Strategie per migliorare la coltivazione di batteri anaerobici dal tratto gastrointestinale del pollo

Riepilogo

Il protocollo presenta due metodologie per migliorare l'isolamento dei batteri intestinali anaerobi. Il primo si concentra sull'isolamento di una vasta gamma di batteri utilizzando diversi terreni di coltura. La seconda si concentra sulle fasi di coltivazione di uno specifico gruppo microbico, possibilmente assimilando il mio-inositolo, per comprenderne appieno il significato ecologico.

Abstract

Il tratto gastrointestinale (GIT) del pollo è un ecosistema complesso che ospita trilioni di microbi che svolgono un ruolo fondamentale nella fisiologia dell'ospite, nella digestione, nell'assorbimento dei nutrienti, nella maturazione del sistema immunitario e nella prevenzione dell'intrusione di agenti patogeni. Per una salute e una produttività ottimali degli animali, è imperativo caratterizzare questi microrganismi e comprenderne il ruolo. Sebbene il GIT del pollame contenga un serbatoio di microrganismi con potenziali applicazioni probiotiche, la maggior parte della diversità rimane inesplorata. Per migliorare la nostra comprensione della diversità microbica non coltivata, sono necessari sforzi concertati per portare questi microrganismi in coltura. L'isolamento e la coltivazione di microrganismi che colonizzano il GIT producono materiale riproducibile, tra cui cellule, DNA e metaboliti, offrendo nuove informazioni sui processi metabolici nell'ambiente. Senza la coltivazione, il ruolo di questi organismi nei loro ambienti naturali rimane poco chiaro e limitato a un livello descrittivo. Il nostro obiettivo è quello di implementare strategie di coltivazione volte a migliorare l'isolamento di una vasta gamma di microbi anaerobi dal GIT del pollo, sfruttando le conoscenze multidisciplinari della fisiologia animale, della nutrizione animale, della metagenomica, della biochimica dei mangimi e delle moderne strategie di coltivazione. Inoltre, miriamo a implementare l'uso di pratiche adeguate per il campionamento, il trasporto e la preparazione dei terreni, che sono note per influenzare il successo dell'isolamento. Metodologie appropriate dovrebbero garantire un ambiente costantemente privo di ossigeno, condizioni atmosferiche ottimali, un'adeguata temperatura di incubazione dell'ospite e la fornitura di requisiti nutrizionali specifici in linea con le loro esigenze distintive. Seguendo queste metodologie, la coltivazione non solo produrrà risultati riproducibili per l'isolamento, ma faciliterà anche le procedure di isolamento, favorendo così una comprensione completa dell'intricato ecosistema microbico all'interno del GIT del pollo.

Introduzione

La rinascita della coltivazione nello studio dei microrganismi ha integrato le intuizioni degli studi metagenomici fornendo materiale per testare ipotesi metaboliche che in precedenza erano state descritte e quantificate solo parzialmente. La coltivazione di batteri intestinali fornisce materiale per sostenere la ricerca futura sulle interazioni microbico-ospite, facilitare studi di colonizzazione mirati e migliorare gli studi di interazione molecolare ^1,2,3. Le conoscenze acquisite sui microrganismi gastrointestinali hanno migliorato la nutrizione e il benessere degli animali influenzando le formulazioni dietetiche e aumentando la disponibilità di nutrienti⁴. Questa comprensione ha contribuito a migliorare le prestazioni nell'utilizzo dell'interazione prebiotica e probiotica. Tuttavia, è necessaria una ricerca approfondita per ottenere una comprensione completa di come le condizioni biochimiche e fisico-chimiche interagiscono e influenzano il profilo microbico e la sua struttura. Per raggiungere questo obiettivo, la coltivazione rimane un imperativo, fungendo da strumento cruciale per approfondire le intricate dinamiche delle comunità microbiche all'interno dell'ambiente gastrointestinale.

In contrasto con l'ampia ricerca sui microbi associati all'intestino umano e agli studi clinici sulla coltivazione⁵, i rapporti sui microrganismi del bestiame hanno utilizzato prevalentemente una gamma limitata di terreni per l'isolamento, limitando potenzialmente la diversità degli isolati ^2,3. Inoltre, i miglioramenti nella formulazione dei terreni e gli studi sull'interazione di fosfato e sali con l'agar, come chiarito da Tanaka et al. e Kawasaki et al., non sono ancora stati implementati per gli studi sul microbioma intestinale 6,7,8,9.

Considerato una sostanza semi-essenziale, il mio-inositolo (MI) è stato segnalato per svolgere un ruolo fondamentale in diversi processi metabolici, fisiologici e regolatori^10,11. Questi includono il coinvolgimento nella mineralizzazione ossea, nello sviluppo del muscolo mammario, nella segnalazione cellulare, nella promozione dell'ovulazione e della fertilità, nella modulazione della segnalazione neuronale e nell'agire come regolatore dell'omeostasi del glucosio e della regolazione dell'insulina nel pollame^10,11. L'MI svolge un ruolo come precursore attraverso la sua interconversione all'interno di processi biochimici fondamentali, tra cui il processo di glicolisi/gluconeogenesi, il ciclo dell'acido citrico e la via del pentoso fosfato. Inoltre, funge anche da precursore del fosfatidilinositolo (PI), che è ulteriormente coinvolto nel metabolismo dei glicerofosfolipidi¹². Poche indagini hanno riportato che la metabolizzazione dell'infarto miocardico porta ad alterazioni della stabilità ossea e delle prestazioni degli animali. Ciò include miglioramenti nel tasso di conversione del mangime e nell'aumento di peso corporeo, dimostrando il suo impatto dopo l'assorbimento e l'utilizzo all'interno dell'animale^13,14. Tuttavia, la via per la metabolizzazione dell'infarto miocardico e il suo impatto sul metabolismo del pollame rimangono sfuggenti¹⁵. Inoltre, pochi studi propongono un potenziale ruolo dei batteri nell'utilizzo dell'infarto miocardico, in particolare in regioni ad alta attività metabolica come l'ileo 16,17,18,19.

Gli sforzi per la coltivazione di batteri a partire dal GIT degli animali mirano a migliorare i database genomici e ad ampliare la ricerca, verificare le ipotesi basate sul genoma e comprendere l'importanza ecologica di queste risorse²⁰. L'obiettivo di questo lavoro è quello di migliorare le strategie per la coltivazione batterica dal GIT del pollo per migliorare la diversità di isolamento e l'isolamento mirato di un gruppo ecologico di interesse che assimila e metabolizza il mio-inositolo.

Protocollo

Il protocollo è diviso in quattro parti: campionamento, isolamento batterico, identificazione e conservazione dei microrganismi ottenuti. Le autorizzazioni approvate per l'uso degli animali sono state rilasciate dalla commissione etica del Regierungspräsidium Tübingen, in Germania, con i numeri di approvazione HOH50/17 TE e HOH67-21TE.

