A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

طورت EUCAST بروتوكول اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (AST) المباشر لمزارع الدم الآلية. ومع ذلك ، يمكن تجنب اعتماده على التحديد الميكروبي القائم على قياس الطيف الكتلي باستخدام بروتوكول تحضير اللقاح المباشر في نظام تحديد الميكروبات الآلي. يمكن أن يوفر هذا النهج تقارير AST في غضون 24 ساعة من جمع العينات.

Abstract

الإنتان سالب الجرام (GN) هو حالة طبية طارئة حيث تعتمد الإدارة في البيئات المحدودة الموارد على تقنيات الاستزراع الميكروبيولوجي التقليدية التي توفر النتائج في 3-4 أيام. إدراكا لهذا التأخير في وقت الاستجابة (TAT) ، طور كل من EUCAST و CLSI بروتوكولات لتحديد نتائج AST مباشرة من زجاجات زراعة الدم الآلية التي تم الإبلاغ عنها بشكل إيجابي (+aBCs). تم تقديم بروتوكول EUCAST السريع AST (RAST) لأول مرة في عام 2018 ، حيث يمكن الإبلاغ عن نقاط توقف قطر المنطقة لأربعة عوامل مسببة شائعة لإنتان GN ، أي الإشريكية القولونية ، والكلبسيلة الرئوية ، والزائفة الزنجارية ، ومركب Acinetobacter baumannii . ومع ذلك ، فإن تلك المختبرات السريرية التي نفذت هذه الطريقة في سير عملها الروتيني تعتمد على تحديد الميكروبات القائم على قياس الطيف الكتلي ، وهو أمر غير متاح بسهولة ، مما يحول دون تنفيذها في بيئات محدودة الموارد. للتحايل عليه ، قمنا بتقييم بروتوكول اللقاح المباشر (DIP) باستخدام نظام تجاري آلي لتحديد الميكروبات واختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (aMIAST) لتمكين التعرف المبكر على الميكروبات في غضون 8 ساعات من الإبلاغ الإيجابي عن aBC. قمنا بتقييم هذا البروتوكول من يناير إلى أكتوبر 2023 لتحديد أربعة RAST GN (RR-GN) التي يمكن الإبلاغ عنها في aBC الذي تم وضع علامة إيجابية عليه. تمت مقارنة نتائج تحديد الميكروبات في DIP مع بروتوكول تحضير اللقاح القياسي (SIP) في aMIAST. من بين 204 + aBCs مع GN أحادي الشكل (+ naBC) ، تم تحديد واحد من 4 RR-GN في 105 + naBCs بواسطة SIP (E. coli: 50 ، K. pneumoniae: 20 ، P. aeruginosa: 9 و A. baumannii complex: 26). من بين هؤلاء، تم تحديد 94٪ (98/105) بشكل صحيح من قبل DIP في حين كانت معدلات الخطأ الرئيسي والخطأ الكبير جدا 6٪ (7/105) و 1.7٪ (4/240)، على التوالي. عندما يتم إجراء DIP لتحديد الميكروبات باستخدام طريقة EUCAST RAST ، يمكن تقديم تقارير سريرية مؤقتة في غضون 24 ساعة من استلام العينة. وينطوي هذا النهج على إمكانية الحد بدرجة كبيرة من مهلة التنفيذ التكنولوجية، مما يتيح في وقت مبكر إجراء العلاج المناسب المضاد للميكروبات.

Introduction

يتم تعريف الإنتان ، وهو مشكلة صحية عالمية مهمة ، على أنه خلل وظيفي في الأعضاء يهدد الحياة بسبب استجابة المضيف غير المنظمة للعدوى. قدرت دراسة العبء العالمي للأمراض أن هناك 48.9 مليون حالة تعفن الدم و 11 مليون حالة وفاة مرتبطة بالإنتان في جميع أنحاء العالم في عام 2017 ، وهو ما يمثل ما يقرب من 20٪ من جميع الوفيات العالمية1. حوالي 2/3الثالثة من التهابات مجرى الدم (BSI) التي تسبب الوفيات ناتجة عن مسببات الأمراض البكتيرية سالبةالجرام 2. الأسباب الرئيسية للوفيات بين سلبية الجرام (GN) هي الإشريكية القولونية ، الكلبسيلة الرئوية ، الزائفة الزنجارية ، و Acinetobacter baumannii ، والتي ....

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة ، الممولة من منحة البحث الداخلي المقدمة للدكتور أيوش غوبتا من قبل AIIMS Bhopal ، من قبل لجنة الأخلاقيات الإنسانية المؤسسية (IHEC) برسالة رقم: IHEC- LOP / 2022 / IL072.

ملاحظة: تم استخدام حجم عينة من 5 مل بناء على الدراسات التي أجراها Quesada et al.25 و Munoz-Davila et al.27.

1. بروتوكول اللقاح القياسي (SIP) لتحديد البكتيريا باستخدام aMIAST

  1. ارتد قفازات نظيفة ، وداخل خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية (BSC) ، قم بتطهير حاجز + naBC بمسحة تحتوي على 70٪ كحول الأيزوبروبيل.
  2. ارسم حوالي 1 مل من خليط مرق الدم ب....

النتائج

النتائج العامة
خلال فترة الدراسة ، خضع 240 + naBCs لتحديد الهوية بواسطة aMIAST باستخدام كل من DIP و SIP. من بين هؤلاء ، تم العثور على 15٪ (36/240) + naBCs لتكون متعددة الميكروبات بعد الحضانة الليلية على الوسائط المطلية. ومن بين 204 +naBCs، كانت نسبة RR-GN التي حددتها SIP 51.5٪ (105/204). من بينها ، 47.6 ٪ (50/105) كانت ?.......

Discussion

باستخدام DIP ، نجحنا في تحديد RR-GNs بدقة تشخيصية كبيرة. كان متوسط TTI بعد الإبلاغ الإيجابي عن aBC 507 دقيقة فقط (~ 8.5 ساعة). وبالتالي ، عندما يتم ذلك بالاقتران مع طريقة EUCAST RAST لتحديد AST ، يمكن أن يعطي تحديد العزل في وقت قراءة 8 ساعات AST. هذا النهج لديه القدرة على تنفيذ طريقة EUCAST RAST التي تغني عن الحاجة إلى .......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل الدراسة من خلال منحة البحث الداخلي المقدمة للدكتور أيوش جوبتا من قبل AIIMS Bhopal. نحن نعترف بمساهمة فنيي المختبرات والأطباء المقيمين الذين أجروا الاختبارات وقرأوها بجد خلال ساعات الروتين والطوارئ.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD035-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Amoxyclav disk (20/10 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD063-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Cefotaxime disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD295E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ceftazidime disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD062A-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ciprofloxacin disk (5 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD060-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD010-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Gentamicin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD016-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Imipenem disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD073-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Levofloxacin disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD216-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Meropenem disk 10 µg Himedia, Mumbai, IndiaSD727-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD292E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Tobramycin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD044-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
ATCC Escherichia coli 25922Microbiologics, Minnesota USA0335ARecommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France412CM8423Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, IndiaDFP-2/21-22/149For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2Himedia, Mumbai, IndiaM834-500GPreparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BLLaby Instruments, Ambala, IndiaHLL/2021-22/021Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser BrandTech, Essex CT, EnglandV1200Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar Himedia, Mumbai, IndiaM008-500GDifferential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, IndiaNJ478162Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India521020Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar Himedia, Mumbai, IndiaM173-500GAntimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4Himedia, Mumbai, IndiaLA019For streaking onto culture media
Nichrome straight wireHimedia, Mumbai, IndiaLA022For stab inoculation
Nulife sterile GlovesMRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, IndiaFor safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367815Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep bloodLabline Trading Co., Hyderabad, India70014Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367954Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)Himedia, Mumbai, IndiaPW005-1X500NOLawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/ccNihal Healthcare, Solan, India2213805NB2Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kitbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France422219Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceV1204Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France533306-4 REVStand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubesbioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceTubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceVKC15144Automated identification and AST system
VITEK-2 GN cardbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France21341Identification of Gram negative bacilli

References

  1. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990–2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  2. Ikuta, K. S., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

EUCAST RAST

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved