加强鸡胃肠道厌氧菌培养的策略

摘要

该方案提出了两种方法来改善厌氧肠道细菌的分离。第一个研究侧重于使用不同的培养基分离各种细菌。第二个侧重于特定微生物群的培养步骤，可能同化肌醇，以充分理解其生态意义。

摘要

鸡的胃肠道 （GIT） 是一个复杂的生态系统，其中含有数万亿种微生物，这些微生物在宿主的生理、消化、营养吸收、免疫系统成熟和预防病原体入侵方面发挥着关键作用。为了实现最佳的动物健康和生产力，必须表征这些微生物并了解它们的作用。虽然家禽的 GIT 拥有具有潜在益生菌应用的微生物库，但大多数多样性仍未得到探索。为了增强我们对未培养的微生物多样性的理解，需要齐心协力将这些微生物带入培养中。GIT 定植微生物的分离和培养可产生可重现的材料，包括细胞、DNA 和代谢物，为环境中的代谢过程提供了新的见解。如果不进行培养，这些生物体在其自然环境中的作用仍然不清楚，并且仅限于描述性水平。我们的目标是利用动物生理学、动物营养学、宏基因组学、饲料生物化学和现代培养策略的多学科知识，实施旨在改善从鸡 GIT 中分离各种厌氧微生物的培养策略。此外，我们的目标是在采样、运输和培养基制备方面实施适当的做法，这些做法已知会影响分离成功。适当的方法应确保一致的无氧环境、最佳大气条件、适当的宿主孵育温度，并根据其独特需求提供特定的营养需求。通过遵循这些方法，培养不仅会产生可重复的分离结果，而且还将促进分离程序，从而促进对鸡 GIT 中错综复杂的微生物生态系统的全面了解。

引言

微生物研究中培养的复兴补充了宏基因组学研究的见解，为测试以前仅部分描述和量化的代谢假设提供了材料。肠道细菌的培养为维持未来微生物-宿主相互作用的研究提供了材料，促进了靶向定植研究，并改善了分子相互作用研究 ^1,2,3。获得的有关胃肠道微生物的知识通过影响饮食配方和提高营养可用性来改善动物营养和福利⁴。这种理解有助于提高利用益生元和益生菌相互作用的性能。然而，需要深入研究才能全面了解生化和物理化学条件如何相互作用并影响微生物概况及其结构。为了实现这一目标，培养仍然势在必行，它是深入研究胃肠道环境中微生物群落错综复杂的动力学的重要工具。

与对人类肠道相关微生物的广泛研究和临床培养研究⁵ 相反，关于家畜微生物的报告主要使用有限范围的培养基进行分离，这可能会限制分离株的多样性 ^2,3。此外，正如 Tanaka 等人和 Kawasaki 等人所阐明的那样，培养基配方的改进和磷酸盐与琼脂相互作用的研究尚未用于肠道微生物组研究 6,7,8,9。

据报道，肌醇 （MI） 被认为是一种半必需物质，在各种代谢、生理和调节过程中起着关键作用^10,11。这些包括参与骨矿化、乳房肌肉发育、细胞信号传导、促进排卵和生育能力、调节神经元信号传导，以及作为家禽葡萄糖稳态和胰岛素调节的调节剂^10,11。MI 通过在关键的生化过程中相互转化发挥作用，包括糖酵解/糖异生过程、柠檬酸循环和磷酸戊糖途径。此外，它还作为磷脂酰肌醇 （PI） 的前体，后者进一步参与甘油磷脂代谢¹²。很少有研究报告说 MI 的代谢会导致骨骼稳定性和动物性能的改变。这包括饲料转化率和体重增加的提高，证明了它在动物体内吸收和利用后的影响^13,14。然而，MI 代谢的途径及其对家禽代谢的影响仍然难以捉摸¹⁵。此外，很少有研究提出细菌在 MI 利用中的潜在作用，特别是在高代谢活动的区域，例如回肠 16,17,18,19。

从动物的 GIT 中培养细菌的努力旨在增强基因组数据库和扩大研究，验证基于基因组的假设，并了解这些资源的生态重要性²⁰。这项工作的目的是改进从鸡的 GIT 中培养细菌的策略，以增强隔离多样性和靶向分离同化和代谢肌醇的感兴趣的生态群。

研究方案

该方案分为四个部分：取样、细菌分离、鉴定和所得微生物的保存。德国 Regierungspräsidium Tübingen 伦理委员会颁发了动物使用许可，批准编号为 HOH50/17 TE 和 HOH67-21TE。

1. 获取厌氧菌培养样品

1. 动物的维护
   1. 在霍恩海姆大学的实验站饲养 动物随意的商业 玉米饮食（Legehennen/Junghennenfutter;见 材料表）和房屋。
2. 运输溶液的制备
   1. 在样品采集前 1-2 天，制备含有 1.00 g/L 巯基乙酸钠、0.10 g/L 氯化钙二水合物 （CaCl_{2.2H 2}O） 和 0.5% 半胱氨酸²¹ 和 0.1% 刃天青钠溶液的运输溶液。
   2. 在 25 °C 下将培养基的 pH 值调节至 6.0 ± 0.2，并在 15 psi 压力下在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。
   3. 培养基冷却至约 50 °C 后，用带孔和橡胶塞的无菌螺帽更换培养基瓶的盖子。将两个无菌注射器针头插入橡胶塞的不同位置，并将疏水性注射器过滤器 （0.22 μm） 贴在其中一个针头上。
      注意：更换盖子以及插入针头和过滤器应在层流 （LAF） 内进行。
   4. 将 100% 氮气 （N₂） 管连接到注射器过滤器上，并在 1 psi 下将 N₂ 气体喷射到瓶中 10 分钟。
   5. 随后，将培养基瓶和无菌 Hungate 管转移到厌氧站中，并在无菌条件下将运输培养基转移到 Hungate 管中。将 Hungate 管完全填充到顶部，确保内部没有任何空气。
3. 屠宰和样本采集
   1. 在屠宰过程中，在整个过程中使用手套、口罩、塑料实验室围裙和无菌手术器械，保持无菌条件以避免污染。此外，使用乙醇和纸巾对工作台进行适当消毒，以维护无菌环境。
   2. 在实验站中，使用由 10% N₂、35% CO₂ 和 35% O₂ 组成的瓶装气体混合物麻醉 30 只 50 周龄的 Lohmann 蛋鸡，并立即将它们斩首。
      注意：麻醉和处死应由精通动物福利和科学程序的实验动物技术人员进行。这确保了牺牲程序符合道德标准、法律法规和安全准则。
   3. 在进行 GIT 切片解剖之前，使用无菌凯利止血钳（也称为凯利夹; 图 1）。
      注意：动物的解剖应由兽医或熟悉鸡解剖结构的训练有素的人员进行。
   4. 将每个单独的切片转移到一个装满运输介质的单独 Hungate 管中，并正确盖上盖子。如果需要，向试管中添加额外的运输介质以置换任何剩余的空气。
      注意：部分的转移是关键步骤，必须尽量减少部分的任何延迟或打开，以防止长时间接触氧气
4. 样品运输
   1. 小心处理 Hungate 管的运输，将它们放在聚苯乙烯泡沫塑料盒中，以防止任何破损风险。如果外部温度低于 15 °C，请使用热袋保持样品的温度。确保运输时间不超过 4 小时。
   2. 在厌氧站内小心地转移试管以进行进一步处理。

2. 分离厌氧菌

1. 培养基制备
   注：概述的方法介绍了培养基制备的各种注意事项。 表 1 说明了如何分配溶液以进行微生物的多样化分离的示例。
   1. 将培养基配方的成分分为四个溶液组：碳源、氮源、琼脂和矿物源。对于脑心输液 （BHI） 等富介质，并不总是能够分离的（参见 表 1 中的培养基 2 示例）。在这种情况下，请确保琼脂或其他溶液的单独制备和高压灭菌。
   2. 在所需最终培养基^{体积的 1} /4 中制备碳水化合物溶液，例如，在 250 mL 中制备总体积为 1 L 培养基。按照 表 1 中培养基 1 的示例，将 2 g 葡萄糖和 0.5 g 淀粉溶解在 250 mL 蒸馏水中。
   3. 用所需最终^{体积的 1} /4 培养基制备蛋白质溶液，例如，用 250 mL 制备总体积为 1 L 的培养基。按照 表 1 中培养基 1 的示例，将 10 g 蛋白胨溶解在 250 mL 蒸馏水中。
   4. 在培养基最终体积的 45% 至 48% 中制备琼脂溶液，例如，在 450 至 480 mL 中制备琼脂溶液，以获得 1 L 培养基的总体积。按照 表 1 中 mediu 1 的示例，将 15 g 琼脂溶解在 450 至 480 mL 蒸馏水中。
   5. 当培养基的最终体积为 1 L 时，在左侧 20 至 50 mL 体积的培养基中制备矿物溶液。按照 表 1 中培养基 1 的示例，将 0.5 g K₂HPO₄ 溶解在 20 至 50 mL 蒸馏水中。
   6. 将蛋白质溶液、琼脂溶液和矿物溶液在 121 °C 和 21 psi 压力下高压灭菌 15 分钟。将碳水化合物溶液在 110 °C 下以 5 psi 高压灭菌 30 分钟。
   7. 一旦所有溶液都无菌，将它们冷却至 50 °C，并在无菌条件下混合到适当的高压灭菌玻璃瓶中，该玻璃瓶的盖子带有孔和橡胶塞。在此之后，按照步骤 1.2.3 和 1.2.4 进行操作。
      注意：溶液的混合应在 LAF 内进行。
   8. 培养基混合和脱气后，倒入厌氧站内的无菌培养皿或试管中。
2. 厌氧菌的分离
   注：以下方法解释了一种分离策略，用于培养栖息在鸡消化道中的各种厌氧细菌。
   1. 将样品转移到厌氧站，该厌氧站含有由商业供应商提供的 80% N₂ （质量等级 5.0）、15% CO₂ （质量等级 3.0）和 5% H₂ （质量等级 5.0）组成的瓶装气体混合物（参见 材料表）。
   2. 在厌氧站内，使用高压灭菌镊子将切片从饥饿管转移到无菌培养皿中。
   3. 用无菌剪刀小心地切开切片，并使用无菌抹刀从肠段中提取大约 1 克消化物。
      注：取 1 g 消化液内容物后，将剩余的消化液废除并转移到相应的运输培养基管中进行靶向分离。
   4. 使用无菌生理溶液 （0.85% NaCl） 进行 10 倍连续稀释。
   5. 将 0.1 mL 样品从 10-4 至 10-7 的稀释液中分配到无菌且正确标记的培养皿培养基板中，并用无菌 Drigalski 刮刀铺展。
   6. 将厌氧站内的板在 39 °C 下孵育 24-48 小时。
      注意：在培养箱内孵育时，先将培养皿转移到密封箱中，然后再将培养皿从厌氧站中取出。
3. 特异性细菌群的靶向分离。
   注：以下方法解释了一种可能同化 MI 的厌氧菌的分离策略。
   1. 对于富集培养基、最低琼脂培养基和最低肉汤培养基的制备，请遵循 表 2 和 表 3 中指定的组合物，并遵循步骤 2.1 中概述的指南。高压灭菌过程后，将 0.2 mL/L 过滤无菌维生素混合物（如组合物中所述）添加到最低琼脂培养基和最低肉汤培养基中。
   2. 使用涡旋混合器将初始样品均质化 10-15 秒。随后，使用移液管以 5% 的速率将匀浆样品转移到含有富集培养基的试管中（例如，如果富集培养基的体积为 10 mL，则接种 0.5 mL 匀浆样品）。将新鲜接种的样品在厌氧站内于 39 °C 孵育 24 小时。
   3. 孵育后，使用涡旋混合器 10-15 秒或移液彻底混合富集的试管。随后，以 5% 的速率将混合样品转移到无菌最低肉汤培养基中，然后在 39 °C 下孵育 24 小时。
   4. 在无菌盐水溶液（即 0.85% NaCl）中连续稀释样品，从 1：10 稀释开始，一直持续到 1：1000 稀释。每次稀释后，使用涡旋混合器在室温下通过涡旋混合器 10-15 秒或通过移液将样品彻底均质化。
   5. 在无菌和厌氧条件下，将 1 mL 稀释的样品转移到培养皿中。将大约 15-20 mL 融化的初级琼脂培养基倒入培养皿中，轻轻水平旋转以均匀混合。
      注意：琼脂的温度应在 45 °C 左右，这样就不会出现结块并防止样品被加热杀死。培养基浇注应在厌氧条件下进行。
   6. 琼脂凝固后，将培养皿在 39 °C 下在厌氧站或培养箱内倒置位置孵育 24 小时。孵育 24 小时后，细菌菌落表现为嵌入培养基中的不同小点。
      注意：在培养箱内孵育培养皿时，先将板转移到密封箱中，然后再将其从厌氧站中取出。
   7. 使用无菌接种环，小心挑选单个细菌菌落并将其转移到单独的最低肉汤培养基管中。
   8. 将菌落转移到单个试管中后，将接种的试管在 39 °C 下厌氧孵育 24 小时。孵育后，培养基中的浑浊度增加将表明细菌生长。
      注意：每次在厌氧站内转移培养基瓶之前，都应按照前面步骤 2.1.7 中所述对其进行脱气。步骤 2-8 应在厌氧站内进行。

3. 厌氧菌的鉴定

1. 按照酶裂解方案，从 24 小时至 48 小时孵育时间的培养物中提取 DNA²²。
2. 将培养物在 4 °C 下以 3000 x g 离心 10 分钟，并使用移液管弃去上清液。
3. 悬浮在 2 mL PBS 中，用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤沉淀 2 次。通过使用涡旋混合器 10-15 秒使样品均质化。在 4 °C 下以 3000 x g 重复离心步骤 10 分钟，然后小心弃去上清液。
4. 将细胞沉淀悬浮在 0.2 mL PBS pH 7.4 中，并在 50 °C 下与 1 U 溶菌酶和 1 U 重组变溶菌素一起孵育 30 分钟，然后在 56 °C 下与 5 μL 蛋白酶 K 一起孵育 30 分钟。
5. 向每个试管中加入 4 μL 单位的 RNAseA，并在室温下孵育 10 分钟。将试管以 21168 x g 离心 1 分钟。回收上清液并使用磁珠纯化。
6. 根据 dsDNA 定量试剂盒的制造商说明（在 材料表中提到），用荧光法对 DNA 进行定量。
   注：提取的 DNA 可以储存在 -20 °C 下。
7. 按照表 4 所示的条件，使用引物 27f 和 1492r²³ 作为 DNA 样品作为 PCR 扩增的模板。为确保 PCR 反应成功，根据标准琼脂糖凝胶电泳方法，使用 1X TAE 缓冲液和 1% 琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳。
8. 使用市售 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物，以去除引物、核苷酸和其他污染物。
9. 将用于 Sanger 测序的 PCR 产物发送给合适的测序服务提供商。
   注：除测序外，服务提供商还可以提供包括 PCR 产物纯化在内的服务，但需额外付费。PCR 产物可以储存在 4 °C 或 -20°C 下。
10. 获得 FASTA 格式的测序结果以及色谱图文件（通常为 ABI 或 SCF 格式）后，使用生物信息学工具分析序列。使用序列分析软件打开并可视化色谱图文件。
    注：根据清晰和明显的峰检查色谱图的总体质量，且没有过多的噪音
11. 使用基本局部比对搜索工具 （BLAST） 工具²⁴ 和 Refseq 基因组数据库，在来自美国国家生物技术信息中心 （NCBI） 的非冗余 GenBank 16S 核糖体 RNA 数据库中比较扩增子并与密切相关的物种进行比对。
    注意：使用 NCBI BLAST 时，请在搜索栏中复制整个 FASTA 序列。

4. 纯细菌培养物的保存

1. 通过离心（3000 x g 10 分钟）或从平板上的轴系培养物中收集生物质，从 24 小时至 48 小时的良好生长培养物中收获细菌细胞。
2. 将细菌培养物悬浮在合适的等渗无菌溶液 （NaCl 0.85%） 中，并在 4 °C 下以 3000 x g 离心细菌溶液 10 分钟进行洗涤。
3. 弃去上清液，将细菌沉淀重悬于小体积无菌等渗溶液 （0.5 mL） 中。为确保去除任何生长培养基残留物，重复 1 次。
4. 将沉淀重悬于 0.8 mL 至 1 mL 无菌培养基浓缩物中，并用涡旋混合器匀浆 5-10 秒或轻轻移液。
5. 将 0.5 mL 细胞悬液转移至无菌且正确标记的 1 mL 冻存管中，并加入 0.5 mL 高压灭菌的 50% 甘油溶液。使用涡旋混合器对冷冻管进行均质化，并储存在 -80 °C 的冷冻架中（图 3）。
   注：将冻存管转移至 -80 °C 之前的所有步骤都应在厌氧站内完成。

结果

监测运输过程中的厌氧条件
由于添加了刃天青钠，在将样品转移到试管中之前，运输溶液的颜色变为粉红色，表明厌氧条件的维持中断或失败。因此，在运输过程中避免使用显示颜色变化的管子，而只使用显示没有颜色变化的管子，如图 2 所示。

测序结果分析
使用新鲜和纯培养物重复提取色谱图?...

讨论

该方法的目的是通过提高采样条件、样品处理以及培养基配方和制备的质量来增强厌氧菌的培养。在配制培养基时，必须考虑样品的物理化学条件（pH 值、碳、氮和辅因子的可用性）。与从猪、人类或小鼠获得的细菌培养物收集相比 ^1,26,27 关于鸡培养基选择的报告相当狭窄，即使对于高度关注的部分?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1