Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מציג שתי מתודולוגיות לשיפור הבידוד של חיידקי מעיים אנאירוביים. הראשון מתמקד בבידוד של מגוון רחב של חיידקים באמצעות אמצעי תרבית שונים. השני מתמקד בשלבי הטיפוח של קבוצת חיידקים מסוימת, אולי הטמעת מיו-אינוסיטול, כדי להבין באופן מלא את משמעותה האקולוגית.

Abstract

מערכת העיכול של עוף (GIT) היא מערכת אקולוגית מורכבת המכילה טריליוני מיקרובים הממלאים תפקיד מרכזי בפיזיולוגיה של הפונדקאי, בעיכול, בספיגת חומרים מזינים, בהבשלת מערכת החיסון ובמניעת חדירת פתוגנים. עבור בריאות אופטימלית של בעלי חיים ופרודוקטיביות, זה הכרחי לאפיין מיקרואורגניזמים אלה ולהבין את תפקידם. בעוד GIT של עופות מחזיק מאגר של מיקרואורגניזמים עם יישומים פרוביוטיים פוטנציאליים, רוב המגוון עדיין לא נחקר. כדי לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרואורגניזמים הבלתי מתורבתים, נדרשים מאמצים מרוכזים להביא את המיקרואורגניזמים האלה לתרבית. בידוד וטיפוח של מיקרואורגניזמים המתיישבים ב-GIT מניבים חומרים הניתנים לשחזור, כולל תאים, דנ"א ומטבוליטים, ומציעים תובנות חדשות על תהליכים מטבוליים בסביבה. ללא טיפוח, תפקידם של אורגניזמים אלה בסביבתם הטבעית נותר לא ברור ומוגבל לרמה תיאורית. מטרתנו היא ליישם אסטרטגיות גידול שמטרתן לשפר את הבידוד של מגוון רחב של חיידקים אנאירוביים מה-GIT של התרנגולת, תוך מינוף ידע רב-תחומי מפיזיולוגיה של בעלי חיים, תזונת בעלי חיים, מטגנומיקה, ביוכימיה של מזון ואסטרטגיות גידול מודרניות. בנוסף, אנו שואפים ליישם שימוש בשיטות עבודה נכונות לדגימה, שינוע והכנה תקשורתית, הידועות כמשפיעות על הצלחת הבידוד. מתודולוגיות מתאימות צריכות להבטיח סביבה עקבית נטולת חמצן, תנאים אטמוספריים אופטימליים, טמפרטורת דגירה מתאימה של המאכסן ומתן דרישות תזונתיות ספציפיות בהתאם לצרכים הייחודיים שלהם. על ידי ביצוע מתודולוגיות אלה, גידול לא רק יניב תוצאות ניתנות לשחזור עבור בידוד, אלא גם יקל על הליכי בידוד, ובכך לטפח הבנה מקיפה של המערכת האקולוגית המיקרוביאלית המורכבת בתוך GIT של תרנגולת.

Introduction

תחיית הטיפוח בחקר מיקרואורגניזמים השלימה תובנות ממחקרים מטאגנומיים בכך שסיפקה חומר לבדיקת השערות מטבוליות שתוארו וכומתו בעבר רק באופן חלקי. גידול חיידקי מעיים מספק חומר כדי לקיים מחקר עתידי על אינטראקציות מיקרוביאליות-מארחות, להקל על מחקרי קולוניזציה ממוקדים, ולשפר את מחקרי האינטראקציה המולקולרית 1,2,3. הידע שנצבר על מיקרואורגניזמים במערכת העיכול שיפר את התזונה והרווחה של בעלי החיים על ידי השפעה על נוסחאות תזונה ושיפור זמינות החומרים המזינים4. הבנה זו תרמה לשיפור הביצועים בשימוש באינטראקציה פרה-ביוטית ופרוביוטית. עם זאת, נדרש מחקר מעמיק כדי להשיג הבנה מלאה של האופן שבו תנאים ביוכימיים ופיסיקוכימיים מתקשרים ומשפיעים על הפרופיל המיקרוביאלי והמבנה שלו. כדי להשיג מטרה זו, הטיפוח נותר הכרחי, ומשמש ככלי חיוני להתעמק בדינמיקה המורכבת של קהילות מיקרוביאליות בסביבת מערכת העיכול.

