Stratégies pour améliorer l’élevage de bactéries anaérobies dans le tractus gastro-intestinal du poulet

Résumé

Le protocole présente deux méthodologies pour améliorer l’isolement des bactéries intestinales anaérobies. La première se concentre sur l’isolement d’un large éventail de bactéries à l’aide de différents milieux de culture. La seconde se concentre sur les étapes de culture d’un groupe microbien spécifique, assimilant éventuellement le myo-inositol, afin de bien comprendre sa signification écologique.

Résumé

Le tractus gastro-intestinal (GIT) du poulet est un écosystème complexe abritant des milliards de microbes qui jouent un rôle central dans la physiologie de l’hôte, la digestion, l’absorption des nutriments, la maturation du système immunitaire et la prévention de l’intrusion d’agents pathogènes. Pour une santé et une productivité animales optimales, il est impératif de caractériser ces micro-organismes et de comprendre leur rôle. Bien que le GIT de la volaille contienne un réservoir de micro-organismes avec des applications probiotiques potentielles, la majeure partie de la diversité reste inexplorée. Pour améliorer notre compréhension de la diversité microbienne non cultivée, des efforts concertés sont nécessaires pour mettre ces microorganismes en culture. L’isolement et la culture de micro-organismes colonisant les GIT produisent du matériel reproductible, notamment des cellules, de l’ADN et des métabolites, offrant de nouvelles perspectives sur les processus métaboliques dans l’environnement. Sans culture, le rôle de ces organismes dans leur environnement naturel reste incertain et limité à un niveau descriptif. Notre objectif est de mettre en œuvre des stratégies de culture visant à améliorer l’isolement d’une gamme diversifiée de microbes anaérobies à partir du GIT du poulet, en tirant parti des connaissances multidisciplinaires de la physiologie animale, de la nutrition animale, de la métagénomique, de la biochimie des aliments et des stratégies de culture modernes. De plus, nous visons à mettre en œuvre l’utilisation de bonnes pratiques pour l’échantillonnage, le transport et la préparation des milieux, qui sont connues pour influencer le succès de l’isolement. Les méthodologies appropriées doivent garantir un environnement sans oxygène constant, des conditions atmosphériques optimales, une température d’incubation de l’hôte appropriée et la prise en compte de besoins nutritionnels spécifiques en fonction de leurs besoins distinctifs. En suivant ces méthodologies, la culture donnera non seulement des résultats reproductibles pour l’isolement, mais facilitera également les procédures d’isolement, favorisant ainsi une compréhension complète de l’écosystème microbien complexe au sein du GIT du poulet.

Introduction

La résurgence de la culture dans l’étude des micro-organismes a complété les connaissances des études métagénomiques en fournissant du matériel pour tester des hypothèses métaboliques qui n’étaient auparavant que partiellement décrites et quantifiées. La culture de bactéries intestinales fournit du matériel pour soutenir les recherches futures sur les interactions microbiennes-hôte, faciliter les études de colonisation ciblées et améliorer les études d’interaction moléculaire ^1,2,3. Les connaissances acquises sur les micro-organismes gastro-intestinaux ont amélioré la nutrition et le bien-être des animaux en influençant les formulations des régimes alimentaires et en améliorant la disponibilité des nutriments⁴. Cette compréhension a contribué à l’amélioration des performances dans l’utilisation de l’interaction prébiotique et probiotique. Cependant, des recherches approfondies sont nécessaires pour obtenir une compréhension complète de la façon dont les conditions biochimiques et physicochimiques interagissent et influencent le profil microbien et sa structure. Pour atteindre cet objectif, la culture reste impérative, car elle constitue un outil crucial pour approfondir la dynamique complexe des communautés microbiennes dans l’environnement gastro-intestinal.

Contrairement aux recherches approfondies sur les microbes associées à l’intestin humain et aux études cliniques de culture⁵, les rapports sur les microorganismes provenant du bétail ont principalement utilisé une gamme limitée de milieux pour l’isolement, ce qui pourrait limiter la diversité des isolats ^2,3. De plus, les améliorations apportées à la formulation des milieux et les études sur l’interaction du phosphate et des sels avec la gélose, telles qu’élucidées par Tanaka et al. et Kawasaki et al., n’ont pas encore été mises en œuvre pour les études sur le microbiome intestinal 6,7,8,9.

Considéré comme une substance semi-essentielle, le myo-inositol (IM) jouerait un rôle central dans divers processus métaboliques, physiologiques et réglementaires^10,11. Il s’agit notamment de l’implication dans la minéralisation osseuse, le développement des muscles mammaires, la signalisation cellulaire, la promotion de l’ovulation et de la fertilité, la modulation de la signalisation neuronale et l’action en tant que régulateur de l’homéostasie du glucose et de la régulation de l’insuline chez la volaille^10,11. L’IM joue un rôle de précurseur grâce à son interconversion au sein de processus biochimiques essentiels, notamment le processus de glycolyse/gluconéogenèse, le cycle de l’acide citrique et la voie du pentose phosphate. De plus, il sert également de précurseur du phosphatidylinositol (PI), qui est en outre impliqué dans le métabolisme des glycérophospholipides¹². Peu d’études ont rapporté que la métabolisation de l’IM entraîne des altérations de la stabilité osseuse et des performances animales. Cela comprend l’amélioration du taux de conversion alimentaire et du gain de poids corporel, démontrant son impact après absorption et utilisation chez l’animal^13,14. Cependant, la voie de métabolisation de l’IM et son impact sur le métabolisme de la volaille restent insaisissables¹⁵. De plus, peu d’études proposent un rôle potentiel des bactéries dans l’utilisation de l’IM, en particulier dans les régions à forte activité métabolique telles que l’iléon 16,17,18,19.

Les efforts visant à cultiver des bactéries à partir du GIT des animaux visent à améliorer les bases de données génomiques et à élargir la recherche, à vérifier les hypothèses basées sur le génome et à comprendre l’importance écologique de ces ressources²⁰. L’objectif de ce travail est d’améliorer les stratégies de culture bactérienne à partir du GIT du poulet afin d’améliorer la diversité d’isolement et l’isolement ciblé d’un groupe écologique d’intérêt qui assimile et métabolise le myo-inositol.

Protocole

Le protocole est divisé en quatre parties : l’échantillonnage, l’isolement bactérien, l’identification et la conservation des micro-organismes obtenus. Les autorisations d’utilisation d’animaux ont été délivrées par la commission d’éthique du Regierungspräsidium Tübingen, en Allemagne, sous les numéros d’approbation HOH50/17 TE et HOH67-21TE.

1. Obtention d’échantillons pour la culture de bactéries anaérobies

1. Entretien des animaux
   1. Maintenir les animaux avec un régime commercial ad libitum à base de maïs (Legehennen/ Junghennenfutter ; voir tableau des matériaux) et maison à la station expérimentale de l’Université de Hohenheim.
2. Préparation de la solution de transport
   1. 1 à 2 jours avant le prélèvement de l’échantillon, préparer la solution de transport contenant 1,00 g/L de thioglycolate de sodium, 0,10 g/L de chlorure de calcium dihydraté (CaCl_{2,2H 2}O) et 0,5 % de cystéine²¹ et 0,1 % de solution de résazurine sodique.
   2. Ajustez le pH du milieu à 6,0 ± 0,2 à 25 °C et à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min à une pression de 15 psi.
   3. Une fois que le fluide a refroidi à environ 50 °C, remplacez le bouchon du flacon moyen par un bouchon à vis stérile doté d’un alésage et d’un bouchon en caoutchouc. Insérez deux aiguilles de seringue stériles dans le bouchon en caoutchouc à différentes positions et fixez un filtre de seringue hydrophobe (0,22 μm) sur l’une des aiguilles.
      REMARQUE : Le remplacement des capuchons et l’insertion des aiguilles et du filtre doivent être effectués à l’intérieur d’un flux d’air laminaire (LAF).
   4. Fixez le tube à 100 % d’azote (N₂) au filtre de la seringue et versez du gaz N₂ dans le flacon pendant 10 min à 1 psi.
   5. Ensuite, transférez le flacon moyen et les tubes Hungate stériles dans la station anaérobie et transférez aseptiquement le milieu de transport dans les tubes Hungate. Remplissez complètement les tubes Hungate jusqu’en haut, en veillant à l’absence d’air à l’intérieur.
3. Abattage et prélèvement d’échantillons
   1. Pendant le processus d’abattage, maintenez des conditions axéniques pour éviter la contamination en utilisant des gants, un masque, un tablier de laboratoire en plastique et des instruments chirurgicaux stériles tout au long de la procédure. De plus, désinfectez correctement le banc de travail à l’aide d’éthanol et de mouchoirs en papier pour maintenir un environnement stérile.
   2. Dans la station expérimentale, anesthésie 10 poules pondeuses Lohmann âgées de 50 semaines à l’aide d’un mélange gazeux en bouteille composé de 35 % de N₂, 35 % de CO₂ et 30 % de O₂ et décapite immédiatement les.
      REMARQUE : L’anesthésie et le sacrifice doivent être effectués par un technicien des animaux de laboratoire qui connaît bien le bien-être des animaux et les procédures scientifiques. Cela permet de s’assurer que la procédure de sacrifice est conforme aux normes éthiques, aux réglementations légales et aux directives de sécurité.
   3. Avant de procéder à la dissection de la section gastro-intestinale, fixez le segment intestinal requis, à savoir le jabot, l’iléon et le jéjunum, à l’aide d’un hémostat de Kelly stérile (également connu sous le nom de clamp de Kelly ; Figure 1).
      REMARQUE : La dissection de l’animal doit être effectuée par un vétérinaire ou une personne bien formée qui connaît bien l’anatomie des poulets.
   4. Transférez chaque section individuelle dans un tube Hungate séparé rempli de fluide de transport et fermez correctement le couvercle. Si nécessaire, ajoutez un fluide de transport supplémentaire dans le tube pour déplacer l’air restant.
      REMARQUE : Le transfert de la section est une étape cruciale, et il est essentiel de minimiser tout retard ou ouverture de la section pour éviter une exposition prolongée à l’oxygène
4. Transport de l’échantillon
   1. Manipulez le transport des tubes Hungate avec soin, en les plaçant dans une boîte en polystyrène pour éviter tout risque de casse. Si la température extérieure est inférieure à 15 °C, maintenez la température de l’échantillon à l’aide de compresses chaudes. S’assurer que le temps de transport n’excède pas 4 h.
   2. Transférez soigneusement les tubes à l’intérieur de la station anaérobie pour un processus ultérieur.

2. Isolement des bactéries anaérobies

1. Préparation des milieux de culture
   REMARQUE : La méthode décrite présente divers facteurs à prendre en compte pour la préparation des milieux de culture. Le tableau 1 illustre la façon dont les solutions sont divisées pour l’isolement diversifié des micro-organismes.
   1. Divisez les ingrédients de la formulation du milieu à utiliser en quatre groupes de solutions : source de carbone, source d’azote, gélose et source minérale. Pour les médias riches comme l’infusion cerveau-cœur (BHI), la séparation n’est pas toujours possible (voir l’exemple du support 2 dans le tableau 1). Dans de tels cas, assurez-vous que la préparation et l’autoclave séparés de la gélose ou des solutions supplémentaires sont nécessaires.
   2. Préparez la solution de glucides dans 1/4^du volume final de milieu requis, par exemple dans 250 mL pour un volume total de 1 L de milieu. En suivant l’exemple du milieu 1 du tableau 1, dissoudre 2 g de dextrose et 0,5 g d’amidon dans 250 mL d’eau distillée.
   3. Préparer la solution protéique dans 1/4^du volume final de milieu requis, p. ex., dans 250 mL pour un volume total de 1 L de milieu. En suivant l’exemple du milieu 1 du tableau 1, dissoudre 10 g de peptone dans 250 mL d’eau distillée.
   4. Préparer une solution de gélose dans 45 % à 48 % du volume final du milieu, p. ex., dans 450 à 480 mL pour un volume total de 1 L de milieu. En suivant l’exemple de médiu 1 du tableau 1, dissoudre 15 g de gélose dans 450 à 480 mL d’eau distillée.
   5. Préparez la solution minérale dans le volume gauche de 20 à 50 mL de milieu lorsque le volume final de milieu est de 1 L. En suivant l’exemple du milieu 1 du tableau 1, dissoudre 0,5 g de K₂HPO₄ dans 20 à 50 mL d’eau distillée.
   6. Autoclavez la solution protéique, la solution de gélose et les solutions minérales à 121 °C pendant 15 min à une pression de 21 psi. Autoclavez la solution glucidique à 110 °C pendant 30 min à 5 psi.
   7. Une fois que toutes les solutions sont stériles, refroidissez-les à 50 °C et mélangez-les dans des conditions stériles dans un flacon en verre autoclavé approprié avec un bouchon doté d’un alésage et d’un bouchon en caoutchouc. Après cela, suivez les étapes 1.2.3 et 1.2.4.
      REMARQUE : Le mélange des solutions doit être effectué à l’intérieur d’un LAF.
   8. Une fois que le milieu a été mélangé et dégazé, versez-le dans des boîtes de Pétri stériles ou des tubes à l’intérieur de la station anaérobie.
2. Isolement des bactéries anaérobies
   REMARQUE : La méthodologie suivante explique une stratégie d’isolement pour l’élevage d’un large éventail de bactéries anaérobies qui habitent le tube digestif du poulet.
   1. Transvaser les échantillons dans une station anaérobie contenant un mélange gazeux en bouteille composé de 80 % de N₂ (niveau de qualité 5,0), 15 % de CO₂ (niveau de qualité 3,0) et 5 % de H₂ (niveau de qualité 5,0) fourni par un fournisseur commercial (voir le tableau des matériaux).
   2. À l’intérieur de la station anaérobie, transférez la section du tube hungate dans la boîte de Pétri stérile à l’aide d’une pince autoclave.
   3. Ouvrez soigneusement la section à l’aide d’une paire de ciseaux stériles et extrayez environ 1 g de digesta du segment intestinal à l’aide d’une spatule stérile.
      REMARQUE : Après avoir pris 1 g de digesta, mettez au rebut et transférez le digesta restant dans son tube de fluide de transport respectif pour l’isolement ciblé.
   4. Effectuer une dilution en série de 10 fois à l’aide d’une solution physiologique stérile (0,85 % de NaCl).
   5. Distribuer 0,1 mL de l’échantillon des dilutions 10−4 à 10−7 dans des boîtes de Pétri stériles et correctement étiquetées et étaler avec un spatel Drigalski stérile.
   6. Incuber les plaques à l’intérieur de la station anaérobie pendant 24 à 48 h à 39 °C.
      REMARQUE : Lors de l’incubation à l’intérieur d’un incubateur, transférez les boîtes de Pétri dans une boîte hermétique avant de sortir les boîtes de Pétri de la station anaérobie.
3. Isolement ciblé d’un groupe bactérien spécifique.
   REMARQUE : La méthodologie suivante explique une stratégie d’isolement des bactéries anaérobies qui peuvent potentiellement assimiler l’IM.
   1. Pour la préparation du milieu d’enrichissement, du milieu de gélose minimal et du milieu de bouillon minimal, suivez la composition spécifiée dans les tableaux 2 et 3, en respectant les directives décrites à l’étape 2.1. Ajouter 0,2 mL/L de mélange de vitamines stériles avec filtre (comme indiqué dans la composition) dans un milieu gélosé minimal et un milieu de bouillon minimal après le processus d’autoclavage.
   2. Homogénéiser l’échantillon initial à l’aide d’un mélangeur vortex pendant 10 à 15 s. Par la suite, transvaser l’échantillon homogénéisé dans le tube contenant le milieu d’enrichissement à un taux de 5 % (p. ex., si le volume du milieu d’enrichissement est de 10 mL, inoculer 0,5 mL d’échantillon homogénéisé) à l’aide d’une pipette. Incuber l’échantillon fraîchement inoculé pendant 24 h à 39 °C à l’intérieur de la station anaérobie.
   3. Après l’incubation, bien mélanger le tube enrichi à l’aide d’un mélangeur vortex pendant 10 à 15 secondes ou par pipetage. Par la suite, transférez l’échantillon mélangé dans un milieu de bouillon stérile minimal à un taux de 5 %, puis incubez pendant 24 h à 39 °C.
   4. Diluer en série les échantillons dans une solution saline stérile (c’est-à-dire 0,85 % de NaCl), en commençant par une dilution de 1:10 et en continuant jusqu’à une dilution de 1:1000. Après chaque dilution, homogénéiser complètement l’échantillon à température ambiante à l’aide d’un mélangeur vortex pendant 10 à 15 s ou par pipetage.
   5. Dans des conditions stériles et anaérobies, transférez 1 mL d’échantillon dilué dans une boîte de Pétri. Versez environ 15 à 20 ml de milieu gélosé minimal fondu dans la boîte de Pétri et remuez doucement horizontalement pour un mélange uniforme.
      REMARQUE : La température de la gélose doit être d’environ 45 °C afin qu’il n’y ait pas de grumeaux et pour éviter que l’échantillon ne soit tué par la chaleur. Le versement du fluide doit être effectué dans des conditions anaérobies.
   6. Après solidification de la gélose, incuber les boîtes de Pétri pendant 24 h à 39 °C en position inversée à l’intérieur d’une station anaérobie ou dans un incubateur. Après 24 h d’incubation, les colonies bactériennes apparaissent sous la forme de petits points distincts incrustés dans le milieu.
      REMARQUE : Lorsque vous incubez la boîte de Pétri à l’intérieur d’un incubateur, transférez les plaques dans une boîte hermétique avant de les sortir de la station anaérobie.
   7. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, prélevez soigneusement la colonie bactérienne individuelle et transférez-la dans des tubes séparés de milieu de bouillon minimal.
   8. Après avoir transféré les colonies dans des tubes individuels, incuber en anaérobiose les tubes inoculés à 39 °C pendant 24 h. Après l’incubation, une turbidité accrue dans le milieu indiquera une croissance bactérienne.
      REMARQUE : Chaque fois que les bouteilles de média sont transférées à l’intérieur de la station anaérobie, elles doivent être dégazées comme mentionné précédemment à l’étape 2.1.7. Les étapes 2 à 8 doivent être effectuées à l’intérieur de la station anaérobie.

3. Identification des bactéries anaérobies

1. Extraire l’ADN de cultures d’un temps d’incubation de 24 h à 48 h, selon un protocole de lyse enzymatique²².
2. Centrifuger la culture à 3000 x g pendant 10 min à 4 °C et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
3. Lavez le granulé 2 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en le suspendant dans 2 mL de PBS. Homogénéiser l’échantillon à l’aide d’un mélangeur vortex pendant 10 à 15 s. Répétez l’étape de centrifugation à 3000 x g pendant 10 min à 4 °C et jetez le surnageant avec précaution.
4. Mettre la pastille cellulaire en suspension dans 0,2 mL de PBS pH 7,4 et incuber à 50 °C avec 1 U de lysozyme et 1 U de mutanolysine recombinante pendant 30 min, suivie d’une incubation de 30 min à 56 °C avec 5 μL de protéinase K.
5. Ajouter 4 μL d’ARNseA dans chaque tube et incuber à température ambiante pendant 10 min. Tubes à centrifuger à 21168 x g pendant 1 min. Récupérer le surnageant et purifier à l’aide de billes magnétiques.
6. Effectuer la quantification de l’ADN à l’aide d’une méthode fluorométrique conformément aux instructions du fabricant pour le kit de quantification de l’ADNdb (mentionnées dans la table des matériaux).
   REMARQUE : L’ADN extrait peut être stocké à -20 °C.
7. Utiliser des échantillons d’ADN comme modèles pour l’amplification par PCR à l’aide des amorces 27f et 1492r²³ selon les conditions indiquées dans le tableau 4. Pour vous assurer que la réaction PCR a réussi, effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose selon la méthode standard d’électrophorèse sur gel d’agarose en utilisant un tampon TAE 1X et 1 % d’agarose.
8. Purifiez le produit PCR à l’aide d’un kit de purification PCR commercial pour vous débarrasser des amorces, des nucléotides et d’autres contaminants.
9. Envoyez le produit PCR pour le séquençage de Sanger au prestataire de services de séquençage approprié.
   REMARQUE : En plus du séquençage, les fournisseurs de services peuvent également fournir des services tels que la purification du produit PCR moyennant des frais supplémentaires. Les produits PCR peuvent être conservés à 4 °C ou à -20 °C.
10. Après avoir obtenu les résultats de séquençage au format FASTA avec le fichier de chromatogramme (généralement au format ABI ou SCF), analysez les séquences à l’aide d’outils bioinformatiques. Utilisez un logiciel d’analyse de séquence pour ouvrir et visualiser le fichier de chromatogramme.
    REMARQUE : La qualité globale du chromatogramme a été vérifiée sur la base de pics clairs et distincts sans bruit excessif
11. Comparez les amplicons et alignez-les sur les espèces étroitement apparentées dans la base de données non redondante d’ARN ribosomique GenBank 16S du National Center for Biotechnology Information (NCBI) à l’aide de l’outil BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)²⁴ et de la base de données génomique Refseq.
    REMARQUE : Lorsque vous utilisez NCBI BLAST, copiez la séquence FASTA entière dans la barre de recherche.

4. Conservation de cultures bactériennes pures

1. Récoltez les cellules bactériennes d’une culture bien cultivée de 24 h à 48 h soit par centrifugation (3000 x g pendant 10 min), soit par collecte de biomasse à partir d’une culture axénique sur plaque.
2. Suspendre la culture bactérienne dans une solution isotonique stérile appropriée (NaCl 0,85%) et laver par centrifugation de la solution bactérienne à 3000 x g pendant 10 min à 4 °C.
3. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille bactérienne dans un petit volume de solution isotonique stérile (0,5 mL). Pour assurer l’élimination de tout résidu de milieu de croissance, répétez 1 fois.
4. Remettre la pastille en suspension dans 0,8 mL à 1 mL de milieu de culture stérile concentré et homogénéiser soit à l’aide d’un mélangeur vortex pendant 5 à 10 s, soit en pipetant doucement.
5. Transférez 0,5 mL de suspension cellulaire dans un flacon cryogénique stérile et correctement étiqueté de 1 mL et ajoutez 0,5 mL de solution de glycérol à 50 % autoclave. Homogénéiser le cryoflacon à l’aide d’un mélangeur vortex et le conserver dans une grille de congélation à -80 °C (Figure 3).
   REMARQUE : Toutes les étapes avant de transférer les cryoflacons à -80 °C doivent être effectuées à l’intérieur de la station anaérobie.

Résultats

Surveillance des conditions anaérobies pendant le transport
En raison de l’ajout de résazurine de sodium, le changement de couleur de la solution de transport en rose avant le transfert de l’échantillon dans le tube indique une perturbation ou une défaillance du maintien des conditions anaérobies. Par conséquent, les tubes présentant un changement de couleur n’ont pas été utilisés pendant le transport et seuls les tubes ne présentant aucun changement ...

Discussion

L’objectif de cette méthodologie est d’améliorer la culture des bactéries intestinales anaérobies en améliorant la qualité des conditions d’échantillonnage, le traitement des échantillons et la formulation et la préparation des milieux. Les conditions physicochimiques des échantillons (pH, disponibilité du carbone, de l’azote et des cofacteurs) doivent être prises en compte lors de la formulation du milieu de culture. Comparé aux collections de cultures bactériennes...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1