JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

طورت EUCAST بروتوكول اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (AST) المباشر لمزارع الدم الآلية. ومع ذلك ، يمكن تجنب اعتماده على التحديد الميكروبي القائم على قياس الطيف الكتلي باستخدام بروتوكول تحضير اللقاح المباشر في نظام تحديد الميكروبات الآلي. يمكن أن يوفر هذا النهج تقارير AST في غضون 24 ساعة من جمع العينات.

Abstract

الإنتان سالب الجرام (GN) هو حالة طبية طارئة حيث تعتمد الإدارة في البيئات المحدودة الموارد على تقنيات الاستزراع الميكروبيولوجي التقليدية التي توفر النتائج في 3-4 أيام. إدراكا لهذا التأخير في وقت الاستجابة (TAT) ، طور كل من EUCAST و CLSI بروتوكولات لتحديد نتائج AST مباشرة من زجاجات زراعة الدم الآلية التي تم الإبلاغ عنها بشكل إيجابي (+aBCs). تم تقديم بروتوكول EUCAST السريع AST (RAST) لأول مرة في عام 2018 ، حيث يمكن الإبلاغ عن نقاط توقف قطر المنطقة لأربعة عوامل مسببة شائعة لإنتان GN ، أي الإشريكية القولونية ، والكلبسيلة الرئوية ، والزائفة الزنجارية ، ومركب Acinetobacter baumannii . ومع ذلك ، فإن تلك المختبرات السريرية التي نفذت هذه الطريقة في سير عملها الروتيني تعتمد على تحديد الميكروبات القائم على قياس الطيف الكتلي ، وهو أمر غير متاح بسهولة ، مما يحول دون تنفيذها في بيئات محدودة الموارد. للتحايل عليه ، قمنا بتقييم بروتوكول اللقاح المباشر (DIP) باستخدام نظام تجاري آلي لتحديد الميكروبات واختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (aMIAST) لتمكين التعرف المبكر على الميكروبات في غضون 8 ساعات من الإبلاغ الإيجابي عن aBC. قمنا بتقييم هذا البروتوكول من يناير إلى أكتوبر 2023 لتحديد أربعة RAST GN (RR-GN) التي يمكن الإبلاغ عنها في aBC الذي تم وضع علامة إيجابية عليه. تمت مقارنة نتائج تحديد الميكروبات في DIP مع بروتوكول تحضير اللقاح القياسي (SIP) في aMIAST. من بين 204 + aBCs مع GN أحادي الشكل (+ naBC) ، تم تحديد واحد من 4 RR-GN في 105 + naBCs بواسطة SIP (E. coli: 50 ، K. pneumoniae: 20 ، P. aeruginosa: 9 و A. baumannii complex: 26). من بين هؤلاء، تم تحديد 94٪ (98/105) بشكل صحيح من قبل DIP في حين كانت معدلات الخطأ الرئيسي والخطأ الكبير جدا 6٪ (7/105) و 1.7٪ (4/240)، على التوالي. عندما يتم إجراء DIP لتحديد الميكروبات باستخدام طريقة EUCAST RAST ، يمكن تقديم تقارير سريرية مؤقتة في غضون 24 ساعة من استلام العينة. وينطوي هذا النهج على إمكانية الحد بدرجة كبيرة من مهلة التنفيذ التكنولوجية، مما يتيح في وقت مبكر إجراء العلاج المناسب المضاد للميكروبات.

Introduction

يتم تعريف الإنتان ، وهو مشكلة صحية عالمية مهمة ، على أنه خلل وظيفي في الأعضاء يهدد الحياة بسبب استجابة المضيف غير المنظمة للعدوى. قدرت دراسة العبء العالمي للأمراض أن هناك 48.9 مليون حالة تعفن الدم و 11 مليون حالة وفاة مرتبطة بالإنتان في جميع أنحاء العالم في عام 2017 ، وهو ما يمثل ما يقرب من 20٪ من جميع الوفيات العالمية1. حوالي 2/3الثالثة من التهابات مجرى الدم (BSI) التي تسبب الوفيات ناتجة عن مسببات الأمراض البكتيرية سالبةالجرام 2. الأسباب الرئيسية للوفيات بين سلبية الجرام (GN) هي الإشريكية القولونية ، الكلبسيلة الرئوية ، الزائفة الزنجارية ، و Acinetobacter baumannii ، والتي تمثل حوالي 40 ٪ من الحالات بين 33 من مسببات الأمراضالبكتيرية 2.

تظل مزارع الدم هي المعيار الذهبي لتشخيص BSI ، والتحديد السريع للميكروبات جنبا إلى جنب مع نتائج اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (AST) هو مفتاح الإدارة. تشير التقديرات إلى أن هناك زيادة بنسبة 9٪ في احتمالات الوفاة مع تأخير كل ساعة في إنشاء مضادات الميكروبات المناسبة في الإنتان3. الوقت المستغرق (TAT) لتقارير زراعة الدم الإيجابية ميكروبيولوجيا مع نتائج AST هو حوالي 48-72 ساعة مع الأدوات الميكروبيولوجية المتاحة في إعدادات محدودة الموارد ، حتى مع الأنظمة الآلية. ونتيجة لهذا النقص في الميكروبات، تستخدم مضادات الميكروبات واسعة الطيف تجريبيا، مما يسهم في تفاقم مشكلة مقاومة مضادات الميكروبات. إدراكا لهذه الحاجة الماسة إلى تقليل TAT لتقنيات الزراعة الميكروبيولوجية للإنتان ، تتجه EUCAST و CLSI نحو إجراء AST مباشرة من زجاجات زراعة الدم ذات العلامات الإيجابية (+aBC) 4,5.

في عام 2018 ، قدمت EUCAST لأول مرة طريقة AST السريعة (RAST) لتحديد AST بواسطة طريقة انتشار قرص Kirby-Bauer في أوقات حضانة قصيرة ، أي 4 ساعات و 6 ساعات و 8 ساعات ، مباشرة من + aBC 6,7. تم التحقق من صحة الطريقة حاليا لتحديد AST ل + aBCs التي تحتوي على واحد من أكثر 8 أسباب شيوعا ل BSI وهي E. coli و K. pneumoniae و P. aeruginosa و A. baumannii المعقدة بين سلبية الجرام والمكورات العنقودية الذهبية والمكورات المعوية البرازية و E. faecium والمكورات العقدية الرئوية بين إيجابيةالجرام 8. يتم توفير نقاط التوقف لتحديد AST على فترات زمنية مختلفة وفقا للأنواع الميكروبية المذكورة أعلاه. ومن ثم ، قبل التفسير القاطع لنتائج AST ، من الضروري تحديد الهوية الميكروبية. ومع ذلك ، لا يحدد معيار RAST طريقة تمكين التعرف الميكروبي خلال هذا الإطار الزمني.

استخدمت غالبية الدراسات التي تقيم طريقة EUCAST RAST في بيئتها التحديد الميكروبي القائم على قياس الطيف الكتلي بعد الحضانة القصيرة على الوسائط المطلية لتحديد الكائنات الحية الدقيقة9،10،11،12،13،14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن أدوات قياس الطيف الكتلي ليست متاحة على نطاق واسع ، خاصة في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل (LMICs) ، مما يحد بشكل كبير من الفائدة المحتملة لهذه الطريقة. أفادت دراسات قليلة عن تنفيذ هذه الطريقة في مراكزها دون استخدام قياس الطيف الكتلي18،19،20. أبلغ Tayşi et al.18 عن تصنيف واسع ل GN بين Enterobacterales و Pseudomonas و Acinetobacter spp. بناء على مورفولوجيا صبغة الجرام واختبار أوكسيديز قبل تفسير نتائج AST. في دراسات أخرى من هذا المركز ، بواسطة Gupta et al.19 و Siddiqui et al.20 ، تم تحديد الميكروبات على مستوى الأنواع عن طريق تحضير حبيبات بكتيرية من خليط مرق الدم ذي العلم الإيجابي وتلقيحه في الاختبارات الكيميائية الحيوية التقليدية. في حين أن Tayşi et al.18 لم يعلقوا على دقة تحديد الميكروبات مع نهجهم ، أفاد Gupta et al.19 أنه مع نهجهم في 165/176 (94٪) الحالات ، فإن RAST سلبي الجرام الذي يمكن الإبلاغ عنه (RR-GN) ، أي من الإشريكية القولونية ، K. الرئوية ، P. aeruginosa ، و A. baumannii معقد. ومع ذلك ، مع النهج الأخير ، تم إجراء قراءة نتائج RAST بأثر رجعي باستخدام نقاط توقف قطرها 8 ساعات فقط بعد الحضانة الكاملة للنتائج الكيميائية الحيوية التقليدية ، أي 18-24 ساعة بعد التلقيح ، وكان متوسط وقت الإبلاغ حوالي يومين.

لتقليل مهلة التنفيذ للتقارير السريرية بشكل أكبر ، نقترح منهجية بديلة لتمكين التحديد المبكر ل GN الموجود في +aBCs باستخدام aMIAST. قبل إدخال أنظمة تحديد الهوية الميكروبية القائمة على قياس الطيف الكتلي ، كانت أنظمة تحديد الهوية الآلية هذه تعتبر معيار الرعاية لتحديد الهوية الميكروبية ، حيث تم تمكين تحديد الهوية من خلال التغيرات اللونية و / أو الفلورومترية التي تسببها بكتيريا الاختبار عند تلقيحها في اختبارات كيميائية حيوية مصغرة محفوظة في شريط ومطابقة النتائج مع قاعدة بيانات العزل الخاصة بهم. يبلغ متوسط الوقت اللازم لتحديد الهوية في هذه الأنظمة حوالي 4 ساعات إلى 8 ساعات ، ومع ذلك ، فهي محدودة بحقيقة أن الشركات المصنعة توصي بنمو الميكروبات بين عشية وضحاها قبل أن يتم تلقيح بطاقات الهوية الخاصة بها. وهذا الشرط يحد كثيرا من فائدتها في تقليل الوقت اللازم لتقديم التقارير.

قامت دراسات قليلة بتقييم طرق التعرف المباشر على الميكروبات من + aBCs باستخدام هذه الأنظمة الآلية21،22،23،24،25،26،27. في حالة +aBCs التي تحتوي على GN أحادي الشكل ، أظهرت غالبية الدراسات توافقا ممتازا بين التلقيح المباشر من الحبيبات البكتيرية المصنوعة من خليط مرق الدم الإيجابي وحضانة المستعمرة القياسية. ومع ذلك ، في حالة إيجابية الجرام ، كانت معدلات التوافق دون المستوى الأمثل. نظرا لأن متوسط الوقت اللازم لإيجابية + aBCs يتراوح بين 8 ساعات و 16 ساعة ويستغرق تحديد GN ~ 4 ساعات إلى 8 ساعات في نظام تحديد الميكروبات الآلي ، فإننا نفترض أنه من خلال استخدام بروتوكول التلقيح المباشر في التعرف الآلي على الميكروبات ، يمكننا إكمال التقارير السريرية ل + aBCs مع وجود GN RR-GN في غضون 24 ساعة من استلام العينة.

الإعداد للدراسة
أجريت الدراسة الحالية في مختبر علم الجراثيم السريري التابع لمعهد رعاية أكاديمي من الدرجة الثالثة بسعة 950 سريرا ذا أهمية وطنية (INI) في وسط الهند من يناير إلى أكتوبر 2023. تم تجهيز المختبر بنظام مراقبة مستمرة لثقافة الدم (CBCMS) و aMIAST. يعمل مختبر الجراثيم على مدار الساعة مع توفر الفنيين وعلماء الأحياء الدقيقة لمعالجة والإبلاغ عن أي زجاجة مزرعة دم تم الإبلاغ عنها بشكل إيجابي (+aBCs).

الطرق الميكروبية المستخدمة هنا
يظهر سير عمل الدراسة في الشكل 1. تمت معالجة +aBCs التي تظهر GNs أحادية الشكل (+ naBC) عن طريق التلقيح المباشر لبطاقات الهوية المقابلة لتمكين تحديد الهوية و AST باستخدام بروتوكول EUCAST RAST. تمت مقارنة هذه النتائج مع طريقة معيار الرعاية (SoC) ل + aBCs ، أي الاستزراع الفرعي على الوسائط المطلية التقليدية من خلال أجار دم الأغنام (SBA) ، وأجار الشوكولاتة (CA) ، وأجار MacConkey (MA) ، المحتضن هوائيا لمدة 16 ساعة إلى 24 ساعة متبوعا ببطاقات التعريف و AST التي تقدمها aMIAST عند ظهور مستعمرات معزولة. تم استبعاد مزارع الدم التي تظهر المكورات إيجابية الجرام ، والعصيات إيجابية الجرام ، وخلايا الخميرة الناشئة ، و ≥2 الكائنات الحية الدقيقة المختلفة على تلطيخ الجرام الأولي أو الوسائط المطلية من الدراسة.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة ، الممولة من منحة البحث الداخلي المقدمة للدكتور أيوش غوبتا من قبل AIIMS Bhopal ، من قبل لجنة الأخلاقيات الإنسانية المؤسسية (IHEC) برسالة رقم: IHEC- LOP / 2022 / IL072.

ملاحظة: تم استخدام حجم عينة من 5 مل بناء على الدراسات التي أجراها Quesada et al.25 و Munoz-Davila et al.27.

1. بروتوكول اللقاح القياسي (SIP) لتحديد البكتيريا باستخدام aMIAST

  1. ارتد قفازات نظيفة ، وداخل خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية (BSC) ، قم بتطهير حاجز + naBC بمسحة تحتوي على 70٪ كحول الأيزوبروبيل.
  2. ارسم حوالي 1 مل من خليط مرق الدم باستخدام حقنة معقمة بإبرة 21 جرام.
  3. استغني عن 1 قطرة كبيرة من خليط مرق الدم من الإبرة على سطح الوسائط المطلية ، وهي SBA و CA و MA. قم بخط الصفائح واحتضان لوحات الاستزراع في حاضنة عند 37 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية في ظل الظروف الهوائية لمدة 18-24 ساعة.
  4. بعد الحضانة ، افحص اللوحات بحثا عن ظهور مستعمرات معزولة في BSC وتابع أكثر لتحديد الهوية و AST بواسطة aMIAST.
  5. لكل عزل ، ضع أنبوب البوليسترين aMIAST في حامل أنبوب aMIAST وأضف 3 مل من المحلول الملحي المعقم فيه باستخدام موزع متصل بالزجاجة المالحة.
  6. المس ثلاث إلى خمس مستعمرات متشابهة شكليا بسلك تلقيح مستقيم معقم وانقل اللقاح البكتيري إلى الأنبوب الأول.
  7. اضبط التعكر باستخدام محلول ملحي معقم في الأنبوب الملقح بين 0.47-0.63 McFarland باستخدام مقياس الكثافة.
  8. ضع المرفق الشعري لبطاقة تعريف aMIAST سالبة الجرام في الأنبوب الأول.
  9. ضع البطاقات المحددة في موضع مناسب على الكاسيت. اللقاح في الكاسيت جاهز ويأتي إلى aMIAST في قسم التعبئة.
    تنبيه: يجب ألا يتجاوز عمر التعليق 30 دقيقة قبل تلقيح البطاقات.
  10. قم بتحميل الكاسيت في موضعه في حجرة الحشو مع توجيه نموذج الباركود للداخل.
  11. أغلق الباب واضغط على Fill في شاشة واجهة المستخدم. التعبئة هي دورة 70 ثانية. عند اكتمال الدورة ، سيومض ضوء المؤشر الأزرق على النظام. يؤدي وضع البطاقات في نظام aMIAST إلى توزيع اللقاح داخل الغرف الصغيرة للبطاقات بواسطة الجهاز.
  12. قم بإزالة الكاسيت من حجرة التعبئة ، وأغلق الباب ، وضعه في غرفة التحميل. يتم مسح الرموز الشريطية ضوئيا تلقائيا والتحقق منها مقابل الحفاظ على قائمة العمل الإلكترونية للكاسيت الافتراضي. يتم إغلاق القش تلقائيا ، ويتم تحميل البطاقات تلقائيا في الرف الدائري. يشير السهم الأزرق الوامض على aMIAST إلى انتهاء التحميل.
  13. قم بإزالة نفايات الكاسيت عند الانتهاء. راجع إجراءات التخلص من النفايات في أدبيات المنتج أو اتبع الممارسات القياسية الأخرى. استخدم ما تبقى من المعلق في الأنابيب للاستزراع الفرعي على أجار CLED لفحص نقاء العزلات.
  14. اقرأ النتائج بعد أن تكمل الأداة التحليل.

2. بروتوكول التلقيح المباشر (DIP) لتحديد البكتيريا باستخدام aMIAST

  1. ارتد قفازات معقمة ، وداخل خزانة السلامة الحيوية ، نظف حاجز + naBC بمسحة تحتوي على 70٪ كحول الأيزوبروبيل.
  2. باستخدام حقنة معقمة بإبرة 21 جم ، خذ 5 مل من القسمة من خليط مرق الدم من + naBC وانقله إلى أنبوب فاصل المصل (SST) بعد تطهير الحاجز المطاطي بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ (الشكل 2 أ).
  3. جهاز طرد مركزي هذا القسمة لمدة 10 دقائق عند 160 × جم لتسوية خلايا الدم في خليط مرق الدم. بعد الطرد المركزي الأول ، لاحظ المادة الطافية التي تستقر فيها خلايا الدم.
  4. افتح غطاء القارورة داخل خزانة السلامة البيولوجية ، وباستخدام طرف وماصة معقمين ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ونقلها إلى قارورة جديدة لجمع الدم العادي (قمة حمراء) عن طريق إزالة الجزء العلوي منها.
  5. ضع الغطاء على القارورة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقائق عند 2000 × جم. بعد الطرد المركزي الثاني ، سوف تتشكل حبيبات بكتيرية في الأسفل.
  6. نضح المادة الطافية وتخلص منها باستخدام ماصة وطرف معقمين. ستبقى الحبيبات البكتيرية في قاع الأنبوب وسيتم استخدامها لتلقيح بطاقة تعريف aMIAST.
    ملاحظة: تم استخدام أنبوب فاصل المصل في الطرد المركزي الأول عند 160 × جم. واستند ذلك إلى الدراسات التي أجراها Quesada et al.25 و Munoz-Davila et al.27 ، حيث تم إجراء خطوة الطرد المركزي الأولى تقريبا عند 30 × جم و 60 × جم ، على التوالي. تم طرد خليط مرق الدم من + aBC أولا بسرعة منخفضة في SST لإخراج خلايا الدم.
  7. ضع أنبوب البوليسترين aMIAST في حامل أنبوب aMIAST وأضف 3 مل من المحلول الملحي المعقم فيه باستخدام موزع متصل بزجاجة المحلول الملحي.
  8. باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، خذ الحبيبات البكتيرية من قاع القارورة وقم بتلقيحها في أنبوب aMIAST
  9. كرر الخطوات من 1.7 إلى 1.14.

3. AST بواسطة بروتوكول EUCAST RAST4

  1. احتفظ بألواح أجار مولر-هينتون (MHA) الدائرية غير الملقحة مقاس 90 مم جاهزة في خزانة السلامة البيولوجية.
  2. ارتد قفازات معقمة ، وداخل خزانة السلامة الحيوية ، نظف حاجز + naBC بمسحة تحتوي على 70٪ كحول الأيزوبروبيل.
  3. باستخدام حقنة معقمة ، نضح 125 ميكرولتر ± 25 ميكرولتر من خليط مرق الدم غير المخفف من + naBC وأضفه إلى كل لوحة MHA في المنتصف.
  4. انشر المرق برفق على الأطباق باستخدام قطعة قطن معقمة في ثلاثة اتجاهات وضع ≤ 6 أقراص مضادة للميكروبات على كل طبق.
  5. احتضان الألواح في حاضنة هوائية عند 35 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية لمدة 8 ساعات. بعد الانتهاء من الحضانة ، لاحظ نقاء العزل.
  6. اقرأ مناطق التثبيط في 8 ساعات ± 5 دقائق. تفسير النتائج باستخدام جدول نقطة توقف RAST للحضانة القصيرة بعد التحقق من نتائج تحديد البكتيريا في aMIAST.
  7. تقرير نتائج AST فقط إذا تم تحديد العزلة على أنها واحدة من RR-GN وتنمو لوحات MHA و CLED نمطا مورفوتيابيا واحدا.

4. مراقبة الجودة

  1. قم بإجراء مراقبة الجودة الداخلية لبروتوكول SIP الخاص ب aMIAST وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام السلالات المرجعية الموصى بها.
  2. إجراء مراقبة الجودة الداخلية لطريقة RAST أسبوعيا باستخدام السلالة المرجعية الموصى بها من الإشريكية القولونية كما هو موضح أدناه.
    1. رتب 4 أنابيب زجاجية معقمة في حامل أنبوبي. صرف 3 مل من محلول ملحي معقم في الأنبوب الأول و 990 ميكرولتر من محلول ملحي معقم في كل من الأنابيب الثاني والثالث والرابع.
    2. قم بعمل تعليق 0.5 McFarland لسلالة مراقبة الجودة من المستعمرات المعزولة لثقافة ليلية على وسائط مطلية.
    3. باستخدام ماصة وطرف معقمة ، انقل 10 ميكرولتر من التعليق من الأنبوب الأول إلى الأنبوب الثاني.
    4. بعد الخلط ، انقل 10 ميكرولتر من المعلق من الأنبوب الثاني إلى الأنبوب الثالث ثم بعد ذلك إلى الأنبوب الأخير.
    5. من الأنبوب الأخير ، خذ 1 مل من اللقاح باستخدام حقنة معقمة بإبرة وأضفها إلى aBC غير الملقح.
    6. أضف في نفس الوقت 5 مل من دم الأغنام المعقم في aBC باستخدام حقنة معقمة بإبرة واحتضانها في CBCMS حتى تصبح إيجابية بسبب التغير في لون مستشعر المستحلب السائل في قاعدة aBC.
    7. كرر الخطوات كما هو موضح في الخطوات 1-3 للتعريف بواسطة SIP و DIP و RAST ، على التوالي. النتائج المتوقعة هي أنه يجب تحديد سلالة مراقبة الجودة بشكل صحيح من خلال كل من بروتوكولات تحديد aMIAST ويجب أن تكون أقطار المنطقة في لوحات RAST ضمن النطاق المحدد28.

5. التحليل الإحصائي

  1. ضع في اعتبارك تحديد الميكروبات باستخدام SIP كمعيار ذهبي وإذا تم الحصول على نفس التعريف بواسطة DIP ، فاعتبره متوافقا.
  2. إذا كان RR-GN ، أي أحد معقد E. coli و K. pneumoniae و P. aeruginosa و A. baumannii المحدد باستخدام SIP متنافرا في DIP ، فاعتبر هذا خطأ كبيرا (ME) بينما اعتبر العكس خطأ كبيرا جدا (VME) لأنه من المحتمل إصدار تقرير بتعريف خاطئ.
  3. احسب معدل التوافق ل RR-GN كنسبة إجمالي عدد RR-GN المطابق إلى العدد الإجمالي لشبكات RR-GN المحددة بواسطة SIP مضروبا في 100.
  4. احسب معدل ME كنسبة عدد +naBCs المحددة على أنها تحتوي على غير RR-GN إلى إجمالي عدد +naBCs مع RR-GN المحددة بواسطة SIP مضروبة في 100.
  5. احسب معدل VME كنسبة عدد +naBCs التي تم تحديدها بشكل خاطئ على أنها تحتوي على RR-GN في DIP إلى إجمالي لا. من +naBCs التي تم اختبارها بواسطة DIP مضروبة في 100.
  6. احسب وقت عزل تحديد الهوية (TTI) على أنه الوقت المستغرق لتحديد العزلة بواسطة كلا البروتوكولين من وقت الإبلاغ عن مزرعة الدم بواسطة CBCMS.
  7. احسب الفروق بين DIP و SIP كتخفيض في TTI. احسب هذا فقط للتوافق +naBCs التي تحتوي على RR-GN. لاحظ النقاط الزمنية المعنية من ساعات CBCMS و aMIAST.
  8. إدارة البيانات وتحليلها باستخدام جدول بيانات. استخدم اختبار Mann-Whitney U للمتغيرات المستمرة ، مع الأخذ في الاعتبار قيمة p ذات الوجهين البالغة ≤ 0.05 كقيمة ذات دلالة إحصائية.

النتائج

النتائج العامة
خلال فترة الدراسة ، خضع 240 + naBCs لتحديد الهوية بواسطة aMIAST باستخدام كل من DIP و SIP. من بين هؤلاء ، تم العثور على 15٪ (36/240) + naBCs لتكون متعددة الميكروبات بعد الحضانة الليلية على الوسائط المطلية. ومن بين 204 +naBCs، كانت نسبة RR-GN التي حددتها SIP 51.5٪ (105/204). من بينها ، 47.6 ٪ (50/105) كانت ?...

Discussion

باستخدام DIP ، نجحنا في تحديد RR-GNs بدقة تشخيصية كبيرة. كان متوسط TTI بعد الإبلاغ الإيجابي عن aBC 507 دقيقة فقط (~ 8.5 ساعة). وبالتالي ، عندما يتم ذلك بالاقتران مع طريقة EUCAST RAST لتحديد AST ، يمكن أن يعطي تحديد العزل في وقت قراءة 8 ساعات AST. هذا النهج لديه القدرة على تنفيذ طريقة EUCAST RAST التي تغني عن الحاجة إلى ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل الدراسة من خلال منحة البحث الداخلي المقدمة للدكتور أيوش جوبتا من قبل AIIMS Bhopal. نحن نعترف بمساهمة فنيي المختبرات والأطباء المقيمين الذين أجروا الاختبارات وقرأوها بجد خلال ساعات الروتين والطوارئ.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD035-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Amoxyclav disk (20/10 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD063-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Cefotaxime disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD295E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ceftazidime disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD062A-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ciprofloxacin disk (5 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD060-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD010-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Gentamicin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD016-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Imipenem disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD073-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Levofloxacin disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD216-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Meropenem disk 10 µg Himedia, Mumbai, IndiaSD727-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD292E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Tobramycin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD044-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
ATCC Escherichia coli 25922Microbiologics, Minnesota USA0335ARecommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France412CM8423Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, IndiaDFP-2/21-22/149For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2Himedia, Mumbai, IndiaM834-500GPreparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BLLaby Instruments, Ambala, IndiaHLL/2021-22/021Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser BrandTech, Essex CT, EnglandV1200Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar Himedia, Mumbai, IndiaM008-500GDifferential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, IndiaNJ478162Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India521020Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar Himedia, Mumbai, IndiaM173-500GAntimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4Himedia, Mumbai, IndiaLA019For streaking onto culture media
Nichrome straight wireHimedia, Mumbai, IndiaLA022For stab inoculation
Nulife sterile GlovesMRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, IndiaFor safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367815Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep bloodLabline Trading Co., Hyderabad, India70014Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367954Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)Himedia, Mumbai, IndiaPW005-1X500NOLawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/ccNihal Healthcare, Solan, India2213805NB2Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kitbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France422219Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceV1204Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France533306-4 REVStand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubesbioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceTubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceVKC15144Automated identification and AST system
VITEK-2 GN cardbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France21341Identification of Gram negative bacilli

References

  1. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990–2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  2. Ikuta, K. S., et al. Global mortality associated with 33 bacterial pathogens in 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 400 (10369), 2221-2248 (2022).
  3. Liu, V. X., et al. The timing of early antibiotics and hospital mortality in sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 196 (7), 856-863 (2017).
  4. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 4.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 33rd ed. CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2023).
  6. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2018).
  7. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2018).
  8. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 6.1. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  9. Soo, Y. T., Waled, S. N. M. B., Ng, S., Peh, Y. H., Chew, K. L. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (5), 993-998 (2020).
  10. Berinson, B., et al. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST): Analytical performance and impact on patient management. J Antimicrob Chemother. 76 (5), 1332-1338 (2021).
  11. Strubbe, G., Messiaen, A. S., Vandendriessche, S., Verhasselt, B., Boelens, J. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) compared to conventional susceptibility testing: implementation and potential added value in a tertiary hospital in Belgium. Acta Clinica Belgica: Int J Clin Lab Med. 78 (5), 385-391 (2023).
  12. Jasuja, J. K., Zimmermann, S., Burckhardt, I. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) for positive blood cultures in clinical practice using a total lab automation. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (7), 1305-1313 (2020).
  13. Martins, A., et al. Rapid antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae by disk diffusion directly from blood culture bottles using the EUCAST RAST breakpoints. J Glob Antimicrob Resist. 22, 637-642 (2020).
  14. Ekwall-Larson, A., Fröding, I., Mert, B., Åkerlund, A., Özenci, V. Analytical performance and potential clinical utility of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing in blood cultures after four hours of incubation. Microbiol Spectr. 11 (2), e500122 (2023).
  15. Cerrudo, V., et al. Usefulness of EUCAST rapid antibiotic susceptibility breakpoints and screening cut-off values directly from blood cultures for the inference of β-lactam resistance mechanisms in Enterobacterales. JAC-Antimicrob Resist. 5 (1), 017 (2023).
  16. Shan, Y., et al. Evaluation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test for enterobacterales-containing blood cultures in China. J Clin Microbiol. 60 (4), e0255921 (2022).
  17. Jonasson, E., Matuschek, E., Kahlmeter, G. The EUCAST rapid disc diffusion method for antimicrobial susceptibility testing directly from positive blood culture bottles. J Antimicrob Chemother. 75 (4), 968-978 (2020).
  18. Tayşi, M. R., et al. Implementation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test (RAST) directly from positive blood culture bottles without the advanced identification systems. J Antimicrobial Chemotherapy. 77 (4), 1020-1026 (2022).
  19. Gupta, A., et al. A prospective study evaluating the effect of a ‘Diagnostic Stewardship Care-Bundle’ for automated blood culture diagnostics. J Glob Antimicrob Resist. 34, 119-126 (2023).
  20. Siddiqui, F., Gupta, A., Purwar, S., Saigal, S., Sharma, J. P. A prospective study to reduce turnaround time of microbiologically positive blood cultures in patients with sepsis in intensive care unit. Indian J Med Microbiol. 40 (4), 541-546 (2022).
  21. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiol Infect Dis. 72 (1), 20-31 (2012).
  22. Lemos, T. C., Cogo, L. L., Maestri, A. C., Hadad, M., Nogueira, K. d. a. S. Is it possible to perform bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing with a positive blood culture bottle for quick diagnosis of bloodstream infections. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 51 (2), 215-218 (2018).
  23. Funke, G., Funke-Kissling, P. Use of the BD PHOENIX automated microbiology system for direct identification and susceptibility testing of gram-negative rods from positive blood cultures in a three-phase trial. J Clin Microbiol. 42 (4), 1466-1470 (2004).
  24. Nimer, N. A., Al-Saa’da, R. J., Abuelaish, O. Accuracy of the VITEK 2 system for a rapid and direct identification and susceptibility testing of Gram negative rods and Gram-positive cocci in blood samples. East Mediterr Health J. 22 (3), 193-200 (2016).
  25. Quesada, M. D., et al. Performance of VITEK-2 Compact and overnight MicroScan panels for direct identification and susceptibility testing of Gram-negative bacilli from positive FAN BacT/ALERT blood culture bottles. Clin Microbiol Infect. 16 (2), 137-140 (2010).
  26. De Cueto, M., Ceballos, E., Martinez-Martinez, L., Perea, E. J., Pascual, A. Use of positive blood cultures for direct identification and susceptibility testing with the Vitek 2 system. J Clin Microbiol. 42 (8), 3734-3738 (2004).
  27. Munoz-Dávila, M. J., Yagüe, G., Albert, M., García-Lucas, T. Comparative evaluation of Vitek 2 identification and susceptibility testing of Gram-negative rods directly and isolated from BacT/ALERT-positive blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 31 (5), 663-669 (2012).
  28. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Quality control criteria for the implementation of the RAST method. Version 6.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  29. Chen, J. R., Lee, S. Y., Yang, B. H., Lu, J. J. Rapid identification and susceptibility testing using the VITEK 2 system using culture fluids from positive BacT/ALERT blood cultures. J Microbiol, Immunol Infect. 41 (3), 259-264 (2008).
  30. Bruins, M. J., Bloembergen, P., Ruijs, G. J. H. M., Wolfhagen, M. J. H. M. Identification and susceptibility testing of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa by direct inoculation from positive BACTEC blood culture bottles into Vitek 2. J Clin Microbiol. 42 (1), 7-11 (2004).
  31. Lupetti, A., Barnini, S., Castagna, B., Nibbering, P. H., Campa, M. Rapid identification and antimicrobial susceptibility testing of Gram-positive cocci in blood cultures by direct inoculation into the BD Phoenix system. Clin Microbiol Infect. 16 (7), 986-991 (2010).
  32. Barreales, A., Lara, M., Hernández, I., Díez, O. Rapid identification and susceptibility testing of Gram-positive cocci in BacT/ALERT blood cultures by direct inoculation into the Vitek 2 system. Rev Esp Quimioter. 24 (3), 131-135 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

EUCAST RAST

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved