Estratégias para melhorar o cultivo de bactérias anaeróbicas do trato gastrointestinal de frango

Resumo

O protocolo apresenta duas metodologias para melhorar o isolamento de bactérias anaeróbias intestinais. O primeiro se concentra no isolamento de uma gama diversificada de bactérias usando diferentes meios de cultura. O segundo enfoca as etapas de cultivo de um grupo microbiano específico, possivelmente assimilando o mio-inositol, para compreender completamente seu significado ecológico.

Resumo

O trato gastrointestinal (TGI) do frango é um ecossistema complexo que abriga trilhões de micróbios que desempenham um papel fundamental na fisiologia, digestão, absorção de nutrientes, maturação do sistema imunológico e prevenção da intrusão de patógenos do hospedeiro. Para uma ótima saúde e produtividade animal, é imperativo caracterizar esses microrganismos e compreender seu papel. Embora o TGI das aves contenha um reservatório de microrganismos com potenciais aplicações probióticas, a maior parte da diversidade permanece inexplorada. Para melhorar nossa compreensão da diversidade microbiana não cultivada, são necessários esforços conjuntos para trazer esses microrganismos para a cultura. O isolamento e o cultivo de microrganismos colonizadores de TGI produzem material reprodutível, incluindo células, DNA e metabólitos, oferecendo novos insights sobre os processos metabólicos no ambiente. Sem cultivo, o papel desses organismos em seus ambientes naturais permanece obscuro e limitado a um nível descritivo. Nosso objetivo é implementar estratégias de cultivo destinadas a melhorar o isolamento de uma gama diversificada de micróbios anaeróbios do TGI do frango, alavancando o conhecimento multidisciplinar da fisiologia animal, nutrição animal, metagenômica, bioquímica alimentar e estratégias modernas de cultivo. Além disso, pretendemos implementar o uso de práticas adequadas para amostragem, transporte e preparação de meios, que são conhecidas por influenciar o sucesso do isolamento. Metodologias apropriadas devem garantir um ambiente consistente e livre de oxigênio, condições atmosféricas ideais, temperatura de incubação do hospedeiro apropriada e provisão para requisitos nutricionais específicos em alinhamento com suas necessidades distintas. Ao seguir essas metodologias, o cultivo não apenas produzirá resultados reprodutíveis para isolamento, mas também facilitará os procedimentos de isolamento, promovendo assim uma compreensão abrangente do intrincado ecossistema microbiano dentro do GIT do frango.

Introdução

O ressurgimento do cultivo no estudo de microrganismos complementou os insights dos estudos metagenômicos, fornecendo material para testar hipóteses metabólicas que antes eram apenas parcialmente descritas e quantificadas. O cultivo de bactérias intestinais fornece material para sustentar pesquisas futuras sobre interações microbianas-hospedeiras, facilitar estudos de colonização direcionados e melhorar os estudos de interação molecular ^1,2,3. O conhecimento adquirido sobre microrganismos gastrointestinais melhorou a nutrição e o bem-estar an....

Protocolo

O protocolo é dividido em quatro partes: amostragem, isolamento bacteriano, identificação e preservação dos microrganismos obtidos. As permissões aprovadas para o uso de animais foram emitidas pela comissão de ética do Regierungspräsidium Tübingen, Alemanha, com os números de aprovação HOH50/17 TE e HOH67-21TE.

1. Obtenção de amostras para o cultivo de bactérias anaeróbias

1. Manutenção de animais
   1. Manter os animais em uma dieta comercial ad libitum à base de milho (Legehennen / Junghennenfutter; ver Tabela de Materiais) e abrigar na estação experiment....

Discussão

O objetivo desta metodologia é melhorar o cultivo de bactérias anaeróbicas intestinais, melhorando a qualidade das condições de amostragem, processamento de amostras e formulação e preparação de meios. As condições físico-químicas das amostras (pH, disponibilidade de carbono, nitrogênio e cofatores) devem ser levadas em consideração na formulação dos meios de cultura. Em comparação com coleções de culturas bacterianas obtidas de porcos, humanos ou camundongos

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1