בניגוד למחקר המקיף על מיקרובים הקשורים למעי האנושי ולמחקרי טיפוח קליניים5, דיווחים על מיקרואורגניזמים מבעלי חיים השתמשו בעיקר במגוון מוגבל של מדיה לבידוד, מה שעלול להגביל את מגוון המבודדים 2,3. יתר על כן, שיפורים בניסוח המדיה ומחקרים על האינטראקציה של פוספט ומלחים עם אגר, כפי שהובהרו על ידי Tanaka et al. ו- Kawasaki et al., עדיין לא יושמו עבור מחקרי מיקרוביום המעי 6,7,8,9.

מיו-אינוסיטול (MI), הנחשב לחומר חיוני למחצה, דווח כממלא תפקיד מרכזי במגוון תהליכים מטבוליים, פיזיולוגיים ורגולטוריים10,11. אלה כוללים מעורבות במינרליזציה של העצם, התפתחות שרירי השד, איתות תאי, קידום ביוץ ופוריות, אפנון איתות עצבי, ופועל כמווסת של הומאוסטזיס גלוקוז וויסות אינסולין בעופות10,11. MI ממלא תפקיד כקודמן באמצעות ההמרה ההדדית שלו בתוך תהליכים ביוכימיים מרכזיים, כולל תהליך גליקוליזה/גלוקונאוגנזה, מחזור חומצת לימון ומסלול פנטוז פוספט. בנוסף, הוא משמש גם כקודמן של פוספטידילינוזיטול (PI), אשר מעורב עוד יותר במטבוליזם של גליצרופוספוליפידים12. מחקרים מעטים דיווחו כי חילוף החומרים של MI מוביל לשינויים ביציבות העצם ובביצועי בעלי חיים. זה כולל שיפורים בשיעור המרת המזון ועלייה במשקל הגוף, מה שמדגים את השפעתו לאחר ספיגה וניצול בקרב בעל החיים13,14. עם זאת, מסלול חילוף החומרים של MI והשפעתו על חילוף החומרים של העופות נותר חמקמק15. יתר על כן, מחקרים מעטים מציעים תפקיד פוטנציאלי של חיידקים בניצול MI, במיוחד באזורים של פעילות מטבולית גבוהה כגון ileum 16,17,18,19.

המאמצים לטיפוח חיידקים מ-GIT של בעלי חיים נועדו לשפר את מאגרי המידע הגנומיים ולהרחיב את המחקר, לאמת השערות מבוססות גנום ולהבין את החשיבות האקולוגית של משאבים אלה20. מטרת עבודה זו היא לשפר אסטרטגיות לגידול חיידקים מה- GIT של עוף כדי לשפר את מגוון הבידוד ואת הבידוד הממוקד של קבוצת עניין אקולוגית המטמיעה ומעכבת מיו-אינוסיטול.

Protocol

הפרוטוקול מחולק לארבעה חלקים: דגימה, בידוד חיידקים, זיהוי ושימור המיקרואורגניזמים המתקבלים. הרשאות מאושרות לשימוש בבעלי חיים הונפקו על ידי הוועדה האתית של Regierungspräsidium Tübingen, גרמניה עם מספרי האישור HOH50/17 TE ו- HOH67-21TE.

1. קבלת דגימות לטיפוח חיידקים אנאירוביים

  1. אחזקת בעלי חיים
    1. החזיקו בעלי חיים בתזונה מסחרית המבוססת על תירס (Legehennen/Junghennenfutter; ראו טבלת חומרים) והתמקמו בתחנת הניסויים של אוניברסיטת הוהנהיים.
  2. הכנת פתרון תחבורה
    1. 1-2 ימים לפני איסוף הדגימה, להכין את פתרון הובלה המכיל 1.00 גרם / ליטר נתרן thioglycolate, 0.10 גרם / L סידן כלוריד dihydrate (CaCl2.2H 2O), ו 0.5% של ציסטאין21 ו 0.1% נתרן resazurin פתרון.
    2. התאם את ה- pH של המדיום ל- 6.0 ±- 0.2 ב- 25 ° C ואת autoclave ב- 121 ° C למשך 15 דקות בלחץ של 15 psi.
    3. לאחר שהתווך התקרר לכ-50 מעלות צלזיוס, החליפו את פקק הבקבוק הבינוני בפקק בורג סטרילי בפקק משעמם וגומי. הכנס שתי מחטי מזרק סטריליות לפקק הגומי במיקומים שונים והצמיד מסנן מזרק הידרופובי (0.22 מיקרומטר) לאחת המחטים.
      הערה: החלפת פקקים והחדרת מחטים ומסנן צריכה להתבצע בתוך זרימת אוויר למינרית (LAF).
    4. חבר את צינור 100% החנקן (N2) למסנן המזרק, ושפך גז N2 לתוך הבקבוק למשך 10 דקות ב- 1 psi.
    5. לאחר מכן, מעבירים את הבקבוק הבינוני ואת צינורות ההונגט הסטריליים לתחנה האנאירובית ומעבירים את אמצעי ההובלה לצינורות ההונגט. מלא לחלוטין את צינורות Hungate למעלה, להבטיח היעדר כל אוויר בפנים.
  3. שחיטה ואיסוף דוגמאות
    1. במהלך תהליך השחיטה, יש לשמור על תנאים אקסניים כדי למנוע זיהום על ידי שימוש בכפפות, מסכה, סינר מעבדה מפלסטיק וכלי ניתוח סטריליים לאורך כל ההליך. יתר על כן, יש לחטא כראוי את ספסל העבודה באמצעות אתנול ורקמות כדי לשמור על סביבה סטרילית.
    2. בתחנת הניסוי, הרדימו תרנגולות מטילות בנות 10, 50 שבועות באמצעות תערובת גז בבקבוקים המורכבת מ-35% N2, 35% CO2 ו-30% O2 וערפו מיד את ראשיהן.
      הערה: ההרדמה וההקרבה צריכות להתבצע על ידי טכנאי חיות מעבדה הבקיא ברווחת בעלי חיים ובהליכים מדעיים. זה מבטיח כי הליך ההקרבה עומד בסטנדרטים אתיים, תקנות משפטיות והנחיות בטיחות.
    3. לפני שתמשיך עם הדיסקציה של קטע GIT, לאבטח את קטע המעי הנדרש, כלומר היבול, ileum, ו jejunum, באמצעות סטרילי Kelly hemostat (הידוע גם בשם מהדק קלי; איור 1).
      הערה: נתיחת החיה צריכה להתבצע על ידי וטרינר או אדם מאומן היטב המכיר את האנטומיה של תרנגולות.
    4. מעבירים כל חלק בנפרד לצינור תלוי נפרד מלא באמצעי הובלה וסוגרים את המכסה כראוי. במידת הצורך, הוסף אמצעי הובלה נוסף לצינור כדי להזיז את האוויר שנותר.
      הערה: העברת המקטע היא צעד מכריע, וחיוני למזער כל עיכוב או פתיחה של המקטע כדי למנוע חשיפה ממושכת לחמצן
  4. הובלת מדגם
    1. טפל בהובלה של צינורות Hungate בזהירות, והניחו אותם בתוך קופסת קלקר כדי למנוע כל סכנת שבירה. במקרה שהטמפרטורה החיצונית נמוכה מ -15 מעלות צלזיוס, שמור על טמפרטורת הדגימה באמצעות חבילות חמות. ודא שזמן ההובלה אינו עולה על 4 שעות.
    2. מעבירים את הצינורות בזהירות בתוך התחנה האנאירובית להמשך תהליך.

2. בידוד חיידקים אנאירוביים

  1. הכנת מדיה תרבותית
    הערה: השיטה המתוארת מציגה שיקולים שונים להכנת מדיה תרבותית. טבלה 1 מדגימה דוגמה לאופן שבו מחולקים פתרונות לבידוד מגוון של מיקרואורגניזמים.
    1. חלק את המרכיבים של נוסחת המדיה לשימוש בארבע קבוצות תמיסה: מקור פחמן, מקור חנקן, אגר ומקור מינרלים. עבור מדיה עשירה כמו עירוי מוח-לב (BHI), ההפרדה אינה תמיד אפשרית (ראו דוגמה של מדיום 2 בטבלה 1). במקרים כאלה, הקפידו על הכנה נפרדת ואוטוקלאבינג של אגר או פתרונות נוספים.
    2. הכינו את תמיסת הפחמימותברבע מהנפח הסופי של המדיה הנדרשת, למשל, ב-250 מ"ל לנפח כולל של 1 ליטר מדיה. בעקבות הדוגמה של מדיום 1 בטבלה 1, להמיס 2 גרם של דקסטרוז ו 0.5 גרם של עמילן ב 250 מ"ל של מים מזוקקים.
    3. הכינו את תמיסת החלבוןב-1 /4 מהנפח הסופי של המדיה הנדרשת, למשל ב-250 מ"ל לקבלת נפח כולל של 1 ליטר מדיה. בעקבות הדוגמה של מדיום 1 בטבלה 1, יש להמיס 10 גרם פפטון ב-250 מ"ל מים מזוקקים.
    4. הכינו תמיסת אגר ב-45% עד 48% מהנפח הסופי של המדיה, למשל ב-450 עד 480 מ"ל לנפח כולל של 1 ליטר מדיה. בעקבות הדוגמה של mediu 1 בטבלה 1, להמיס 15 גרם של אגר ב 450 עד 480 מ"ל של מים מזוקקים.
    5. הכן את הפתרון מינרלי שמאל 20 עד 50 מ"ל נפח של מדיה כאשר נפח הסופי של המדיה הוא 1 L. בעקבות הדוגמה של מדיום 1 בטבלה 1, יש להמיס 0.5 גרם של K2HPO4 ב-20 עד 50 מ"ל מים מזוקקים.
    6. Autoclave תמיסת חלבון, תמיסת אגר, ותמיסות מינרליות ב 121 ° C במשך 15 דקות בלחץ 21 psi. Autoclave תמיסת פחמימות ב 110 ° C במשך 30 דקות ב 5 psi.
    7. ברגע שכל התמיסות סטריליות, מקררים אותן ל-50 מעלות צלזיוס ומערבבים בתנאים סטריליים לבקבוק זכוכית אוטוקלאבי מתאים עם פקק עם משעמם ופקק גומי. לאחר מכן, בצע את השלבים 1.2.3 ו- 1.2.4.
      הערה: ערבוב התמיסות צריך להיעשות בתוך LAF.
    8. לאחר ערבוב ופירוק הגזים, שפכו לתוך צלחות פטרי סטריליות או צינורות בתוך התחנה האנאירובית.
  2. בידוד חיידקים אנאירוביים
    הערה: המתודולוגיה הבאה מסבירה אסטרטגיית בידוד לטיפוח מגוון רחב של חיידקים אנאירוביים המאכלסים את מערכת העיכול של עוף.
    1. העבירו את הדגימות לתחנה אנאירובית המכילה תערובת גז בבקבוקים המורכבת מ-80% N2 (רמת איכות 5.0), 15%CO2 (רמת איכות 3.0) ו-5% H2 (רמת איכות 5.0) שסופקה על ידי ספק מסחרי (ראה טבלת חומרים).
    2. בתוך התחנה האנאירובית, מעבירים את הקטע מצינור ההונגטה לצלחת הפטרי הסטרילית באמצעות מלקחיים אוטוקלאביים.
    3. בזהירות לפתוח את החלק באמצעות זוג סטרילי של מספריים לחלץ כ 1 גרם של תוכן digesta מקטע המעי באמצעות מרית סטרילית.
      הערה: לאחר נטילת 1 גרם של תכולת digesta, יש לגרד ולהעביר את שארית העיכול לצינור המדיה המתאים להובלה לצורך בידוד ממוקד.
    4. בצע דילול סדרתי פי 10 באמצעות תמיסה פיזיולוגית סטרילית (0.85% NaCl).
    5. מוציאים 0.1 מ"ל מהדגימה מדילול 10-4 עד 10-7 לצלחות פטרי סטריליות ומסומנות כראוי ומורחים עם שפכטל סטרילי של דריגלסקי.
    6. לדגור את הצלחות בתוך התחנה האנאירובית במשך 24-48 שעות ב 39 ° C.
      הערה: כאשר דוגרים בתוך אינקובטור, מעבירים את צלחות הפטרי לקופסה אטומה לפני שמוציאים את צלחות הפטרי מהתחנה האנאירובית.
  3. בידוד ממוקד של קבוצת חיידקים ספציפית.
    הערה: המתודולוגיה הבאה מסבירה אסטרטגיית בידוד עבור חיידקים אנאירוביים שעלולים להטמיע MI.
    1. להכנת מדיום העשרה, מדיום אגר מינימלי ומדיום מרק מינימלי, יש לעקוב אחר ההרכב המפורט בטבלה 2 ובטבלה 3, תוך הקפדה על ההנחיות המפורטות בשלב 2.1. הוסף 0.2 מ"ל / ליטר של תערובת ויטמינים סטרילית מסנן (כפי שמתואר בהרכב) לתוך מדיה אגר מינימלי מדיה מרק מינימלי לאחר תהליך autoclaving.
    2. הומוגניזציה של הדגימה הראשונית באמצעות מערבל מערבולת במשך 10-15 שניות. לאחר מכן, מעבירים את הדגימה ההומוגנית לצינור המכיל מדיום העשרה בשיעור של 5% (למשל אם נפח אמצעי ההעשרה הוא 10 מ"ל, יש לחסן 0.5 מ"ל של דגימה הומוגנית) באמצעות פיפטה. לדגור על הדגימה המחוסנת הטרייה במשך 24 שעות ב 39 מעלות צלזיוס בתוך התחנה האנאירובית.
    3. לאחר הדגירה, מערבבים היטב את הצינור המועשר באמצעות מערבל מערבולת במשך 10-15 שניות או על ידי פיפטינג. לאחר מכן, להעביר את הדגימה המעורבת למדיום מרק מינימלי סטרילי בשיעור של 5% ולאחר מכן לדגור במשך 24 שעות ב 39 מעלות צלזיוס.
    4. מדללים באופן סדרתי את הדגימות בתמיסת מלח סטרילית (כלומר, 0.85% NaCl), החל מדילול 1:10 וממשיכים עד דילול 1:1000. לאחר כל דילול, הומוגניזציה יסודית של הדגימה בטמפרטורת החדר באמצעות מערבל מערבולת במשך 10-15 שניות או על ידי פיפטינג.
    5. בתנאים סטריליים ואנאירוביים, להעביר 1 מ"ל של דגימה מדוללת לצלחת פטרי. יוצקים כ-15-20 מ"ל של אגר בינוני מינימלי מומס לתוך צלחת הפטרי ומערבלים בעדינות אופקית לערבוב אחיד.
      הערה: הטמפרטורה של אגר צריכה להיות סביב 45 °C (75 °F), כך שלא יהיו גושים וכדי למנוע את הרג הדגימה על ידי חום. מזיגה בינונית צריכה להיעשות בתנאים אנאירוביים.
    6. לאחר התמצקות האגר, יש לדגור על צלחות הפטרי במשך 24 שעות בטמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס במצב הפוך בתוך תחנה אנאירובית או באינקובטור. לאחר 24 שעות של דגירה, מושבות חיידקים מופיעות כנקודות קטנות ומובחנות המוטבעות במדיה.
      הערה: בעת הדגירה על צלחת הפטרי בתוך אינקובטור, מעבירים את הצלחות לקופסה אטומה לפני שמוציאים אותן מתחנה אנאירובית.
    7. בעזרת לולאת חיסון סטרילית, בחרו בזהירות מושבת חיידקים בודדת והעבירו אותה לצינורות נפרדים בעלי מדיום מרק מינימלי.
    8. לאחר העברת המושבות לצינורות בודדים, דוגרים אנאירובית על הצינורות המחוסנים ב 39 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר הדגירה, עכירות מוגברת בתקשורת תצביע על צמיחת חיידקים.
      הערה: בכל פעם לפני העברת בקבוקי המדיה בתוך התחנה האנאירובית, יש לפרק אותם מהגז כפי שהוזכר קודם לכן בשלב 2.1.7. שלבים 2-8 צריכים להתבצע בתוך התחנה האנאירובית.

3. זיהוי חיידקים אנאירוביים

  1. לחלץ DNA מתרביות של 24 שעות עד 48 שעות זמן דגירה, בעקבות פרוטוקול ליזה אנזימטי22.
  2. צנטריפוגה את התרבית ב 3000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant באמצעות פיפטה.
  3. לשטוף את הגלולה 2x עם מלוחים חוצצים פוספט (PBS) על ידי השעיה ב 2 מ"ל של PBS. הומוגניזציה של הדגימה באמצעות מערבל מערבולת במשך 10-15 שניות. חזור על שלב הצנטריפוגה ב 3000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולזרוק את supernatant בזהירות.
  4. להשעות את גלולת התא ב 0.2 מ"ל של PBS pH 7.4 ולדגור ב 50 ° C עם 1 U של lysozyme ו 1 U של mutanolysin רקומביננטי במשך 30 דקות, ולאחר מכן דגירה של 30 דקות ב 56 ° C עם 5 μL של proteinase K.
  5. יש להוסיף 4 μL יחידת RNAseA לכל צינור ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. צינורות צנטריפוגה ב 21168 x גרם למשך דקה אחת. לשחזר את supernatant ולטהר באמצעות חרוזים מגנטיים.
  6. ביצוע כימות DNA בשיטה פלואורומטרית בהתאם להוראות היצרן עבור ערכת כימות dsDNA (המוזכרת בטבלת החומרים).
    הערה: DNA שחולץ יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C.
  7. השתמש בדגימות DNA כתבניות להגברת PCR באמצעות הפריימרים 27f ו- 1492r23 בהתאם לתנאים המוצגים בטבלה 4. כדי להבטיח שתגובת ה-PCR הייתה מוצלחת, בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז בהתאם לשיטת אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל אגרוז באמצעות חיץ TAE 1X ו-1% אגרוז.
  8. לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרית כדי להיפטר מפריימרים, נוקלאוטידים ומזהמים אחרים.
  9. יש לשלוח את מוצר ה-PCR לריצוף Sanger לספק שירותי הריצוף המתאים.
    הערה: בנוסף לריצוף, ספקי שירות יכולים גם לספק שירותים הכוללים טיהור של מוצר ה-PCR בתוספת תשלום. ניתן לאחסן מוצרי PCR ב-4°C או ב-20°C-.
  10. לאחר קבלת תוצאות הריצוף בפורמט FASTA יחד עם קובץ כרומטוגרמה (בדרך כלל בפורמט ABI או SCF), נתח רצפים באמצעות כלים ביואינפורמטיקה. השתמש בתוכנה לניתוח רצפים כדי לפתוח ולהציג באופן חזותי את קובץ הכרומטוגרמה.
    הערה: האיכות הכוללת של הכרומטוגרמה נבדקה על בסיס פסגות ברורות וברורות ללא רעש מוגזם
  11. השווה אמפליקונים ויישר קו למינים הקרובים במסד הנתונים של RNA ריבוזומלי GenBank 16S שאינו מיותר מהמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) באמצעות כלי חיפוש יישור מקומי בסיסי (BLAST)24 ומסד הנתונים של הגנום Refseq.
    הערה: בעת שימוש ב- NCBI BLAST, העתק את כל רצף FASTA בסרגל החיפוש.

4. שימור תרביות חיידקים טהורות

  1. קצרו תאי חיידקים מתרבית מגודלת היטב של 24 שעות עד 48 שעות באמצעות צנטריפוגה (3000 x גרם למשך 10 דקות) או איסוף ביומסה מתרבית אקסנית על צלחת.
  2. להשהות את תרבית החיידקים בתמיסה סטרילית איזוטונית מתאימה (NaCl 0.85%) ולשטוף על ידי צנטריפוגה של תמיסה חיידקית ב 3000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  3. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית החיידקים בנפח קטן של תמיסה איזוטונית סטרילית (0.5 מ"ל). כדי להבטיח הסרה של שאריות מדיום גידול, חזור על הפעולה 1x.
  4. מרחפים את הגלולה ב-0.8 מ"ל עד 1 מ"ל תרבית סטרילית מרוכזים בינוניים ויוצרים הומוגניות בעזרת מערבל מערבולת למשך 5-10 שניות או על ידי פיפטינג עדין.
  5. העבר 0.5 מ"ל של תרחיף תאים לקריוביאל סטרילי ומסומן כראוי 1 מ"ל והוסף 0.5 מ"ל של תמיסת גליצרול 50% אוטוקלאבית. הומוגניזציה של הקריוביאל באמצעות מערבל מערבולת, ואחסנו במדף הקפאה בטמפרטורה של -80°C (איור 3).
    הערה: כל השלבים לפני העברת cryovials ל -80 °C צריך להיעשות בתוך התחנה אנאירובית.

תוצאות

ניטור תנאים אנאירוביים במהלך התחבורה
בשל תוספת של resazurin, השינוי בצבע של פתרון הובלה לוורוד לפני העברת הדגימה לתוך הצינור מצביע על הפרעה או כישלון בשמירה על תנאים אנאירוביים. לפיכך, הצינור שהראה שינוי צבע נמנע משימוש במהלך ההובלה ורק הצינורות שלא הראו שינוי צב?...

Discussion

מטרת מתודולוגיה זו היא לשפר את הגידול של חיידקי מעיים אנאירוביים על ידי שיפור איכות תנאי הדגימה, עיבוד הדגימות, ניסוח מדיה והכנה. יש לקחת בחשבון את התנאים הפיזיקוכימיים של הדגימות (pH, זמינות פחמן, חנקן וקו-פקטורים) בעת גיבוש אמצעי התרבית. בהשוואה לאוספי תרביות חיידקים שהת...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים או אישיים מתחרים הקשורים לעבודה המדווחת בתסריט זה.

Acknowledgements

המחברים מודים לתוכנית השותפות רחובות-הוהנהיים ול-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. פרויקט זה פותח במסגרת יחידת המחקר P-FOWL (עבור 2601).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidVWR20104.334
AgarVWR97064-332
Ammonium chlorideCarl RothP726.1
Anaerobic stationDon Whitley ScientificA35 HEPA
Butyric acidMerck8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate VWR97061-904
CentrifugeEppendorf5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)VWR1.05281.0010
CysteineVWR97061-204
DextroseVWR90000-908
Di-potassium hydrogen phosphateCarl RothP749.1
EDTACarl Roth8043.2
Legehennen/ JunghennenfutterDeutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany-
MagAttract HMW DNA KitQiagen67563
Magnesium chlorideCarl Roth2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))Westfalen Gase GmbH, Germany-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)A&A Biotechnology1017-10L
Myo-inositolCarl Roth4191.2
PBS 1XChemSolute8418.01
Potassium dihydrogen phosphateCarl Roth3904.2
Propionic acidCarl Roth6026.1
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2671
RNAse A QIAGEN Ribonuclease A (RNase A) 19101
Sodium chlorideVWR27800.291
Sodium resazurinVWR85019-296
Sodium thioglycolateSigma-Aldrich102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-FreeVWR97064-186
ThermocyclerBio-RadT100
TryptoneCarl Roth8952.1
Tween80Carl Roth9139.2
Vitamin mix (supplement)VWR968290NL
VortexStar Lab07127/92930
Yeast ExtractCarl Roth9257.05
β-D-FructoseVWR53188-23-1

References

  1. Wylensek, D., et al. A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity. Nat Comm. 11 (1), 6389 (2020).
  2. Medvecky, M., et al. Whole genome sequencing and function prediction of 133 gut anaerobes isolated from chicken caecum in pure cultures. BMC Geno. 19 (1), 561 (2018).
  3. Zenner, C., et al. Early-life immune system maturation in chickens using a synthetic community of cultured gut bacteria. mSystems. 6 (3), 1110-1128 (2021).
  4. Borda-Molina, D., et al. Effects on the ileal microbiota of phosphorus and calcium utilization, bird performance, and gender in japanese quail. Animals. 10 (5), 885 (2020).
  5. Bonnet, M., Lagier, J. C., Raoult, D., Khelaifia, S. Bacterial culture through selective and non-selective conditions: The evolution of culture media in clinical microbiology. New Micro New Infect. 34, 100622 (2020).
  6. Tanaka, T., et al. A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability. Appl Environ Microbiol. 80 (24), 7659-7666 (2014).
  7. Kawasaki, K., Kamagata, Y. Phosphate-catalyzed hydrogen peroxide formation from agar, gellan, and κ-carrageenan and recovery of microbial cultivability via catalase and pyruvate. Appl Environ Microbiol. 83 (21), e01366-e01417 (2017).
  8. Kato, S., et al. Isolation of previously uncultured slow-growing bacteria by using a simple modification in the preparation of agar media. Appl Environ Microbiol. 84 (19), e00807-e00818 (2018).
  9. Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nat Rev Microbiol. 19 (4), 225-240 (2021).
  10. Su, X. B., Ko, A. L. A., Saiardi, A. Regulations of myo-inositol homeostasis: Mechanisms, implications, and perspectives. Adv Biol Regul. 87, 2212-4926 (2023).
  11. Monastra, G., Dinicola, S., Unfer, V. . Physiological and pathophysiological roles of inositols in A clinical guide to inositols. , (2023).
  12. Kanehisa, M. Toward understanding the origin and evolution of cellular organisms. Prot Sci. 28 (11), 1947-1951 (2019).
  13. Lee, S. A., Nagalakshmi, D., Raju, M. V., Rao, S. V. R., Bedford, M. R. Effect of phytase superdosing, myo-inositol and available phosphorus concentrations on performance and bone mineralisation in broilers. Animal Nutri. 3 (3), 247-251 (2017).
  14. Farhadi, D., Karimi, A., Sadeghi, G., Rostamzadeh, J., Bedford, M. Effects of a high dose of microbial phytase and myo-inositol supplementation on growth performance, tibia mineralization, nutrient digestibility, litter moisture content, and foot problems in broiler chickens fed phosphorus-deficient diets. Poultry Sci. 96 (10), 3664-3675 (2017).
  15. Weber, M., Fuchs, T. M. Metabolism in the niche: A large-scale genome-based survey reveals inositol utilization to be widespread among soil, commensal, and pathogenic bacteria. Microbio Spect. 10 (4), e02013-e02022 (2022).
  16. Kawsar, H. I., Ohtani, K., Okumura, K., Hayashi, H., Shimizu, T. Organization and transcriptional regulation of myo-inositol operon in Clostridium perfringens. FEMS Microbiol Lett. 235 (2), 289-295 (2004).
  17. Hellinckx, J., Heermann, R., Felsl, A., Fuchs, T. M. High binding affinity of repressor IolR avoids costs of untimely induction of myo-inositol utilization by Salmonella Typhimurium. Sci Rep. 7 (1), 44362 (2017).
  18. Yebra, M. J., et al. Identification of a gene cluster enabling Lactobacillus casei BL23 to utilize myo-inositol. Appl Environ Microbiol. 73 (12), 3850-3858 (2007).
  19. Zhang, W. Y., et al. Comparative analysis of iol clusters in Lactobacillus casei strains. World J Microbiol Biotechnol. 26, 1949-1955 (2010).
  20. Labeda, D. P. . Bergey's manual of systematic bacteriology. , (2001).
  21. Peterson, L. R. Effect of media on transport and recovery of anaerobic bacteria. Clin Infect Dis. 25, 134-136 (1997).
  22. Ulrich, R. L., Hughes, T. A. A rapid procedure for isolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and other Gram-positive bacteria. Lett Appl Microbiol. 32 (1), 52-56 (2008).
  23. Relman, D. Universal bacterial 16s rRNA amplification and sequencing. Diag Mol Microbiol. , 489-495 (1993).
  24. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs. Nuc Acid Res. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  25. Rios-Galicia, B., et al. Novel taxonomic and functional diversity of eight bacteria from the upper digestive tract of chicken. Int J Syst Evol Microbiol. 74 (1), 006210 (2024).
  26. Lagier, J. C., et al. Microbial culturomics: Paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin Microbiol Infect. 18 (12), 1185-1193 (2012).
  27. Lagkouvardos, I., et al. The mouse intestinal bacterial collection (mibc) provides host-specific insight into cultured diversity and functional potential of the gut microbiota. Nat Microbiol. 1 (10), 1-15 (2016).
  28. Gilroy, R., et al. Extensive microbial diversity within the chicken gut microbiome revealed by metagenomics and culture. PeerJ. 9, e10941 (2021).
  29. Huang, P., et al. The chicken gut metagenome and the modulatory effects of plant-derived benzylisoquinoline alkaloids. Microbiome. 6 (1), 1-17 (2018).
  30. Zhang, Y., et al. Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads. GigaScience. 11, 116 (2022).
  31. Segura-Wang, M., Grabner, N., Koestelbauer, A., Klose, V., Ghanbari, M. Genome-resolved metagenomics of the chicken gut microbiome. Front Microbiol. 12, 726923 (2021).
  32. Borrelli, R. C., Fogliano, V., Monti, S. M., Ames, J. M. Characterization of melanoidins from a glucose-glycine model system. Euro Food Res Technol. 215, 210-215 (2002).
  33. Ferrario, C., et al. Untangling the cecal microbiota of feral chickens by culturomic and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 19 (11), 4771-4783 (2017).
  34. Crhanova, M., et al. Systematic culturomics shows that half of chicken caecal microbiota members can be grown in vitro except for two lineages of clostridiales and a single lineage of bacteroidetes. Microorganisms. 7 (11), 496 (2019).
  35. Rubio, L., et al. Lactobacilli counts in crop, ileum and caecum of growing broiler chickens fed on practical diets containing whole or dehulled sweet lupin (lupinus angustifolius) seed meal. British Poult Sci. 39 (3), 354-359 (1998).
  36. Bjerrum, L., et al. Microbial community composition of the ileum and cecum of broiler chickens as revealed by molecular and culture-based techniques. Poult Sci. 85 (7), 1151-1164 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved