Стратегии повышения культивирования анаэробных бактерий из желудочно-кишечного тракта курицы

Резюме

В протоколе представлены две методологии для улучшения выделения анаэробных кишечных бактерий. Первый фокусируется на выделении разнообразного спектра бактерий с использованием различных питательных сред. Вторая фокусируется на этапах культивирования определенной микробной группы, возможно, ассимилировавшей мио-инозитол, чтобы полностью понять его экологическое значение.

Аннотация

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) курицы — это сложная экосистема, в которой обитают триллионы микробов, которые играют ключевую роль в физиологии хозяина, пищеварении, усвоении питательных веществ, созревании иммунной системы и предотвращении вторжения патогенов. Для оптимального здоровья и продуктивности животных крайне важно охарактеризовать эти микроорганизмы и понять их роль. В то время как ЖКТ домашней птицы содержит резервуар микроорганизмов с потенциальными пробиотическими применениями, большая часть разнообразия остается неизученной. Чтобы улучшить наше понимание разнообразия некультивируемых микроорганизмов, необходимы согласованные усилия по внедрению этих микроорганизмов в культуру. Выделение и культивирование микроорганизмов, колонизирующих ЖКТ, позволяет получить воспроизводимый материал, включая клетки, ДНК и метаболиты, что позволяет по-новому взглянуть на метаболические процессы в окружающей среде. Без культивирования роль этих организмов в их естественной среде остается неясной и ограниченной описательным уровнем. Наша цель состоит в том, чтобы реализовать стратегии выращивания, направленные на улучшение выделения разнообразного спектра анаэробных микробов из ЖКТ курицы, используя междисциплинарные знания в области физиологии животных, кормления животных, метагеномики, биохимии кормов и современных стратегий выращивания. Кроме того, мы стремимся внедрить надлежащие методы отбора проб, транспортировки и подготовки среды, которые, как известно, влияют на успех изоляции. Соответствующие методологии должны обеспечивать постоянную бескислородную среду, оптимальные атмосферные условия, надлежащую температуру инкубации хозяина и учет конкретных потребностей в питательных веществах в соответствии с его особыми потребностями. Следуя этим методологиям, выращивание не только даст воспроизводимые результаты для выделения, но и облегчит процедуры изоляции, тем самым способствуя всестороннему пониманию сложной микробной экосистемы в ЖКТ курицы.

Введение

Возрождение культивирования в изучении микроорганизмов дополнило выводы метагеномных исследований, предоставив материал для проверки метаболических гипотез, которые ранее были лишь частично описаны и количественно оценены. Культивирование кишечных бактерий дает материал для поддержки будущих исследований по взаимодействию микробов и хозяина, способствует целенаправленным исследованиям колонизации и улучшает исследования молекулярных взаимодействий ^1,2,3. Полученные знания о желудочно-кишечных микроорганизмах улучшили питание и благополучие жи....

протокол

Протокол разделен на четыре части: отбор проб, бактериальная изоляция, идентификация и консервация полученных микроорганизмов. Одобренные разрешения на использование животных были выданы этической комиссией Regierungspräsidium Tübingen, Германия, с номерами одобрения HOH50/17 TE и HOH67-21TE.

1. Получение образцов для культивирования анаэробных бактерий

1. Содержание животных
   1. Содержать животных на коммерческой диете на основе кукурузы (Legehennen/Junghennenfutter; см. Таблицу материалов) и содержать их на экспериментальной станции Университета Хоэнхай....

Результаты

Мониторинг анаэробной обстановки при транспортировке
Благодаря добавлению резазурина натрия изменение цвета транспортного раствора на розовый перед переносом образца в пробирку свидетельствует о нарушении или несоблюдении анаэробных условий. Следоват.......

Обсуждение

Целью данной методики является повышение эффективности культивирования анаэробных кишечных бактерий за счет улучшения качества условий отбора проб, обработки проб, а также составления и подготовки сред. Физико-химические условия образцов (pH, доступность углерода, а.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1