1. Ottenimento di campioni per la coltivazione di batteri anaerobi

1. Mantenimento degli animali
   1. Mantenere gli animali con una dieta commerciale ad libitum a base di mais (Legehennen/ Junghennenfutter; vedi Tabella dei materiali) e alloggiare presso la stazione sperimentale dell'Università di Hohenheim.
2. Preparazione della soluzione di trasporto
   1. A 1-2 giorni prima della raccolta del campione, preparare la soluzione di trasporto contenente 1,00 g/L di tioglicolato di sodio, 0,10 g/L di cloruro di calcio diidrato (CaCl_{2,2H 2}O) e lo 0,5% di cisteina²¹ e lo 0,1% di soluzione di risazurina di sodio.
   2. Regolare il pH del fluido a 6,0 ± 0,2 a 25 °C e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti a una pressione di 15 psi.
   3. Dopo che il terreno si è raffreddato a circa 50 °C, sostituire il tappo del flacone del terreno con un tappo a vite sterile con foro e tappo di gomma. Inserire due aghi per siringa sterili nel tappo di gomma in posizioni diverse e applicare un filtro per siringa idrofobico (0,22 μm) su uno degli aghi.
      NOTA: La sostituzione dei tappi e l'inserimento degli aghi e del filtro devono essere effettuati all'interno di un flusso d'aria laminare (LAF).
   4. Collegare il tubo di azoto al 100% (N₂) al filtro della siringa e spargere il gas N₂ nel flacone per 10 minuti a 1 psi.
   5. Successivamente, trasferire la bottiglia del terreno e le provette sterili di Hungate nella stazione anaerobica e trasferire asetticamente il mezzo di trasporto nelle provette di Hungate. Riempire completamente i tubi di Hungate fino in cima, assicurandosi che non ci sia aria all'interno.
3. Macellazione e raccolta campioni
   1. Durante il processo di macellazione, mantenere le condizioni assiniche per evitare la contaminazione utilizzando guanti, maschera, grembiule da laboratorio in plastica e strumenti chirurgici sterili durante l'intera procedura. Inoltre, igienizzare adeguatamente il banco di lavoro utilizzando etanolo e fazzoletti per mantenere un ambiente sterile.
   2. Nella stazione sperimentale, anestetizzare 10 galline ovaiole Lohmann di 50 settimane utilizzando una miscela di gas in bombole composta da 35% di N₂, 35% CO₂ e 30% O₂ e decapitarle immediatamente.
      NOTA: L'anestesia e il sacrificio devono essere condotti da un tecnico di animali da laboratorio esperto in benessere degli animali e procedure scientifiche. Ciò garantisce che la procedura di sacrificio aderisca agli standard etici, alle normative legali e alle linee guida sulla sicurezza.
   3. Prima di procedere con la dissezione della sezione GIT, fissare il segmento intestinale richiesto, vale a dire la coltura, l'ileo e il digiuno, utilizzando l'emostatico Kelly sterile (noto anche come pinza Kelly; Figura 1).
      NOTA: La dissezione dell'animale deve essere eseguita da un veterinario o da una persona ben addestrata che abbia familiarità con l'anatomia dei polli.
   4. Trasferire ogni singola sezione in un tubo Hungate separato riempito con il mezzo di trasporto e chiudere bene il coperchio. Se necessario, aggiungere ulteriore mezzo di trasporto al tubo per spostare l'aria residua.
      NOTA: Il trasferimento della sezione è un passaggio cruciale ed è essenziale ridurre al minimo qualsiasi ritardo o apertura della sezione per evitare un'esposizione prolungata all'ossigeno
4. Trasporto del campione
   1. Maneggiare con cura il trasporto dei tubi Hungate, inserendoli all'interno di una scatola di polistirolo per evitare qualsiasi rischio di rottura. Nel caso in cui la temperatura esterna sia inferiore a 15 °C, mantenere la temperatura del campione utilizzando confezioni calde. Assicurarsi che il tempo di trasporto non superi le 4 ore.
   2. Trasferire con cura i tubi all'interno della stazione anaerobica per l'ulteriore processo.

2. Isolamento di batteri anaerobi

1. Preparazione dei terreni di coltura
   NOTA: Il metodo delineato presenta varie considerazioni per la preparazione dei terreni di coltura. La Tabella 1 illustra un esempio di come sono suddivise le soluzioni per l'isolamento diversificato di microrganismi.
   1. Dividere gli ingredienti della formulazione del terreno da utilizzare in quattro gruppi di soluzioni: fonte di carbonio, fonte di azoto, agar e fonte minerale. Per i terreni ricchi come l'infusione cervello-cuore (BHI), la separazione non è sempre possibile (vedere l'esempio del terreno 2 nella Tabella 1). In questi casi, assicurarsi che la preparazione e la sterilizzazione in autoclave siano separate dell'agar o di altre soluzioni.
   2. Preparare la soluzione di carboidrati in 1/^{4 del volume} finale di terreno richiesto, ad esempio in 250 ml per un volume totale di 1 litro di terreno. Seguendo l'esempio del terreno 1 nella Tabella 1, sciogliere 2 g di destrosio e 0,5 g di amido in 250 ml di acqua distillata.
   3. Preparare la soluzione proteica in 1/^{4 del volume} finale di terreno richiesto, ad esempio in 250 mL per un volume totale di 1 L di terreno. Seguendo l'esempio del terreno 1 nella Tabella 1, sciogliere 10 g di peptone in 250 ml di acqua distillata.
   4. Preparare la soluzione di agar nel 45-48% del volume finale del terreno, ad esempio in 450-480 ml per un volume totale di 1 litro di terreno. Seguendo l'esempio di mediu 1 nella Tabella 1, sciogliere 15 g di agar in 450-480 ml di acqua distillata.
   5. Preparare la soluzione minerale nel volume sinistro di 20-50 ml di terreno quando il volume finale di terreno è di 1 L. Seguendo l'esempio del terreno 1 nella Tabella 1, sciogliere 0,5 g di K₂HPO₄ in 20-50 ml di acqua distillata.
   6. Autoclavare in autoclave la soluzione proteica, la soluzione di agar e le soluzioni minerali a 121 °C per 15 minuti a una pressione di 21 psi. Autoclavare la soluzione di carboidrati a 110 °C per 30 minuti a 5 psi.
   7. Una volta che tutte le soluzioni sono sterili, raffreddarle a 50 °C e mescolarle in condizioni sterili in un apposito flacone di vetro autoclavato con tappo con foro e tappo di gomma. Successivamente, seguire i passaggi 1.2.3 e 1.2.4.
      NOTA: La miscelazione delle soluzioni deve essere effettuata all'interno di un LAF.
   8. Una volta che il terreno è stato miscelato e degassato, versarlo in piastre di Petri sterili o tubi all'interno della stazione anaerobica.
2. Isolamento di batteri anaerobi
   NOTA: La seguente metodologia spiega una strategia di isolamento per coltivare un'ampia gamma di batteri anaerobi che abitano il tratto digestivo del pollo.
   1. Trasferire i campioni in una stazione anaerobica contenente una miscela di gas in bombola composta da 80% N₂ (livello di qualità 5.0), 15% CO₂ (livello di qualità 3.0) e 5% H₂ (livello di qualità 5.0) fornita da un fornitore commerciale (vedi Tabella dei materiali).
   2. All'interno della stazione anaerobica, trasferire la sezione dalla provetta dell'hungato alla piastra di Petri sterile utilizzando una pinza autoclavata.
   3. Tagliare con cura la sezione con un paio di forbici sterili ed estrarre circa 1 g di digestato dal segmento intestinale utilizzando una spatola sterile.
      NOTA: Dopo aver prelevato 1 g di contenuto di digesta, scartare e trasferire il digesta rimanente nella rispettiva provetta del terreno di trasporto per l'isolamento mirato.
   4. Eseguire una diluizione seriale di 10 volte utilizzando una soluzione fisiologica sterile (NaCl allo 0,85%).
   5. Erogare 0,1 mL di campione dalle diluizioni da 10−4 a 10−7 in piastre di Petri sterili e adeguatamente etichettate e stendere con uno spatel Drigalski sterile.
   6. Incubare le piastre all'interno della stazione anaerobica per 24-48 ore a 39 °C.
      NOTA: Durante l'incubazione all'interno di un'incubatrice, trasferire le piastre di Petri in una scatola ermetica prima di estrarre le piastre di Petri dalla stazione anaerobica.
3. Isolamento mirato di uno specifico gruppo batterico.
   NOTA: La seguente metodologia spiega una strategia di isolamento per i batteri anaerobi che possono potenzialmente assimilare l'infarto miocardico.
   1. Per la preparazione del terreno di arricchimento, del terreno di agar minimo e del mezzo di brodo minimo, seguire la composizione specificata nella Tabella 2 e nella Tabella 3, aderendo alle linee guida delineate nel passaggio 2.1. Aggiungere 0,2 mL/L di miscela di vitamine sterili con filtro (come indicato nella composizione) in un terreno di agar minimo e in un terreno di brodo minimo dopo il processo di sterilizzazione in autoclave.
   2. Omogeneizzare il campione iniziale utilizzando un miscelatore a vortice per 10-15 s. Successivamente, trasferire il campione omogeneizzato nella provetta contenente il terreno di arricchimento a una velocità del 5% (ad es. se il volume del terreno di arricchimento è di 10 mL, inoculare 0,5 mL di campione omogeneizzato) utilizzando una pipetta. Incubare il campione appena inoculato per 24 ore a 39 °C all'interno della stazione anaerobica.
   3. Dopo l'incubazione, miscelare accuratamente la provetta arricchita utilizzando un miscelatore a vortice per 10-15 s o pipettando. Successivamente, trasferire il campione miscelato in un terreno di brodo minimo sterile a una velocità del 5% e quindi incubare per 24 ore a 39 °C.
   4. Diluire in serie i campioni in soluzione salina sterile (cioè NaCl allo 0,85%), iniziando con una diluizione 1:10 e continuando fino alla diluizione 1:1000. Dopo ogni diluizione, omogeneizzare accuratamente il campione a temperatura ambiente utilizzando un miscelatore a vortice per 10-15 s o pipettando.
   5. In condizioni sterili e anaerobiche, trasferire 1 mL di campione diluito in una piastra di Petri. Versare circa 15-20 ml di terreno di coltura con agar minimo fuso nella piastra di Petri e agitare delicatamente orizzontalmente per una miscelazione uniforme.
      NOTA: La temperatura dell'agar deve essere di circa 45 °C in modo che non siano presenti grumi e per evitare che il campione venga ucciso dal calore. Il versamento medio deve essere effettuato in condizioni anaerobiche.
   6. Dopo la solidificazione dell'agar, incubare le piastre di Petri per 24 ore a 39 °C in posizione capovolta all'interno di una stazione anaerobica o in incubatore. Dopo 24 ore di incubazione, le colonie batteriche appaiono come piccoli punti distinti incorporati nel terreno.
      NOTA: Quando si incuba la capsula di Petri all'interno di un'incubatrice, trasferire le piastre in una scatola ermetica prima di estrarle dalla stazione anaerobica.
   7. Utilizzando un circuito di inoculazione sterile, prelevare con cura la singola colonia batterica e trasferirla in provette separate di brodo minimo.
   8. Dopo aver trasferito le colonie in provette individuali, incubare anaerobicamente le provette inoculate a 39 °C per 24 ore. Dopo l'incubazione, l'aumento della torbidità nel terreno indicherà la crescita batterica.
      NOTA: Ogni volta prima di trasferire le bottiglie dei terreni all'interno della stazione anaerobica, queste devono essere degassate come indicato in precedenza al punto 2.1.7. I passaggi 2-8 devono essere eseguiti all'interno della stazione anaerobica.

3. Identificazione di batteri anaerobi

1. Estrarre il DNA da colture con un tempo di incubazione compreso tra 24 e 48 ore, seguendo un protocollo di lisi enzimatica²².
2. Centrifugare la coltura a 3000 x g per 10 minuti a 4 °C e scartare il surnatante utilizzando una pipetta.
3. Lavare il pellet 2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sospendendo in 2 mL di PBS. Omogeneizzare il campione utilizzando un miscelatore a vortice per 10-15 s. Ripetere la fase di centrifugazione a 3000 x g per 10 minuti a 4 °C e gettare accuratamente il surnatante.
4. Sospendere il pellet cellulare in 0,2 mL di PBS pH 7,4 e incubare a 50 °C con 1 U di lisozima e 1 U di mutanolisina ricombinante per 30 minuti, seguita da un'incubazione di 30 minuti a 56 °C con 5 μL di proteinasi K.
5. Aggiungere 4 μL di unità di RNAseA a ciascuna provetta e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Provette da centrifuga a 21168 x g per 1 min. Recuperare il surnatante e purificare utilizzando perle magnetiche.
6. Eseguire la quantificazione del DNA con un metodo fluorimetrico secondo le istruzioni del produttore per il kit di quantificazione del dsDNA (menzionato nella Tabella dei materiali).
   NOTA: Il DNA estratto può essere conservato a -20 °C.
7. Utilizzare campioni di DNA come modelli per l'amplificazione PCR utilizzando i primer 27f e 1492r²³ seguendo le condizioni mostrate nella Tabella 4. Per garantire che la reazione di PCR abbia avuto successo, eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio secondo il metodo standard di elettroforesi su gel di agarosio utilizzando 1X tampone TAE e 1% di agarosio.
8. Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione PCR commerciale per eliminare primer, nucleotidi e altri contaminanti.
9. Inviare il prodotto PCR per il sequenziamento Sanger al fornitore di servizi di sequenziamento adatto.
   NOTA: Oltre al sequenziamento, i fornitori di servizi possono anche fornire servizi tra cui la purificazione del prodotto PCR con costi aggiuntivi. I prodotti PCR possono essere conservati a 4 °C o a -20 °C.
10. Dopo aver ottenuto i risultati del sequenziamento in formato FASTA insieme al file del cromatogramma (comunemente in formato ABI o SCF), analizzare le sequenze utilizzando strumenti bioinformatici. Utilizzare il software di analisi delle sequenze per aprire e visualizzare il file del cromatogramma.
    NOTA: La qualità complessiva del cromatogramma è stata verificata sulla base di picchi chiari e distinti senza rumore eccessivo
11. Confronta gli ampliconi e allinea le specie strettamente imparentate nel database di RNA ribosomiale GenBank 16S non ridondante del National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizzando lo strumento BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)²⁴ e il database del genoma Refseq.
    NOTA: Quando si utilizza NCBI BLAST, copiare l'intera sequenza FASTA nella barra di ricerca.

4. Conservazione di colture batteriche pure

1. Raccogliere cellule batteriche da una coltura ben cresciuta da 24 a 48 ore mediante centrifugazione (3000 x g per 10 minuti) o raccolta di biomassa da una coltura axenica su una piastra.
2. Sospendere la coltura batterica in un'idonea soluzione isotonica sterile (NaCl 0,85%) e lavare centrifugando la soluzione batterica a 3000 x g per 10 min a 4 °C.
3. Scartare il surnatante e risospendere il pellet batterico in un piccolo volume di soluzione isotonica sterile (0,5 mL). Per garantire la rimozione di eventuali residui di terreno di coltura, ripetere 1 volta.
4. Risospendere il pellet in 0,8 mL a 1 mL di concentrato di terreno di coltura sterile e omogeneizzare con un miscelatore a vortice per 5-10 s o pipettandolo delicatamente.
5. Trasferire 0,5 mL di sospensione cellulare in un crioviale sterile e adeguatamente marcato da 1 mL e aggiungere 0,5 mL di soluzione autoclavata di glicerolo al 50%. Omogeneizzare il crioviale utilizzando un miscelatore a vortice e conservarlo in una griglia per congelatore a -80 °C (Figura 3).
   NOTA: Tutti i passaggi prima di trasferire i crioviali a -80 °C devono essere eseguiti all'interno della stazione anaerobica.

Risultati

Monitoraggio delle condizioni anaerobiche durante il trasporto
A causa dell'aggiunta di risazurina sodica, il cambiamento di colore della soluzione di trasporto in rosa prima del trasferimento del campione nella provetta indica un'interruzione o un fallimento nel mantenimento delle condizioni anaerobiche. Quindi, i tubi che mostravano un cambiamento di colore sono stati esclusi dall'essere utilizzati durante il trasporto e sono stati utilizzati solo i tubi che non mos...

Discussione

Lo scopo di questa metodologia è quello di migliorare la coltivazione di batteri intestinali anaerobici migliorando la qualità delle condizioni di campionamento, l'elaborazione dei campioni e la formulazione e la preparazione dei terreni. Le condizioni fisico-chimiche dei campioni (pH, disponibilità di carbonio, azoto e cofattori) devono essere prese in considerazione durante la formulazione dei terreni di coltura. Rispetto alle raccolte di colture batteriche ottenute da suini, esseri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1