugando la solución bacteriana a 3000 x g durante 10 min a 4 °C.
3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet bacteriano en un pequeño volumen de solución isotónica estéril (0,5 mL). Para asegurar la eliminación de cualquier residuo del medio de crecimiento, repita 1 vez.
4. Vuelva a suspender el pellet en 0,8 mL a 1 mL de concentrado de medio de cultivo estéril y homogeneice con un mezclador de vórtice durante 5-10 s o pipeteando suavemente.
5. Transfiera 0,5 mL de suspensión celular a un criovial estéril y debidamente etiquetado de 1 mL y agregue 0,5 mL de solución de glicerol al 50% esterilizada en autoclave. Homogeneizar la criovialidad con un mezclador de vórtice y almacenarla en una rejilla de congelación a -80 °C (Figura 3).
   NOTA: Todos los pasos antes de transferir los crioviales a -80 °C deben realizarse dentro de la estación anaeróbica.

Resultados

Monitoreo de las condiciones anaeróbicas durante el transporte
Debido a la adición de resazurina sódica, el cambio en el color de la solución de transporte a rosa antes de la transferencia de la muestra al tubo indica una interrupción o falla en el mantenimiento de las condiciones anaeróbicas. Por lo tanto, se abstuvo de utilizar el tubo que mostraba cambio de color durante el transporte y solo se utilizaron los tubos que no mostraban cambio de color, como se pu...

Discusión

El propósito de esta metodología es mejorar el cultivo de bacterias intestinales anaeróbicas mediante la mejora de la calidad de las condiciones de muestreo, el procesamiento de muestras y la formulación y preparación de medios. Las condiciones fisicoquímicas de las muestras (pH, disponibilidad de carbono, nitrógeno y cofactores) deben tenerse en cuenta a la hora de formular los medios de cultivo. En comparación con las colecciones de cultivos bacterianos obtenidas de cerdos, hum...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1