Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokol, anaerobik bağırsak bakterilerinin izolasyonunu iyileştirmek için iki metodoloji sunar. Birincisi, farklı kültür ortamları kullanılarak çok çeşitli bakterilerin izolasyonuna odaklanır. İkincisi, ekolojik önemini tam olarak anlamak için muhtemelen miyo-inositol'ü asimile eden belirli bir mikrobiyal grubun yetiştirme adımlarına odaklanır.

Özet

Tavuğun gastrointestinal sistemi (GIT), konakçının fizyolojisinde, sindiriminde, besin emiliminde, bağışıklık sisteminin olgunlaşmasında ve patojen girişinin önlenmesinde çok önemli bir rol oynayan trilyonlarca mikropu barındıran karmaşık bir ekosistemdir. Optimal hayvan sağlığı ve verimliliği için, bu mikroorganizmaları karakterize etmek ve rollerini anlamak zorunludur. Kümes hayvanlarının GIT'i, potansiyel probiyotik uygulamalarına sahip bir mikroorganizma rezervuarına sahip olsa da, çeşitliliğin çoğu keşfedilmemiştir. Kültürlenmemiş mikrobiyal çeşitlilik konusundaki anlayışımızı geliştirmek için, bu mikroorganizmaları kültüre getirmek için ortak çabalar gerekmektedir. GIT kolonize edici mikroorganizmaların izolasyonu ve yetiştirilmesi, hücreler, DNA ve metabolitler dahil olmak üzere tekrarlanabilir materyal verir ve çevredeki metabolik süreçlere yeni bakış açıları sunar. Yetiştirme olmadan, bu organizmaların doğal ortamlarındaki rolü belirsiz kalır ve tanımlayıcı bir düzeyle sınırlıdır. Amacımız, hayvan fizyolojisi, hayvan beslenmesi, metagenomik, yem biyokimyası ve modern yetiştirme stratejilerinden elde edilen multidisipliner bilgilerden yararlanarak, tavuğun GIT'inden çok çeşitli anaerobik mikropların izolasyonunu iyileştirmeyi amaçlayan yetiştirme stratejileri uygulamaktır. Ek olarak, izolasyon başarısını etkilediği bilinen numune alma, taşıma ve medya hazırlığı için uygun uygulamaların kullanımını uygulamayı amaçlıyoruz. Uygun metodolojiler, tutarlı bir oksijensiz ortam, optimum atmosferik koşullar, uygun konakçı kuluçka sıcaklığı ve kendine özgü ihtiyaçlarıyla uyumlu olarak özel beslenme gereksinimlerinin sağlanmasını sağlamalıdır. Bu metodolojileri izleyerek, yetiştirme sadece izolasyon için tekrarlanabilir sonuçlar vermekle kalmayacak, aynı zamanda izolasyon prosedürlerini de kolaylaştıracak ve böylece tavuğun GIT'i içindeki karmaşık mikrobiyal ekosistemin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını teşvik edecektir.

Giriş

Mikroorganizmaların incelenmesinde yetiştiriciliğin yeniden canlanması, daha önce sadece kısmen tanımlanmış ve niceliksel olarak tanımlanmış metabolik hipotezleri test etmek için materyal sağlayarak metagenomik çalışmalardan elde edilen içgörüleri tamamlamıştır. Bağırsak bakterilerinin yetiştirilmesi, mikrobiyal-konak etkileşimleri üzerine gelecekteki araştırmaları sürdürmek, hedeflenen kolonizasyon çalışmalarını kolaylaştırmak ve moleküler etkileşim çalışmalarını geliştirmek için materyal sağlar 1,2,3. Gastrointestinal mikroorganizmalar hakkında edinilen bilgiler, diyet formülasyonlarını etkileyerek ve besin mevcudiyetini artırarak hayvan beslenmesini ve refahını iyileştirmiştir4. Bu anlayış, prebiyotik ve probiyotik etkileşimin kullanılmasında performans iyileştirmelerine katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, biyokimyasal ve fizikokimyasal koşulların mikrobiyal profili ve yapısını nasıl etkileşime girdiğini ve etkilediğini tam olarak anlamak için derinlemesine araştırma yapılması gerekmektedir. Bu amaca ulaşmak için, gastrointestinal ortamdaki mikrobiyal toplulukların karmaşık dinamiklerini araştırmak için çok önemli bir araç olarak hizmet eden yetiştirme zorunlu olmaya devam etmektedir.

İnsan bağırsağı ile ilişkili mikroplar üzerine yapılan kapsamlı araştırmaların ve klinik yetiştirme çalışmalarının5 aksine, çiftlik hayvanlarından elde edilen mikroorganizmalar hakkındaki raporlar, izolasyon için ağırlıklı olarak sınırlı bir ortam yelpazesi kullanmış ve potansiyel olarak izolatların çeşitliliğini kısıtlamıştır 2,3. Ayrıca, Tanaka ve ark. ve Kawasaki ve ark. tarafından açıklandığı gibi, ortamın formülasyonundaki iyileştirmeler ve fosfat ve tuzların agar ile etkileşimi üzerine çalışmalar, bağırsak mikrobiyom çalışmalarıiçin henüz uygulanmamıştır 6,7,8,9.

Yarı esansiyel bir madde olarak kabul edilen miyo-inositolün (MI) çeşitli metabolik, fizyolojik ve düzenleyici süreçlerde çok önemli bir rol oynadığı bildirilmiştir10,11. Bunlar arasında kemik mineralizasyonuna katılım, meme kası gelişimi, hücresel sinyalleme, yumurtlama ve doğurganlığın teşviki, nöronal sinyallemenin modülasyonu ve kümes hayvanlarında glikoz homeostazı ve insülin regülasyonunun düzenleyicisi olarak hareket etmeyer alır 10,11. MI, glikoliz/glukoneogenez süreci, sitrik asit döngüsü ve pentoz fosfat yolu dahil olmak üzere önemli biyokimyasal süreçler içindeki karşılıklı dönüşümü yoluyla bir öncü olarak rol oynar. Ek olarak, gliserofosfolipid metabolizmasında daha fazla rol oynayan fosfatidilinositolün (PI) bir öncüsü olarak da hizmet eder12. Çok az sayıda araştırma, MI'nın metabolize edilmesinin kemik stabilitesinde ve hayvan performansında değişikliklere yol açtığını bildirmiştir. Bu, yem dönüşüm oranındaki ve vücut ağırlığı artışındaki iyileştirmeleri içerir ve hayvan içinde emilim ve kullanımdan sonra etkisini gösterir13,14. Bununla birlikte, MI metabolizasyonu için yol ve bunun kanatlı metabolizması üzerindeki etkisi belirsizliğini korumaktadır15. Ayrıca, az sayıda çalışma, özellikle ileum 16,17,18,19 gibi yüksek metabolik aktiviteye sahip bölgelerde, bakterilerin MI kullanımında potansiyel bir rol önermektedir.

Hayvanların GIT'inden bakteri yetiştirme çabaları, genomik veri tabanlarını geliştirmeyi ve araştırmayı genişletmeyi, genoma dayalı hipotezi doğrulamayı ve bu kaynakların ekolojik önemini anlamayı amaçlamaktadır20. Bu çalışmanın amacı, miyo-inositol'ü asimile eden ve metabolize eden ekolojik bir ilgi grubunun izolasyon çeşitliliğini ve hedeflenen izolasyonunu geliştirmek için tavuğun GIT'inden bakteri yetiştirme stratejilerini geliştirmektir.

Protokol

Protokol dört bölüme ayrılmıştır: numune alma, bakteri izolasyonu, tanımlama ve elde edilen mikroorganizmaların korunması. Hayvanların kullanımına ilişkin onaylanmış izinler, Almanya'daki Regierungspräsidium Tübingen'in etik komisyonu tarafından HOH50/17 TE ve HOH67-21TE onay numaralarıyla verilmiştir.

1. Anaerobik bakteri yetiştiriciliği için numune alınması

  1. Hayvanların bakımı
    1. Hayvanları ad libitum ticari mısır bazlı bir diyetle (Legehennen / Junghennenfutter; Malzeme Tablosuna bakınız) koruyun ve Hohenheim Üniversitesi'nin deney istasyonunda barındırın.
  2. Taşıma çözümünün hazırlanması
    1. Numune alımından 1-2 gün önce, 1.00 g / L sodyum tiyoglikolat, 0.10 g / L kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2.2H 2O) ve% 0.5 sistein21 ve% 0.1 sodyum resazurin çözeltisi içeren taşıma çözeltisini hazırlayın.
    2. Ortamın pH'ını 25 °C'de 6,0 ± 0,2'ye ayarlayın ve 15 psi basınçta 15 dakika boyunca 121 °C'de otoklav yapın.
    3. Ortam yaklaşık 50 °C'ye soğuduktan sonra, orta boy şişenin kapağını bir delikli ve lastik tıpalı steril vidalı kapakla değiştirin. Lastik tıpaya farklı pozisyonlarda iki steril şırınga iğnesi yerleştirin ve iğnelerden birine hidrofobik bir şırınga filtresi (0.22 μm) takın.
      NOT: Kapakların değiştirilmesi ve iğnelerin ve filtrenin takılması laminer hava akışı (LAF) içinde yapılmalıdır.
    4. % 100 nitrojen (N2) tüpünü şırınga filtresine takın ve N2 gazını 1 psi'de 10 dakika boyunca şişeye serpin.
    5. Daha sonra, orta boy şişeyi ve steril Hungate tüplerini anaerobik istasyona aktarın ve taşıma ortamını aseptik olarak Hungate tüplerine aktarın. Hungate tüplerini tamamen doldurun ve içinde hava olmadığından emin olun.
  3. Kesim ve numune toplama
    1. Kesim işlemi sırasında, tüm prosedür boyunca eldiven, maske, plastik laboratuvar önlüğü ve steril cerrahi aletler kullanarak kontaminasyonu önlemek için aksenik koşulları koruyun. Ayrıca, steril bir ortamı korumak için etanol ve mendil kullanarak çalışma tezgahını uygun şekilde sterilize edin.
    2. Deney istasyonunda, 10, 50 haftalık Lohmann yumurtlayan tavukları% 35 N2,% 35 CO2 ve% 30 O2'den oluşan bir şişelenmiş gaz karışımı kullanarak uyuşturun ve hemen kafalarını alın.
      NOT: Anestezi ve kurban kesimi, hayvan refahı ve bilimsel prosedürler konusunda bilgili bir laboratuvar hayvanı teknisyeni tarafından yapılmalıdır. Bu, kurban kesme prosedürünün etik standartlara, yasal düzenlemelere ve güvenlik yönergelerine uygun olmasını sağlar.
    3. GIT bölümünün diseksiyonuna devam etmeden önce, steril Kelly hemostat (Kelly klempi olarak da bilinir; Şekil 1).
      NOT: Hayvanın diseksiyonu, bir veteriner hekim veya tavukların anatomisine aşina olan iyi eğitimli bir kişi tarafından yapılmalıdır.
    4. Her bir bölümü, taşıma ortamıyla doldurulmuş ayrı bir Hungate tüpüne aktarın ve kapağı düzgün bir şekilde kapatın. Gerekirse, kalan havayı çıkarmak için tüpe ekstra taşıma ortamı ekleyin.
      NOT: Bölümün aktarılması çok önemli bir adımdır ve oksijene uzun süre maruz kalmayı önlemek için bölümün herhangi bir gecikmesini veya açılmasını en aza indirmek önemlidir
  4. Numunenin taşınması
    1. Hungate tüplerinin nakliyesini dikkatli bir şekilde yapın ve herhangi bir kırılma riskini önlemek için bir Strafor kutunun içine yerleştirin. Dış sıcaklığın 15 °C'den düşük olması durumunda, ılık paketler kullanarak numunenin sıcaklığını koruyun. Taşıma süresinin 4 saati geçmediğinden emin olun.
    2. Daha sonraki işlemler için tüpleri anaerobik istasyonun içine dikkatlice aktarın.

2. Anaerobik bakterilerin izolasyonu

  1. Kültür ortamının hazırlanması
    NOT: Ana hatlarıyla belirtilen yöntem, kültür ortamının hazırlanması için çeşitli hususlar sunar. Tablo 1 , mikroorganizmaların çeşitli izolasyonu için çözeltilerin nasıl bölündüğüne dair bir örneği göstermektedir.
    1. Kullanılacak ortam formülasyonunun bileşenlerini dört çözelti grubuna bölün: karbon kaynağı, nitrojen kaynağı, agar ve mineral kaynağı. Beyin-Kalp infüzyonu (BHI) gibi zengin ortamlar için ayırma her zaman mümkün değildir ( Tablo 1'deki ortam 2 örneğine bakınız). Bu gibi durumlarda, agar veya ek çözeltilerin ayrı ayrı hazırlanmasını ve otoklavlanmasını sağlayın.
    2. Karbonhidrat çözeltisini, gereken son ortamhacminin 1 / 4'ünde, örneğin toplam 1 L ortam hacmi için 250 mL'de hazırlayın. Tablo 1'deki ortam 1 örneğini takiben, 2 g dekstroz ve 0.5 g nişastayı 250 mL damıtılmış suda çözün.
    3. Protein çözeltisini, gerekli son ortamhacminin 1 / 4'ünde, örneğin toplam 1 L ortam hacmi için 250 mL'de hazırlayın. Tablo 1'deki ortam 1 örneğini takiben, 10 g peptonu 250 mL damıtılmış suda çözün.
    4. Nihai ortam hacminin %45 ila %48'inde, örneğin toplam 1 L ortam hacmi için 450 ila 480 mL'de agar çözeltisi hazırlayın. Tablo 1'deki mediu 1 örneğini takiben, 15 g agarı 450 ila 480 mL damıtılmış suda çözün.
    5. Mineral çözeltisini, son ortam hacmi 1 L olduğunda, sol 20 ila 50 mL ortam hacminde hazırlayın. Tablo 1'deki ortam 1 örneğini takiben, 0.5 gK2HPO4'ü 20 ila 50 mL damıtılmış suda çözün.
    6. Protein çözeltisini, agar çözeltisini ve mineral çözeltilerini 121 ° C'de 21 psi basınçta 15 dakika otoklavlayın. Karbonhidrat çözeltisini 110 ° C'de 30 dakika boyunca 5 psi'de otoklavlayın.
    7. Tüm solüsyonlar steril hale geldikten sonra, 50 °C'ye kadar soğutun ve steril koşullar altında, bir delikli ve lastik tıpalı bir kapağı olan uygun bir otoklavlanmış cam şişeye karıştırın. Bundan sonra, 1.2.3 ve 1.2.4 adımlarını izleyin.
      NOT: Çözeltilerin karıştırılması bir LAF içinde yapılmalıdır.
    8. Ortam karıştırıldıktan ve gazı alındıktan sonra, anaerobik istasyonun içindeki steril Petri kaplarına veya tüplerine dökün.
  2. Anaerobik bakterilerin izolasyonu
    NOT: Aşağıdaki metodoloji, tavuğun sindirim sisteminde yaşayan çok çeşitli anaerobik bakterilerin yetiştirilmesi için bir izolasyon stratejisini açıklamaktadır.
    1. Numuneleri, ticari bir tedarikçi tarafından sağlanan %80N2 (kalite seviyesi 5.0), %15CO2 (kalite seviyesi 3.0) ve %5H2'den (kalite seviyesi 5.0) oluşan bir şişelenmiş gaz karışımı içeren anaerobik bir istasyona aktarın (bkz.
    2. Anaerobik istasyonun içinde, otoklavlanmış forseps kullanarak bölümü hungate tüpünden steril Petri kabına aktarın.
    3. Steril bir makas kullanarak bölümü dikkatlice kesin ve steril bir spatula kullanarak bağırsak segmentinden yaklaşık 1 g digesta içeriği çıkarın.
      NOT: 1 g digesta içeriği aldıktan sonra, kalan digesta'yı sıyırın ve hedeflenen izolasyon için ilgili taşıma ortamı tüpüne aktarın.
    4. Steril bir fizyolojik çözelti (% 0.85 NaCl) kullanarak 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin.
    5. Numunenin 0.1 mL'sini 10−4 ila 10−7 dilüsyonlarından steril ve uygun şekilde etiketlenmiş Petri kapları ortam plakalarına dağıtın ve steril bir Drigalski spatel ile yayın.
    6. Plakaları anaerobik istasyonun içinde 39 °C'de 24-48 saat inkübe edin.
      NOT: Bir inkübatörün içinde kuluçkaya yatırırken, Petri kaplarını anaerobik istasyondan çıkarmadan önce Petri kaplarını hava geçirmez bir kutuya aktarın.
  3. Belirli bir bakteri grubunun hedefli izolasyonu.
    NOT: Aşağıdaki metodoloji, MI'yı potansiyel olarak asimile edebilen anaerobik bakteriler için bir izolasyon stratejisini açıklamaktadır.
    1. Zenginleştirme ortamı, minimal agar ortamı ve minimum et suyu ortamının hazırlanması için, adım 2.1'de belirtilen yönergelere bağlı kalarak Tablo 2 ve Tablo 3'te belirtilen bileşimi izleyin. Otoklavlama işleminden sonra minimal agar ortamına ve minimum et suyu ortamına 0.2 mL / L filtre steril vitamin karışımı (bileşimde belirtildiği gibi) ekleyin.
    2. İlk numuneyi 10-15 saniye boyunca bir vorteks karıştırıcı kullanarak homojenize edin. Daha sonra, homojenize edilmiş numuneyi bir pipet kullanarak %5 oranında zenginleştirme ortamı içeren tüpe aktarın (örn. zenginleştirme ortamının hacmi 10 mL ise, 0,5 mL homojenize numuneyi aşılayın). Taze aşılanmış numuneyi anaerobik istasyonun içinde 39 ° C'de 24 saat inkübe edin.
    3. İnkübasyondan sonra, zenginleştirilmiş tüpü 10-15 saniye boyunca bir vorteks karıştırıcı kullanarak veya pipetleyerek iyice karıştırın. Daha sonra, karışık numuneyi %5 oranında steril minimal et suyu ortamına aktarın ve ardından 39 ° C'de 24 saat inkübe edin.
    4. Numuneleri steril tuzlu su çözeltisinde (ör.% 0.85 NaCl), 1:10 seyreltme ile başlayın ve 1:1000 seyreltmeye kadar devam edin. Her seyreltmenin ardından, 10-15 saniye boyunca bir vorteks karıştırıcı kullanarak veya pipetleyerek numuneyi oda sıcaklığında iyice homojenize edin.
    5. Steril ve anaerobik koşullar altında, 1 mL seyreltilmiş numuneyi bir Petri kabına aktarın. Petri kabına yaklaşık 15-20 mL erimiş minimal agar ortamı dökün ve homojen karıştırma için yavaşça yatay olarak döndürün.
      NOT: Agarın sıcaklığı 45 °C civarında olmalıdır, böylece topak oluşmaz ve numunenin ısı ile öldürülmesini önler. Orta dökme anaerobik koşullar altında yapılmalıdır.
    6. Agar katılaşması üzerine, Petri kaplarını anaerobik bir istasyon içinde veya inkübatörde ters konumda 39 ° C'de 24 saat inkübe edin. 24 saatlik inkübasyondan sonra, bakteri kolonileri ortama gömülü belirgin, küçük noktalar olarak görünür.
      NOT: Petri kabını bir inkübatör içinde inkübe ederken, plakaları anaerobik istasyondan çıkarmadan önce hava geçirmez bir kutuya aktarın.
    7. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, tek tek bakteri kolonisini dikkatlice seçin ve minimum et suyu ortamının ayrı tüplerine aktarın.
    8. Kolonileri tek tek tüplere aktardıktan sonra, aşılanmış tüpleri anaerobik olarak 39 ° C'de 24 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamdaki artan bulanıklık bakteri üremesini gösterecektir.
      NOT: Medya şişelerini anaerobik istasyona aktarmadan önce, adım 2.1.7'de daha önce belirtildiği gibi gazdan arındırılmalıdır. 2-8 arası adımlar anaerobik istasyonun içinde gerçekleştirilmelidir.

3. Anaerobik bakterilerin tanımlanması

  1. Enzimatik bir lizis protokolünü takiben 24 saat ila 48 saat inkübasyon süresine sahip kültürlerden DNA'yı çıkarın22.
  2. Kültürü 3000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipet kullanarak atın.
  3. Peleti 2x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2 mL PBS içinde süspanse ederek yıkayın. 10-15 saniye boyunca bir vorteks karıştırıcı kullanarak numuneyi homojenize edin. Santrifüjleme adımını 3000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca tekrarlayın ve süpernatanı dikkatlice atın.
  4. Hücre peletini 0.2 mL PBS pH 7.4'te askıya alın ve 50 ° C'de 1 U lizozim ve 1 U rekombinant mutanolizin ile 30 dakika inkübe edin, ardından 5 μL proteinaz K ile 56 ° C'de 30 dakikalık bir inkübasyon yapın.
  5. Her tüpe 4 μL birim RNAseA ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Tüpleri 21168 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı geri kazanın ve manyetik boncuklar kullanarak saflaştırın.
  6. dsDNA miktar tayin kiti için üretici talimatlarına göre ( Malzeme Tablosunda belirtilmiştir) florometrik bir yöntemle DNA miktar tayinini gerçekleştirin.
    NOT: Ekstrakte edilen DNA -20 °C'de saklanabilir.
  7. Tablo 27'te gösterilen koşulları izleyerek 1492f ve23r 4 primerlerini kullanarak PCR amplifikasyonu için DNA örneklerini şablon olarak kullanın. PCR reaksiyonunun başarılı olduğundan emin olmak için, 1X TAE tamponu ve% 1 agaroz kullanarak standart agaroz jel elektroforezi yöntemine göre agaroz jel elektroforezi gerçekleştirin.
  8. Primerlerden, nükleotidlerden ve diğer kirleticilerden kurtulmak için ticari bir PCR saflaştırma kiti kullanarak PCR ürününü saflaştırın.
  9. Sanger dizilimi için PCR ürününü uygun dizileme servis sağlayıcısına gönderin.
    NOT: Sıralamanın yanı sıra, hizmet sağlayıcılar ekstra ücretler karşılığında PCR ürününün saflaştırılması da dahil olmak üzere hizmetler sağlayabilir. PCR ürünleri 4 °C veya -20°C'de saklanabilir.
  10. Dizileme sonuçlarını kromatogram dosyasıyla birlikte (genellikle ABI veya SCF formatında) FASTA formatında aldıktan sonra, biyoinformatik araçlarını kullanarak dizileri analiz edin. Kromatogram dosyasını açmak ve görselleştirmek için dizi analiz yazılımını kullanın.
    NOT: Kromatogramın genel kalitesi, aşırı gürültü olmadan net ve belirgin tepe noktalarına dayalı olarak kontrol edilmiştir.
  11. Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) aracı24 ve Refseq genom veritabanını kullanarak Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi'nden (NCBI) yedekli olmayan GenBank 16S ribozomal RNA veritabanında amplikonları karşılaştırın ve yakından ilişkili türlerle hizalayın.
    NOT: NCBI BLAST kullanırken, arama çubuğundaki tüm FASTA dizisini kopyalayın.

4. Saf bakteri kültürlerinin korunması

  1. Bakteri hücrelerini, santrifüjleme (10 dakika boyunca 3000 x g ) veya bir plaka üzerinde bir aksenik kültürden biyokütle toplama yoluyla 24 saat ila 48 saat arasında iyi yetiştirilmiş bir kültürden hasat edin.
  2. Bakteri kültürünü uygun bir izotonik steril çözelti (NaCl% 0.85) içinde süspanse edin ve bakteri çözeltisini 3000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyerek yıkayın.
  3. Süpernatanı atın ve bakteri peletini küçük bir hacimde steril izotonik çözelti (0.5 mL) içinde yeniden süspanse edin. Herhangi bir büyüme ortamı kalıntısının uzaklaştırılmasını sağlamak için 1x tekrarlayın.
  4. Peleti 0,8 mL ila 1 mL steril kültür ortamı konsantresi içinde yeniden süspanse edin ve 5-10 saniye boyunca bir vorteks karıştırıcı ile veya hafifçe pipetleyerek homojenize edin.
  5. 0.5 mL hücre süspansiyonunu steril ve uygun şekilde etiketlenmiş 1 mL kriyoviyal içine aktarın ve 0.5 mL otoklavlanmış% 50 gliserol çözeltisi ekleyin. Kriyoviali bir vorteks karıştırıcı kullanarak homojenize edin ve -80 °C'de bir dondurucu rafında saklayın (Şekil 3).
    NOT: Kriyovialleri -80 °C'ye aktarmadan önceki tüm adımlar anaerobik istasyon içinde yapılmalıdır.

Sonuçlar

Taşıma sırasında anaerobik koşulların izlenmesi
Sodyum resazurin ilavesi nedeniyle, numunenin tüpe aktarılmasından önce taşıma çözeltisinin renginin pembeye dönüşmesi, anaerobik koşulların korunmasında bir bozulma veya başarısızlık olduğunu gösterir. Bu nedenle, Şekil 2'de görüldüğü gibi, renk değişimi gösteren tüplerin taşıma sırasında kullanılmasından kaçınılmış ve sadece renk değişikliğ...

Tartışmalar

Bu metodolojinin amacı, numune alma koşullarının, numune işlemenin ve ortam formülasyonu ve hazırlamanın kalitesini iyileştirerek anaerobik bağırsak bakterilerinin yetiştirilmesini geliştirmektir. Kültür ortamı formüle edilirken numunelerin fizikokimyasal koşulları (pH, karbon, nitrojen ve kofaktörlerin mevcudiyeti) dikkate alınmalıdır. Domuzlardan, insanlardan veya farelerden elde edilen bakteri kültürü koleksiyonlarıyla karşılaştırıldığında,

Açıklamalar

Yazarlar, bu senaryoda bildirilen çalışma ile ilgili olarak rekabet eden herhangi bir mali veya kişisel çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, Rehovot-Hohenheim ortaklık programını ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2'yi kabul etmektedir. Bu proje, P-FOWL (FOR 2601) araştırma biriminin bir parçası olarak geliştirilmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidVWR20104.334
AgarVWR97064-332
Ammonium chlorideCarl RothP726.1
Anaerobic stationDon Whitley ScientificA35 HEPA
Butyric acidMerck8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate VWR97061-904
CentrifugeEppendorf5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)VWR1.05281.0010
CysteineVWR97061-204
DextroseVWR90000-908
Di-potassium hydrogen phosphateCarl RothP749.1
EDTACarl Roth8043.2
Legehennen/ JunghennenfutterDeutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany-
MagAttract HMW DNA KitQiagen67563
Magnesium chlorideCarl Roth2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))Westfalen Gase GmbH, Germany-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)A&A Biotechnology1017-10L
Myo-inositolCarl Roth4191.2
PBS 1XChemSolute8418.01
Potassium dihydrogen phosphateCarl Roth3904.2
Propionic acidCarl Roth6026.1
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2671
RNAse A QIAGEN Ribonuclease A (RNase A) 19101
Sodium chlorideVWR27800.291
Sodium resazurinVWR85019-296
Sodium thioglycolateSigma-Aldrich102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-FreeVWR97064-186
ThermocyclerBio-RadT100
TryptoneCarl Roth8952.1
Tween80Carl Roth9139.2
Vitamin mix (supplement)VWR968290NL
VortexStar Lab07127/92930
Yeast ExtractCarl Roth9257.05
β-D-FructoseVWR53188-23-1

Referanslar

  1. Wylensek, D., et al. A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity. Nat Comm. 11 (1), 6389 (2020).
  2. Medvecky, M., et al. Whole genome sequencing and function prediction of 133 gut anaerobes isolated from chicken caecum in pure cultures. BMC Geno. 19 (1), 561 (2018).
  3. Zenner, C., et al. Early-life immune system maturation in chickens using a synthetic community of cultured gut bacteria. mSystems. 6 (3), 1110-1128 (2021).
  4. Borda-Molina, D., et al. Effects on the ileal microbiota of phosphorus and calcium utilization, bird performance, and gender in japanese quail. Animals. 10 (5), 885 (2020).
  5. Bonnet, M., Lagier, J. C., Raoult, D., Khelaifia, S. Bacterial culture through selective and non-selective conditions: The evolution of culture media in clinical microbiology. New Micro New Infect. 34, 100622 (2020).
  6. Tanaka, T., et al. A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability. Appl Environ Microbiol. 80 (24), 7659-7666 (2014).
  7. Kawasaki, K., Kamagata, Y. Phosphate-catalyzed hydrogen peroxide formation from agar, gellan, and κ-carrageenan and recovery of microbial cultivability via catalase and pyruvate. Appl Environ Microbiol. 83 (21), e01366-e01417 (2017).
  8. Kato, S., et al. Isolation of previously uncultured slow-growing bacteria by using a simple modification in the preparation of agar media. Appl Environ Microbiol. 84 (19), e00807-e00818 (2018).
  9. Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nat Rev Microbiol. 19 (4), 225-240 (2021).
  10. Su, X. B., Ko, A. L. A., Saiardi, A. Regulations of myo-inositol homeostasis: Mechanisms, implications, and perspectives. Adv Biol Regul. 87, 2212-4926 (2023).
  11. Monastra, G., Dinicola, S., Unfer, V. . Physiological and pathophysiological roles of inositols in A clinical guide to inositols. , (2023).
  12. Kanehisa, M. Toward understanding the origin and evolution of cellular organisms. Prot Sci. 28 (11), 1947-1951 (2019).
  13. Lee, S. A., Nagalakshmi, D., Raju, M. V., Rao, S. V. R., Bedford, M. R. Effect of phytase superdosing, myo-inositol and available phosphorus concentrations on performance and bone mineralisation in broilers. Animal Nutri. 3 (3), 247-251 (2017).
  14. Farhadi, D., Karimi, A., Sadeghi, G., Rostamzadeh, J., Bedford, M. Effects of a high dose of microbial phytase and myo-inositol supplementation on growth performance, tibia mineralization, nutrient digestibility, litter moisture content, and foot problems in broiler chickens fed phosphorus-deficient diets. Poultry Sci. 96 (10), 3664-3675 (2017).
  15. Weber, M., Fuchs, T. M. Metabolism in the niche: A large-scale genome-based survey reveals inositol utilization to be widespread among soil, commensal, and pathogenic bacteria. Microbio Spect. 10 (4), e02013-e02022 (2022).
  16. Kawsar, H. I., Ohtani, K., Okumura, K., Hayashi, H., Shimizu, T. Organization and transcriptional regulation of myo-inositol operon in Clostridium perfringens. FEMS Microbiol Lett. 235 (2), 289-295 (2004).
  17. Hellinckx, J., Heermann, R., Felsl, A., Fuchs, T. M. High binding affinity of repressor IolR avoids costs of untimely induction of myo-inositol utilization by Salmonella Typhimurium. Sci Rep. 7 (1), 44362 (2017).
  18. Yebra, M. J., et al. Identification of a gene cluster enabling Lactobacillus casei BL23 to utilize myo-inositol. Appl Environ Microbiol. 73 (12), 3850-3858 (2007).
  19. Zhang, W. Y., et al. Comparative analysis of iol clusters in Lactobacillus casei strains. World J Microbiol Biotechnol. 26, 1949-1955 (2010).
  20. Labeda, D. P. . Bergey's manual of systematic bacteriology. , (2001).
  21. Peterson, L. R. Effect of media on transport and recovery of anaerobic bacteria. Clin Infect Dis. 25, 134-136 (1997).
  22. Ulrich, R. L., Hughes, T. A. A rapid procedure for isolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and other Gram-positive bacteria. Lett Appl Microbiol. 32 (1), 52-56 (2008).
  23. Relman, D. Universal bacterial 16s rRNA amplification and sequencing. Diag Mol Microbiol. , 489-495 (1993).
  24. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs. Nuc Acid Res. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  25. Rios-Galicia, B., et al. Novel taxonomic and functional diversity of eight bacteria from the upper digestive tract of chicken. Int J Syst Evol Microbiol. 74 (1), 006210 (2024).
  26. Lagier, J. C., et al. Microbial culturomics: Paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin Microbiol Infect. 18 (12), 1185-1193 (2012).
  27. Lagkouvardos, I., et al. The mouse intestinal bacterial collection (mibc) provides host-specific insight into cultured diversity and functional potential of the gut microbiota. Nat Microbiol. 1 (10), 1-15 (2016).
  28. Gilroy, R., et al. Extensive microbial diversity within the chicken gut microbiome revealed by metagenomics and culture. PeerJ. 9, e10941 (2021).
  29. Huang, P., et al. The chicken gut metagenome and the modulatory effects of plant-derived benzylisoquinoline alkaloids. Microbiome. 6 (1), 1-17 (2018).
  30. Zhang, Y., et al. Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads. GigaScience. 11, 116 (2022).
  31. Segura-Wang, M., Grabner, N., Koestelbauer, A., Klose, V., Ghanbari, M. Genome-resolved metagenomics of the chicken gut microbiome. Front Microbiol. 12, 726923 (2021).
  32. Borrelli, R. C., Fogliano, V., Monti, S. M., Ames, J. M. Characterization of melanoidins from a glucose-glycine model system. Euro Food Res Technol. 215, 210-215 (2002).
  33. Ferrario, C., et al. Untangling the cecal microbiota of feral chickens by culturomic and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 19 (11), 4771-4783 (2017).
  34. Crhanova, M., et al. Systematic culturomics shows that half of chicken caecal microbiota members can be grown in vitro except for two lineages of clostridiales and a single lineage of bacteroidetes. Microorganisms. 7 (11), 496 (2019).
  35. Rubio, L., et al. Lactobacilli counts in crop, ileum and caecum of growing broiler chickens fed on practical diets containing whole or dehulled sweet lupin (lupinus angustifolius) seed meal. British Poult Sci. 39 (3), 354-359 (1998).
  36. Bjerrum, L., et al. Microbial community composition of the ileum and cecum of broiler chickens as revealed by molecular and culture-based techniques. Poult Sci. 85 (7), 1151-1164 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Anaerobik BakterilerGastrointestinal SistemTavukYeti tirme StratejileriMikrobiyomProbiyotikMetagenomikKanatl l kHayvan FizyolojisiHayvan BeslenmesiYem Biyokimyas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır