Tavuğun Gastrointestinal Sisteminden Anaerobik Bakteri Yetiştiriciliğini Geliştirme Stratejileri

Özet

Protokol, anaerobik bağırsak bakterilerinin izolasyonunu iyileştirmek için iki metodoloji sunar. Birincisi, farklı kültür ortamları kullanılarak çok çeşitli bakterilerin izolasyonuna odaklanır. İkincisi, ekolojik önemini tam olarak anlamak için muhtemelen miyo-inositol'ü asimile eden belirli bir mikrobiyal grubun yetiştirme adımlarına odaklanır.

Özet

Tavuğun gastrointestinal sistemi (GIT), konakçının fizyolojisinde, sindiriminde, besin emiliminde, bağışıklık sisteminin olgunlaşmasında ve patojen girişinin önlenmesinde çok önemli bir rol oynayan trilyonlarca mikropu barındıran karmaşık bir ekosistemdir. Optimal hayvan sağlığı ve verimliliği için, bu mikroorganizmaları karakterize etmek ve rollerini anlamak zorunludur. Kümes hayvanlarının GIT'i, potansiyel probiyotik uygulamalarına sahip bir mikroorganizma rezervuarına sahip olsa da, çeşitliliğin çoğu keşfedilmemiştir. Kültürlenmemiş mikrobiyal çeşitlilik konusundaki anlayışımızı geliştirmek için, bu mikroorganizmaları kültüre getirmek için ortak çabalar gerekmektedir. GIT kolonize edici mikroorganizmaların izolasyonu ve yetiştirilmesi, hücreler, DNA ve metabolitler dahil olmak üzere tekrarlanabilir materyal verir ve çevredeki metabolik süreçlere yeni bakış açıları sunar. Yetiştirme olmadan, bu organizmaların doğal ortamlarındaki rolü belirsiz kalır ve tanımlayıcı bir düzeyle sınırlıdır. Amacımız, hayvan fizyolojisi, hayvan beslenmesi, metagenomik, yem biyokimyası ve modern yetiştirme stratejilerinden elde edilen multidisipliner bilgilerden yararlanarak, tavuğun GIT'inden çok çeşitli anaerobik mikropların izolasyonunu iyileştirmeyi amaçlayan yetiştirme stratejileri uygulamaktır. Ek olarak, izolasyon başarısını etkilediği bilinen numune alma, taşıma ve medya hazırlığı için uygun uygulamaların kullanımını uygulamayı amaçlıyoruz. Uygun metodolojiler, tutarlı bir oksijensiz ortam, optimum atmosferik koşullar, uygun konakçı kuluçka sıcaklığı ve kendine özgü ihtiyaçlarıyla uyumlu olarak özel beslenme gereksinimlerinin sağlanmasını sağlamalıdır. Bu metodolojileri izleyerek, yetiştirme sadece izolasyon için tekrarlanabilir sonuçlar vermekle kalmayacak, aynı zamanda izolasyon prosedürlerini de kolaylaştıracak ve böylece tavuğun GIT'i içindeki karmaşık mikrobiyal ekosistemin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını teşvik edecektir.

Giriş

Mikroorganizmaların incelenmesinde yetiştiriciliğin yeniden canlanması, daha önce sadece kısmen tanımlanmış ve niceliksel olarak tanımlanmış metabolik hipotezleri test etmek için materyal sağlayarak metagenomik çalışmalardan elde edilen içgörüleri tamamlamıştır. Bağırsak bakterilerinin yetiştirilmesi, mikrobiyal-konak etkileşimleri üzerine gelecekteki araştırmaları sürdürmek, hedeflenen kolonizasyon çalışmalarını kolaylaştırmak ve moleküler etkileşim çalışmalarını geliştirmek için materyal sağlar ^1,2,3. Gastrointestinal mikroorganizmalar hakk....

Protokol

Protokol dört bölüme ayrılmıştır: numune alma, bakteri izolasyonu, tanımlama ve elde edilen mikroorganizmaların korunması. Hayvanların kullanımına ilişkin onaylanmış izinler, Almanya'daki Regierungspräsidium Tübingen'in etik komisyonu tarafından HOH50/17 TE ve HOH67-21TE onay numaralarıyla verilmiştir.

1. Anaerobik bakteri yetiştiriciliği için numune alınması

1. Hayvanların bakımı
   1. Hayvanları ad libitum ticari mısır bazlı bir diyetle (Legehennen / Junghennenfutter; Malzeme Tablosuna bakınız) koruyun ve Hohenheim Üniversitesi'nin deney istasyonunda barı....

Tartışmalar

Bu metodolojinin amacı, numune alma koşullarının, numune işlemenin ve ortam formülasyonu ve hazırlamanın kalitesini iyileştirerek anaerobik bağırsak bakterilerinin yetiştirilmesini geliştirmektir. Kültür ortamı formüle edilirken numunelerin fizikokimyasal koşulları (pH, karbon, nitrojen ve kofaktörlerin mevcudiyeti) dikkate alınmalıdır. Domuzlardan, insanlardan veya farelerden elde edilen bakteri kültürü koleksiyonlarıyla karşılaştırıldığında,

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1