Estratégias para melhorar o cultivo de bactérias anaeróbicas do trato gastrointestinal de frango

Resumo

O protocolo apresenta duas metodologias para melhorar o isolamento de bactérias anaeróbias intestinais. O primeiro se concentra no isolamento de uma gama diversificada de bactérias usando diferentes meios de cultura. O segundo enfoca as etapas de cultivo de um grupo microbiano específico, possivelmente assimilando o mio-inositol, para compreender completamente seu significado ecológico.

Resumo

O trato gastrointestinal (TGI) do frango é um ecossistema complexo que abriga trilhões de micróbios que desempenham um papel fundamental na fisiologia, digestão, absorção de nutrientes, maturação do sistema imunológico e prevenção da intrusão de patógenos do hospedeiro. Para uma ótima saúde e produtividade animal, é imperativo caracterizar esses microrganismos e compreender seu papel. Embora o TGI das aves contenha um reservatório de microrganismos com potenciais aplicações probióticas, a maior parte da diversidade permanece inexplorada. Para melhorar nossa compreensão da diversidade microbiana não cultivada, são necessários esforços conjuntos para trazer esses microrganismos para a cultura. O isolamento e o cultivo de microrganismos colonizadores de TGI produzem material reprodutível, incluindo células, DNA e metabólitos, oferecendo novos insights sobre os processos metabólicos no ambiente. Sem cultivo, o papel desses organismos em seus ambientes naturais permanece obscuro e limitado a um nível descritivo. Nosso objetivo é implementar estratégias de cultivo destinadas a melhorar o isolamento de uma gama diversificada de micróbios anaeróbios do TGI do frango, alavancando o conhecimento multidisciplinar da fisiologia animal, nutrição animal, metagenômica, bioquímica alimentar e estratégias modernas de cultivo. Além disso, pretendemos implementar o uso de práticas adequadas para amostragem, transporte e preparação de meios, que são conhecidas por influenciar o sucesso do isolamento. Metodologias apropriadas devem garantir um ambiente consistente e livre de oxigênio, condições atmosféricas ideais, temperatura de incubação do hospedeiro apropriada e provisão para requisitos nutricionais específicos em alinhamento com suas necessidades distintas. Ao seguir essas metodologias, o cultivo não apenas produzirá resultados reprodutíveis para isolamento, mas também facilitará os procedimentos de isolamento, promovendo assim uma compreensão abrangente do intrincado ecossistema microbiano dentro do GIT do frango.

Introdução

O ressurgimento do cultivo no estudo de microrganismos complementou os insights dos estudos metagenômicos, fornecendo material para testar hipóteses metabólicas que antes eram apenas parcialmente descritas e quantificadas. O cultivo de bactérias intestinais fornece material para sustentar pesquisas futuras sobre interações microbianas-hospedeiras, facilitar estudos de colonização direcionados e melhorar os estudos de interação molecular ^1,2,3. O conhecimento adquirido sobre microrganismos gastrointestinais melhorou a nutrição e o bem-estar animal, influenciando as formulações dietéticas e aumentando a disponibilidade de nutrientes⁴. Esse entendimento contribuiu para melhorias de desempenho na utilização da interação prebiótica e probiótica. No entanto, pesquisas aprofundadas são necessárias para obter uma compreensão completa de como as condições bioquímicas e físico-químicas interagem e afetam o perfil microbiano e sua estrutura. Para atingir esse objetivo, o cultivo continua sendo imperativo, servindo como uma ferramenta crucial para aprofundar a intrincada dinâmica das comunidades microbianas no ambiente gastrointestinal.

Em contraste com a extensa pesquisa sobre micróbios associados ao intestino humano e estudos clínicos de cultivo⁵, os relatórios sobre microrganismos da pecuária utilizaram predominantemente uma gama limitada de meios para isolamento, potencialmente restringindo a diversidade de isolados ^2,3. Além disso, melhorias na formulação de meios e estudos sobre a interação de fosfato e sais com ágar, conforme elucidado por Tanaka et al. e Kawasaki et al., ainda não foram implementados para estudos de microbioma intestinal 6,7,8,9.

Considerada uma substância semi-essencial, o mio-inositol (IM) tem sido relatado como desempenhando um papel fundamental em diversos processos metabólicos, fisiológicos e regulatórios^10,11. Estes incluem envolvimento na mineralização óssea, desenvolvimento do músculo mamário, sinalização celular, promoção da ovulação e fertilidade, modulação da sinalização neuronal e atuação como regulador da homeostase da glicose e regulação da insulina em aves^10,11. O IM desempenha um papel como precursor por meio de sua interconversão em processos bioquímicos essenciais, incluindo o processo de glicólise / gliconeogênese, o ciclo do ácido cítrico e a via da pentose fosfato. Além disso, também serve como precursor do fosfatidilinositol (PI), que está ainda mais envolvido no metabolismo glicerofosfolipídeo¹². Poucas investigações relataram que a metabolização do IM leva a alterações na estabilidade óssea e no desempenho animal. Isso inclui melhorias na taxa de conversão alimentar e ganho de peso corporal, demonstrando seu impacto após a absorção e utilização dentro do animal^13,14. No entanto, a via de metabolização do IM e seu impacto no metabolismo das aves permanece indefinida15. Além disso, poucos estudos propõem um papel potencial das bactérias na utilização do IM, particularmente em regiões de alta atividade metabólica, como o íleo 16,17,18,19.

Os esforços no cultivo de bactérias a partir do TGI de animais visam aprimorar os bancos de dados genômicos e expandir a pesquisa, verificar hipóteses baseadas no genoma e entender a importância ecológica desses recursos²⁰. O objetivo deste trabalho é melhorar as estratégias de cultivo bacteriano a partir do TGI de frango para aumentar a diversidade de isolamento e o isolamento direcionado de um grupo ecológico de interesse que assimila e metaboliza o mio-inositol.

Protocolo

O protocolo é dividido em quatro partes: amostragem, isolamento bacteriano, identificação e preservação dos microrganismos obtidos. As permissões aprovadas para o uso de animais foram emitidas pela comissão de ética do Regierungspräsidium Tübingen, Alemanha, com os números de aprovação HOH50/17 TE e HOH67-21TE.

1. Obtenção de amostras para o cultivo de bactérias anaeróbias

1. Manutenção de animais
   1. Manter os animais em uma dieta comercial ad libitum à base de milho (Legehennen / Junghennenfutter; ver Tabela de Materiais) e abrigar na estação experimental da Universidade de Hohenheim.
2. Preparação da solução de transporte
   1. Aos 1-2 dias antes da coleta da amostra, prepare a solução de transporte contendo 1,00 g/L de tioglicolato de sódio, 0,10 g/L de cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl_{2,2H 2}O) e 0,5% de cisteína²¹ e 0,1% de solução de resazurina sódica.
   2. Ajuste o pH do meio para 6,0 ± 0,2 a 25 °C e autoclave a 121 °C por 15 min a 15 psi de pressão.
   3. Depois de o meio ter arrefecido até cerca de 50 °C, volte a colocar a tampa do frasco de meio com uma tampa de rosca estéril com um orifício e uma rolha de borracha. Insira duas agulhas de seringa estéreis na rolha de borracha em posições diferentes e fixe um filtro de seringa hidrofóbico (0,22 μm) em uma das agulhas.
      NOTA: A substituição das tampas e a inserção das agulhas e do filtro devem ser realizadas dentro de um fluxo de ar laminar (LAF).
   4. Conecte o tubo de nitrogênio 100% (N₂) ao filtro da seringa e espalhe o gás N₂ no frasco por 10 min a 1 psi.
   5. Em seguida, transfira o frasco médio e os tubos Hungate estéreis para a estação anaeróbica e transfira assepticamente o meio de transporte para os tubos Hungate. Encha completamente os tubos Hungate até o topo, garantindo a ausência de ar no interior.
3. Abate e colheita de amostras
   1. Durante o processo de abate, mantenha as condições axênicas para evitar contaminação usando luvas, máscara, avental de laboratório de plástico e instrumentos cirúrgicos estéreis durante todo o procedimento. Além disso, higienize adequadamente a bancada de trabalho usando etanol e lenços de papel para manter um ambiente estéril.
   2. Na estação experimental, anestesiar 10 poedeiras Lohmann de 50 semanas usando uma mistura de gás engarrafado consistindo de 35% de N₂, 35% de CO₂ e 30% de O₂ e decapitá-las imediatamente.
      NOTA: A anestesia e o sacrifício devem ser conduzidos por um técnico de animais de laboratório bem versado em bem-estar animal e procedimentos científicos. Isso garante que o procedimento de sacrifício esteja de acordo com os padrões éticos, regulamentos legais e diretrizes de segurança.
   3. Antes de prosseguir com a dissecção da secção GIT, fixe o segmento intestinal necessário, nomeadamente a cultura, o íleo e o jejuno, utilizando um hemostático de Kelly estéril (também conhecido como pinça de Kelly; Figura 1).
      NOTA: A dissecação do animal deve ser realizada por um veterinário ou por uma pessoa bem treinada que esteja familiarizada com a anatomia das galinhas.
   4. Transfira cada seção individual para um tubo Hungate separado cheio de meio de transporte e feche a tampa corretamente. Se necessário, adicione meio de transporte extra ao tubo para deslocar o ar restante.
      NOTA: A transferência da seção é uma etapa crucial e é essencial minimizar qualquer atraso ou abertura da seção para evitar a exposição prolongada ao oxigênio
4. Transporte de amostra
   1. Manuseie o transporte dos tubos Hungate com cuidado, colocando-os dentro de uma caixa de isopor para evitar qualquer risco de quebra. Caso a temperatura exterior seja inferior a 15 °C, manter a temperatura da amostra utilizando compressas quentes. Certifique-se de que o tempo de transporte não exceda 4 h.
   2. Transfira os tubos cuidadosamente dentro da estação anaeróbica para posterior processo.

2. Isolamento de bactérias anaeróbias

1. Preparação de meios de cultura
   NOTA: O método descrito apresenta várias considerações para a preparação de meios de cultura. A Tabela 1 ilustra um exemplo de como as soluções são divididas para o isolamento diversificado de microrganismos.
   1. Divida os ingredientes da formulação do meio a ser usado em quatro grupos de solução: fonte de carbono, fonte de nitrogênio, ágar e fonte mineral. Para meios ricos como a infusão cérebro-coração (BHI), a separação nem sempre é possível (ver exemplo do meio 2 na Tabela 1). Nesses casos, assegure a preparação separada e a autoclavagem do ágar ou de soluções adicionais.
   2. Prepare a^{solução de carboidratos} em 1/4 do volume final de meio necessário, por exemplo, em 250 mL para um volume total de 1 L de meio. Seguindo o exemplo do meio 1 na Tabela 1, dissolver 2 g de dextrose e 0,5 g de amido em 250 mL de água destilada.
   3. Prepare a^{solução de proteína} em 1/4 do volume final de meio necessário, por exemplo, em 250 mL para um volume total de 1 L de meio. Seguindo o exemplo do meio 1 na Tabela 1, dissolver 10 g de peptona em 250 mL de água destilada.
   4. Prepare a solução de ágar em 45% a 48% do volume final do meio, por exemplo, em 450 a 480 mL para um volume total de 1 L de meio. Seguindo o exemplo do meio 1 na Tabela 1, dissolver 15 g de ágar em 450 a 480 mL de água destilada.
   5. Prepare a solução mineral no volume esquerdo de 20 a 50 mL de meio quando o volume final do meio for de 1 L. Seguindo o exemplo do meio 1 na Tabela 1, dissolva 0,5 g de K₂HPO₄ em 20 a 50 mL de água destilada.
   6. Autoclave a solução proteica, a solução de ágar e as soluções minerais a 121 °C por 15 min a 21 psi de pressão. Autoclave a solução de carboidratos a 110 °C por 30 min a 5 psi.
   7. Quando todas as soluções estiverem estéreis, arrefecê-las até 50 °C e misturar em condições estéreis num frasco de vidro autoclavado adequado com uma tampa com um orifício e uma rolha de borracha. Depois disso, siga as etapas 1.2.3 e 1.2.4.
      NOTA: A mistura das soluções deve ser feita dentro de um LAF.
   8. Depois que o meio for misturado e desgaseificado, despeje em placas ou tubos de Petri estéreis dentro da estação anaeróbica.
2. Isolamento de bactérias anaeróbias
   NOTA: A metodologia a seguir explica uma estratégia de isolamento para cultivar uma ampla gama de bactérias anaeróbicas que habitam o trato digestivo do frango.
   1. Transferir as amostras para uma estação anaeróbia contendo uma mistura de gases engarrafados composta por 80% de N₂ (nível de qualidade 5,0), 15% de CO₂ (nível de qualidade 3,0) e 5% de H₂ (nível de qualidade 5,0) fornecida por um fornecedor comercial (ver Quadro de Materiais).
   2. Dentro da estação anaeróbica, transfira a seção do tubo suspenso para a placa de Petri estéril usando uma pinça autoclavada.
   3. Corte cuidadosamente a seção usando uma tesoura estéril e extraia aproximadamente 1 g de conteúdo de digesta do segmento intestinal usando uma espátula estéril.
      NOTA: Depois de tomar 1 g de conteúdo de digesta, descarte e transfira a digesta restante para seu respectivo tubo de meio de transporte para o isolamento direcionado.
   4. Realize uma diluição seriada de 10 vezes usando uma solução fisiológica estéril (NaCl 0,85%).
   5. Dispense 0,1 mL da amostra das diluições 10−4 a 10−7 em placas de mídia de placas de Petri estéreis e devidamente rotuladas e espalhe com um espator Drigalski estéril.
   6. Incubar as placas no interior da estação anaeróbica durante 24–48 h a 39 °C.
      NOTA: Ao incubar dentro de uma incubadora, transfira as placas de Petri para uma caixa hermética antes de retirá-las da estação anaeróbica.
3. Isolamento direcionado de um grupo bacteriano específico.
   NOTA: A metodologia a seguir explica uma estratégia de isolamento para bactérias anaeróbicas que podem potencialmente assimilar o IM.
   1. Para a preparação de meio de enriquecimento, meio de ágar mínimo e meio de caldo mínimo, siga a composição especificada na Tabela 2 e na Tabela 3, seguindo as diretrizes descritas na etapa 2.1. Adicione 0,2 mL / L de mistura de vitaminas estéreis por filtro (conforme descrito na composição) em meio de ágar mínimo e meio de caldo mínimo após o processo de autoclavagem.
   2. Homogeneizar a amostra inicial usando um misturador de vórtice por 10-15 s. Em seguida, transfira a amostra homogeneizada para o tubo contendo o meio de enriquecimento a uma taxa de 5% (por exemplo, se o volume do meio de enriquecimento for de 10 mL, inocule 0,5 mL de amostra homogeneizada) usando uma pipeta. Incubar a amostra recém-inoculada durante 24 h a 39 °C no interior da estação anaeróbia.
   3. Após a incubação, misture bem o tubo enriquecido usando um misturador de vórtice por 10-15 s ou pipetando. Em seguida, transferir a amostra misturada para um meio de caldo mínimo estéril a uma taxa de 5% e depois incubar durante 24 h a 39 °C.
   4. Dilua as amostras em série em solução salina estéril (ou seja, NaCl a 0,85%), começando com uma diluição de 1:10 e continuando até a diluição de 1:1000. Após cada diluição, homogeneizar bem a amostra à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice por 10-15 s ou por pipetagem.
   5. Em condições estéreis e anaeróbicas, transferir 1 ml de amostra diluída para uma placa de Petri. Despeje aproximadamente 15-20 mL de meio de ágar mínimo derretido na placa de Petri e gire suavemente horizontalmente para uma mistura uniforme.
      NOTA: A temperatura do ágar deve ser de cerca de 45 °C para que não haja grumos e para evitar que a amostra seja morta pelo calor. O vazamento médio deve ser feito em condições anaeróbicas.
   6. Após a solidificação do ágar, incubar as placas de Petri durante 24 h a 39 °C na posição invertida dentro de uma estação anaeróbia ou em incubadora. Após 24 h de incubação, as colônias bacterianas aparecem como pequenos pontos distintos embutidos no meio.
      NOTA: Ao incubar a placa de Petri dentro de uma incubadora, transfira as placas para uma caixa hermética antes de retirá-las da estação anaeróbica.
   7. Usando uma alça de inoculação estéril, escolha cuidadosamente a colônia bacteriana individual e transfira-a para tubos separados de meio de caldo mínimo.
   8. Após a transferência das colônias para tubos individuais, incubar anaerobicamente os tubos inoculados a 39 °C por 24 h. Após a incubação, o aumento da turbidez no meio indicará o crescimento bacteriano.
      NOTA: Sempre que antes de transferir os frascos de mídia para dentro da estação anaeróbica, eles devem ser desgaseificados conforme mencionado anteriormente na etapa 2.1.7. As etapas 2 a 8 devem ser realizadas dentro da estação anaeróbica.

3. Identificação de bactérias anaeróbias

1. Extrair DNA de culturas de 24 h a 48 h de tempo de incubação, seguindo um protocolo de lise enzimática²².
2. Centrifugar a cultura a 3000 x g durante 10 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante com uma pipeta.
3. Lave o pellet 2x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) suspendendo em 2 mL de PBS. Homogeneizar a amostra usando um misturador de vórtice por 10-15 s. Repetir a etapa de centrifugação a 3000 x g durante 10 min a 4 °C e rejeitar cuidadosamente o sobrenadante.
4. Suspenda o pellet celular em 0,2 mL de PBS pH 7,4 e incube a 50 ° C com 1 U de lisozima e 1 U de mutanolisina recombinante por 30 min, seguido por uma incubação de 30 min a 56 ° C com 5 μL de proteinase K.
5. Adicione 4 μL de unidade de RNAseA a cada tubo e incube em temperatura ambiente por 10 min. Tubos de centrífuga a 21168 x g por 1 min. Recupere o sobrenadante e purifique usando esferas magnéticas.
6. Realize a quantificação do DNA com um método fluorométrico de acordo com as instruções do fabricante para o kit de quantificação de dsDNA (mencionado na Tabela de Materiais).
   NOTA: O DNA extraído pode ser armazenado a -20 °C.
7. Use amostras de DNA como modelos para amplificação por PCR usando os primers 27f e 1492r²³ seguindo as condições mostradas na Tabela 4. Para garantir que a reação de PCR foi bem-sucedida, execute a eletroforese em gel de agarose de acordo com o método padrão de eletroforese em gel de agarose usando tampão 1X TAE e 1% de agarose.
8. Purifique o produto de PCR usando um kit de purificação de PCR comercial para se livrar de primers, nucleotídeos e outros contaminantes.
9. Envie o produto de PCR para sequenciamento Sanger para o provedor de serviços de sequenciamento adequado.
   NOTA: Juntamente com o sequenciamento, os provedores de serviços também podem fornecer serviços, incluindo purificação do produto PCR com taxas extras. Os produtos de PCR podem ser armazenados a 4 °C ou a -20°C.
10. Depois de obter os resultados do sequenciamento no formato FASTA junto com o arquivo de cromatograma (geralmente no formato ABI ou SCF), analise as sequências usando ferramentas de bioinformática. Use o software de análise de sequência para abrir e visualizar o arquivo do cromatograma.
    NOTA: A qualidade geral do cromatograma foi verificada com base em picos claros e distintos sem ruído excessivo
11. Compare amplicons e alinhe-os com as espécies intimamente relacionadas no banco de dados de RNA ribossômico GenBank 16S não redundante do National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando a ferramenta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)²⁴ e o banco de dados do genoma Refseq.
    NOTA: Ao usar o NCBI BLAST, copie toda a sequência FASTA na barra de pesquisa.

4. Preservação de culturas bacterianas puras

1. Colha células bacterianas de uma cultura bem cultivada de 24 h a 48 h por centrifugação (3000 x g por 10 min) ou coleta de biomassa de uma cultura axênica em uma placa.
2. Suspender a cultura bacteriana numa solução isotónica estéril adequada (NaCl 0,85%) e lavar centrifugando a solução bacteriana a 3000 x g durante 10 min a 4 °C.
3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano em um pequeno volume de solução isotônica estéril (0,5 mL). Para garantir a remoção de qualquer resíduo de meio de crescimento, repita 1x.
4. Ressuspenda o pellet em 0,8 mL a 1 mL de concentrado de meio de cultura estéril e homogeneize com um misturador de vórtice por 5-10 s ou pipetando suavemente.
5. Transfira 0,5 mL de suspensão celular para um criovial estéril e devidamente rotulado de 1 mL e adicione 0,5 mL de solução autoclavada de glicerol a 50%. Homogeneizar o criogénio utilizando um misturador de vórtice e conservar numa grelha de congelação a -80 °C (figura 3).
   NOTA: Todas as etapas antes de transferir os criogenianos para -80 °C devem ser feitas dentro da estação anaeróbica.

Resultados

Monitoramento das condições anaeróbicas durante o transporte
Devido à adição de resazurina sódica, a mudança na cor da solução de transporte para rosa antes da transferência da amostra para o tubo indica uma interrupção ou falha na manutenção das condições anaeróbicas. Assim, os tubos com mudança de cor foram impedidos de serem usados durante o transporte e apenas os tubos sem mudança de cor foram usados, como pode ser visto na

Discussão

O objetivo desta metodologia é melhorar o cultivo de bactérias anaeróbicas intestinais, melhorando a qualidade das condições de amostragem, processamento de amostras e formulação e preparação de meios. As condições físico-químicas das amostras (pH, disponibilidade de carbono, nitrogênio e cofatores) devem ser levadas em consideração na formulação dos meios de cultura. Em comparação com coleções de culturas bacterianas obtidas de porcos, humanos ou camundongos

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1