التعرف المباشر على الميكروبات باستخدام نظام تحديد الميكروبات الآلي لتسهيل طريقة EUCAST RAST بدون قياس الطيف الكتلي

Summary

طورت EUCAST بروتوكول اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (AST) المباشر لمزارع الدم الآلية. ومع ذلك ، يمكن تجنب اعتماده على التحديد الميكروبي القائم على قياس الطيف الكتلي باستخدام بروتوكول تحضير اللقاح المباشر في نظام تحديد الميكروبات الآلي. يمكن أن يوفر هذا النهج تقارير AST في غضون 24 ساعة من جمع العينات.

Abstract

الإنتان سالب الجرام (GN) هو حالة طبية طارئة حيث تعتمد الإدارة في البيئات المحدودة الموارد على تقنيات الاستزراع الميكروبيولوجي التقليدية التي توفر النتائج في 3-4 أيام. إدراكا لهذا التأخير في وقت الاستجابة (TAT) ، طور كل من EUCAST و CLSI بروتوكولات لتحديد نتائج AST مباشرة من زجاجات زراعة الدم الآلية التي تم الإبلاغ عنها بشكل إيجابي (+aBCs). تم تقديم بروتوكول EUCAST السريع AST (RAST) لأول مرة في عام 2018 ، حيث يمكن الإبلاغ عن نقاط توقف قطر المنطقة لأربعة عوامل مسببة شائعة لإنتان GN ، أي الإشريكية القولونية ، والكلبسيلة الرئوية ، والزائفة الزنجارية ، ومركب Acinetobacter baumannii . ومع ذلك ، فإن تلك المختبرات السريرية التي نفذت هذه الطريقة في سير عملها الروتيني تعتمد على تحديد الميكروبات القائم على قياس الطيف الكتلي ، وهو أمر غير متاح بسهولة ، مما يحول دون تنفيذها في بيئات محدودة الموارد. للتحايل عليه ، قمنا بتقييم بروتوكول اللقاح المباشر (DIP) باستخدام نظام تجاري آلي لتحديد الميكروبات واختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (aMIAST) لتمكين التعرف المبكر على الميكروبات في غضون 8 ساعات من الإبلاغ الإيجابي عن aBC. قمنا بتقييم هذا البروتوكول من يناير إلى أكتوبر 2023 لتحديد أربعة RAST GN (RR-GN) التي يمكن الإبلاغ عنها في aBC الذي تم وضع علامة إيجابية عليه. تمت مقارنة نتائج تحديد الميكروبات في DIP مع بروتوكول تحضير اللقاح القياسي (SIP) في aMIAST. من بين 204 + aBCs مع GN أحادي الشكل (+ naBC) ، تم تحديد واحد من 4 RR-GN في 105 + naBCs بواسطة SIP (E. coli: 50 ، K. pneumoniae: 20 ، P. aeruginosa: 9 و A. baumannii complex: 26). من بين هؤلاء، تم تحديد 94٪ (98/105) بشكل صحيح من قبل DIP في حين كانت معدلات الخطأ الرئيسي والخطأ الكبير جدا 6٪ (7/105) و 1.7٪ (4/240)، على التوالي. عندما يتم إجراء DIP لتحديد الميكروبات باستخدام طريقة EUCAST RAST ، يمكن تقديم تقارير سريرية مؤقتة في غضون 24 ساعة من استلام العينة. وينطوي هذا النهج على إمكانية الحد بدرجة كبيرة من مهلة التنفيذ التكنولوجية، مما يتيح في وقت مبكر إجراء العلاج المناسب المضاد للميكروبات.

Introduction

يتم تعريف الإنتان ، وهو مشكلة صحية عالمية مهمة ، على أنه خلل وظيفي في الأعضاء يهدد الحياة بسبب استجابة المضيف غير المنظمة للعدوى. قدرت دراسة العبء العالمي للأمراض أن هناك 48.9 مليون حالة تعفن الدم و 11 مليون حالة وفاة مرتبطة بالإنتان في جميع أنحاء العالم في عام 2017 ، وهو ما يمثل ما يقرب من 20٪ من جميع الوفيات العالمية¹. حوالي 2/3^{الثالثة} من التهابات مجرى الدم (BSI) التي تسبب الوفيات ناتجة عن مسببات الأمراض البكتيرية سالبة^{الجرام 2}. الأسباب الرئيسية للوفيات بين سلبية الجرام (GN) هي الإشريكية القولونية ، الكلبسيلة الرئوية ، الزائفة الزنجارية ، و Acinetobacter baumannii ، والتي ....

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة ، الممولة من منحة البحث الداخلي المقدمة للدكتور أيوش غوبتا من قبل AIIMS Bhopal ، من قبل لجنة الأخلاقيات الإنسانية المؤسسية (IHEC) برسالة رقم: IHEC- LOP / 2022 / IL072.

ملاحظة: تم استخدام حجم عينة من 5 مل بناء على الدراسات التي أجراها Quesada et ^al.25 و Munoz-Davila et ^al.27.

1. بروتوكول اللقاح القياسي (SIP) لتحديد البكتيريا باستخدام aMIAST

1. ارتد قفازات نظيفة ، وداخل خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية (BSC) ، قم بتطهير حاجز + naBC بمسحة تحتوي على 70٪ كحول الأيزوبروبيل.
2. ارسم حوالي 1 مل من خليط مرق الدم ب....

النتائج

النتائج العامة
خلال فترة الدراسة ، خضع 240 + naBCs لتحديد الهوية بواسطة aMIAST باستخدام كل من DIP و SIP. من بين هؤلاء ، تم العثور على 15٪ (36/240) + naBCs لتكون متعددة الميكروبات بعد الحضانة الليلية على الوسائط المطلية. ومن بين 204 +naBCs، كانت نسبة RR-GN التي حددتها SIP 51.5٪ (105/204). من بينها ، 47.6 ٪ (50/105) كانت ?.......

Discussion

باستخدام DIP ، نجحنا في تحديد RR-GNs بدقة تشخيصية كبيرة. كان متوسط TTI بعد الإبلاغ الإيجابي عن aBC 507 دقيقة فقط (~ 8.5 ساعة). وبالتالي ، عندما يتم ذلك بالاقتران مع طريقة EUCAST RAST لتحديد AST ، يمكن أن يعطي تحديد العزل في وقت قراءة 8 ساعات AST. هذا النهج لديه القدرة على تنفيذ طريقة EUCAST RAST التي تغني عن الحاجة إلى .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli