使用自动微生物鉴定系统进行直接微生物鉴定，以促进 EUCAST RAST 方法，无需质谱法

摘要

EUCAST 开发了一种用于自动血培养的直接药敏试验 （AST） 方案。然而，通过在自动微生物鉴定系统中使用直接接种物制备方案，可以消除它对基于质谱的微生物鉴定的依赖。这种方法可以在样品收集后 24 小时内提供 AST 报告。

摘要

革兰氏阴性 （GN） 脓毒症是一种医学急症，在资源有限的环境中，管理依赖于常规微生物培养技术，可在 3-4 天内提供结果。认识到这种周转时间 （TAT） 的延迟，EUCAST 和 CLSI 都制定了直接从带有阳性标记的自动血培养瓶 （+aBC） 中确定 AST 结果的方案。EUCAST 快速 AST （RAST） 方案于 2018 年首次推出，其中可以报道 GN 脓毒症的四种常见病因，即 大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和 鲍曼不动杆菌 复合体。然而，那些在常规工作流程中实施这种方法的临床实验室依赖于基于质谱的微生物鉴定，而这种鉴定并不容易获得，因此无法在资源有限的环境中实施。为了规避它，我们使用商业自动微生物鉴定和抗菌药物敏感性测试系统 （aMIAST） 评估了直接接种方案 （DIP），以便在 aBC 阳性标记后 8 小时内进行早期微生物鉴定。我们在 2023 年 1 月至 2023 年 10 月期间评估了该方案，以确定阳性标记的 aBC 中的四个 RAST 可报告 GN （RR-GN）。将 DIP 中的微生物鉴定结果与 aMIAST 中的标准接种物制备方案 （SIP） 进行比较。在 204 个具有单态性 GN （+naBC） 的 +aBC 中，通过 SIP 在 105 个 +naBC 中鉴定出 4 个 RR-GN 中的一个（大肠杆菌： 50， 肺炎克雷伯菌： 20， 铜绿假单 胞菌：9 和鲍曼不动杆菌 复合物：26）。其中，94% （98/105） 被 DIP 正确识别，而主要错误和非常重大错误率分别为 6% （7/105） 和 1.7% （4/240）。当使用 EUCAST RAST 方法进行微生物鉴定的 DIP 时，可以在收到样品后 24 小时内提供临时临床报告。这种方法有可能显著降低 TAT，从而及早建立适当的抗菌治疗。

引言

脓毒症是一个重要的全球健康问题，被定义为由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍。全球疾病负担研究估计，2017 年全球有 4890 万例脓毒症病例和 1100 万例脓毒症相关死亡病例，占全球死亡总数的近 20%¹。大约 2/3 导致死亡的血流感染 （BSI） 是由革兰氏阴性细菌病原体引起的²。革兰氏阴性菌 （GN） 死亡的主要原因是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，它们约占 33 种细菌病原体病例的 40%²。

血培养仍然是诊断 BSI 的金标准，快速微生物鉴定和药敏试验 （AST） 结果是管理的关键。据估计，脓毒症 3 中，每延迟一小时使用适当的抗菌药物，死亡率就会增加⁹%。在资源有限的环境中，使用可用的微生物学工具，即使使用自动化系统，具有 AST 结果的微生物学阳性血培养报告的周转时间 （TAT） 约为 48-72 小时。由于这种低于标准的 TAT，广谱抗菌剂被经验性地使用，导致了日益严重的抗菌素耐药性 （AMR） 问题。认识到迫切需要减少脓毒症微生物培养技术的 TAT，EUCAST 和 CLSI 正在转向直接从带有阳性标记的血培养瓶 （+aBC^{） 进行} AST（^4,5）。

2018 年，EUCAST 首次引入了快速 AST （RAST） 方法，用于通过柯比-鲍尔纸片扩散法在较短的孵育时间（即 4 小时、6 小时和 8 小时）直接从 +aBC ^6,7 确定 AST。该方法目前已验证用于确定 +aBCs 的 AST，其中包含 BSI 的 8 种最常见原因之一，即革兰阴性菌中的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌复合物，以及革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌和肺炎链球菌 ⁸.根据上面列出的微生物种类，提供了不同时间间隔的 AST 测定断点。因此，在对 AST 结果进行分类解释之前，微生物鉴定是必要的。但是，RAST 标准并未指定在此时间范围内实现微生物鉴定的方法。

大多数在其环境中评估 EUCAST RAST 方法的研究在铺板培养基上短暂孵育后使用基于质谱的微生物鉴定来鉴定微生物^{9、10、11、12、13、14、15、16、17}.然而，质谱仪器并未广泛使用，尤其是在中低收入国家 （LMIC），这极大地限制了该方法的潜在用途。很少有研究报告在不使用质谱法的情况下在他们的中心实施这种方法 18,19,20。Tayşi 等人¹⁸ 报道了在解释 AST 结果之前，根据革兰氏染色形态学和氧化酶测试，将 GN 广泛分类为肠杆菌属、假单胞菌属和不动杆菌属。在该中心的其他研究中，由 Gupta 等人 ¹⁹ 和 Siddiqui 等人 ²⁰ 进行，通过从阳性标记的血汤混合物中制备细菌沉淀并将其接种在常规生化测试中来完成物种水平的微生物鉴定。虽然 Tayşi 等人¹⁸ 没有评论他们的方法微生物鉴定的准确性，但 Gupta 等人¹⁹ 报告说，在他们的方法中，165/176 （94%） 病例中，RAST 可报告的革兰氏阴性 （RR-GN），即大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌 复杂。然而，使用后一种方法，只有在常规生化结果完全孵育后，即接种后 18-24 小时，才使用 8 小时区直径断点回顾性地读取 RAST 结果，平均报告时间约为 2 天。

为了进一步减少临床报告的 TAT，我们提出了一种替代方法，可以使用 aMIAST 及早识别 +aBC 中存在的 GN。在引入基于质谱的微生物鉴定系统之前，这些自动鉴定系统被认为是微生物鉴定的标准，其中当接种在盒中的微型生化测试中时，测试细菌通过比色和/或荧光变化进行鉴定，并将结果与其分离物数据库相匹配。在这些系统中进行鉴定的平均时间约为 4 小时至 8 小时，但是，它们受到以下事实的限制：制造商建议在接种各自的鉴定卡之前让微生物过夜生长。此要求极大地限制了它们在减少报告时间方面的有用性。

很少有研究评估使用这些自动化系统直接从 +aBC 中鉴定微生物的方法 21,22,23,24,25,26,27。在含有单态 GN 的 +aBC 的情况下，大多数研究表明，从阳性血汤混合物制成的细菌沉淀直接接种与标准菌落孵育之间具有出色的一致性。然而，在革兰氏阳性的情况下，一致性率并不理想。由于 +aBCs 的平均阳性时间在 8 小时到 16 小时之间，并且在自动微生物鉴定系统中鉴定 GN 需要 ~4 小时到 8 小时，我们假设通过在自动微生物鉴定中采用直接接种方案，我们可以完成 +aBCs 的临床报告，GN 具有 RR-GN收到样品后 24 小时内。

研究设置
本研究于 2023 年 1 月至 2023 年 10 月在印度中部一家拥有 950 个床位的国家重要学术三级保健研究所 （INI） 的临床细菌学实验室进行。该实验室配备了连续血培养监测系统 （CBCMS） 和 aMIAST。细菌学实验室全天候运作，有技术人员和微生物学家来处理和报告任何有阳性标记的血培养瓶 （+aBCs）。

此处使用的微生物方法
该研究的工作流程如图 1 所示。显示单形性 GN （+naBC） 的 +aBC 通过直接接种相应的识别卡进行处理，以便使用 EUCAST RAST 协议进行识别和 AST。将这些结果与 +aBCs 的标准护理 （SoC） 方法进行了比较，即通过羊血琼脂 （SBA）、巧克力琼脂 （CA） 和麦康凯琼脂 （MA） 在常规铺板培养基上进行传代培养，有氧孵育 16 小时至 24 小时，然后在出现分离菌落时通过 aMIAST 提供鉴定和 AST 卡。在初始革兰氏染色或铺板培养基上显示革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、出芽酵母细胞和 ≥2 种不同微生物的血培养被排除在研究之外。

研究方案

该研究由 AIIMS 博帕尔提供给 Ayush Gupta 博士的校内研究资助，获得机构人类伦理委员会 （IHEC） 视频信号：IHEC- LOP/2022/IL072 的批准。

注：根据 Quesada 等人 ²⁵ 和 Munoz-Davila 等人 ²⁷ 所做的研究，使用 5 ml 的样品体积。

1. 使用 aMIAST 进行细菌鉴定的标准接种方案 （SIP）

1. 戴上干净的手套，在 IIa 级生物安全柜 （BSC） 内，用含有 70% 异丙醇的棉签对 +naBC 的隔膜进行消毒。
2. 使用带有 21 G 针头的无菌注射器抽取大约 1 mL 的血汤混合物。
3. 将 1 大滴血汤混合物从针头分配到电镀培养基的表面，即 SBA、CA 和 MA。划线板并将培养板在 37 °C ± 2 °C 的培养箱中在有氧条件下孵育 18-24 小时。
4. 孵育后，检查 BSC 中分离菌落的外观，并通过 aMIAST 进一步进行鉴定和 AST。
5. 对于每种分离物，将 aMIAST 聚苯乙烯管放入 aMIAST 管架中，并使用连接到盐水瓶的分配器在其中加入 3 mL 无菌盐水。
6. 用无菌直接种丝接触 3 到 5 个形态相似的菌落，并将细菌接种物转移到第一管中。
7. 使用密度计在接种管中使用无菌盐水在 0.47-0.63 McFarland 之间调节浊度。
8. 将革兰氏阴性 aMIAST 识别卡的毛细管附件放入第一根管中。
9. 将所选存储卡放在纸盒上的适当位置。盒中的接种物已准备就绪，可进入 aMIAST 的填充部分。
   注意： 接种卡前的暂停时间不得超过 30 分钟。
10. 将样品盒装入填充室中的位置，样品条形码朝内。
11. 关上门，然后按 User Interface Screen 上的 Fill。填充是一个 70 秒的周期。循环完成后，系统上的蓝色指示灯将闪烁。将卡片放入 aMIAST 系统中，机器将接种物分配到卡片的小腔内。
12. 从填充室中取出盒，关闭门，然后放入加载室。条形码会自动扫描并根据维护虚拟盒式电子工作列表进行检查。吸管自动密封，卡片自动装入转盘。aMIAST 上闪烁的蓝色箭头表示加载已完成。
13. 完成后清除暗盒废液。请参阅产品资料中的废弃物处理程序或遵循其他标准做法。使用试管中剩余的悬浮液在 CLED 琼脂上进行传代培养，以检查分离株的纯度。
14. 仪器完成分析后读取结果。

2. 使用 aMIAST 进行细菌鉴定的直接接种方案 （DIP）

1. 戴上无菌手套，在生物安全柜内，用含有 70% 异丙醇的棉签清洁 +naBC 的隔膜。
2. 使用带有 21 G 针头的无菌注射器，从 +naBC 的血汤混合物中取出 5 mL 等分试样，并在用 70% 异丙醇消毒橡胶隔膜后将其转移到血清分离管 （SST） 中（图 2A）。
3. 将此等分试样以 160 x g 离心 10 分钟，以使血细胞沉降在血汤混合物中。第一次离心后，观察血细胞将在其中沉淀的上清液。
4. 打开生物安全柜内的样品瓶盖，使用无菌吸头和移液管小心地去除上清液，然后去除其顶部，将其转移到新的普通采血瓶（红色顶部）中。
5. 将盖子盖在小瓶上，然后再次以 2000 x g 离心 10 分钟。第二次离心后，底部会形成细菌沉淀。
6. 吸出上清液，并使用无菌移液管和吸头丢弃。细菌颗粒将保留在试管底部，用于接种 aMIAST 识别卡。
   注：在第一次离心中使用血清分离管，浓度为 160 x g。这是基于 Quesada 等人²⁵ 和 Munoz-Davila 等人²⁷ 所做的研究_，其中第一个离心步骤分别在大约 30 x g 和 60 x g 下完成。首先将来自 +aBC 的血汤混合物在 SST 中以低速离心以沉淀出血细胞。
7. 将 aMIAST 聚苯乙烯管放入 aMIAST 管架中，并使用连接到盐水瓶的分配器向其中添加 3 mL 无菌盐水。
8. 使用无菌接种环，从小瓶底部取出细菌沉淀，并将其接种在 aMIAST 管中
9. 重复步骤 1.7-1.14。

3. 通过 EUCAST RAST 协议 4 的 AST

1. 在生物安全柜中准备好未接种的 90 mm 圆形 Mueller-Hinton 琼脂 （MHA） 板。
2. 戴上无菌手套，在生物安全柜内，用含有 70% 异丙醇的棉签清洁 +naBC 的隔膜。
3. 使用无菌注射器，从 +naBC 中吸出 125 μL ± 25 μL 未稀释的血汤混合物，并添加到中心的每个 MHA 板中。
4. 使用无菌棉签将肉汤沿三个方向轻轻涂抹在盘子上≤并在每个板上涂抹 6 个抗菌盘。
5. 将板在 35 °C± 1 °C 的好氧培养箱中孵育 8 小时。孵育完成后，观察分离物的纯度。
6. 在 8 小时± 5 分钟读取抑制区。在 aMIAST 中检查细菌鉴定结果后，使用 RAST 断点表解释短时间孵育的结果。
7. 仅当分离物被鉴定为 RR-GN 之一并且 MHA 和 CLED 板生长单一形态型时，才报告 AST 结果。

4. 质量控制

1. 根据制造商的说明，使用推荐的参考菌株对 aMIAST 的 SIP 方案进行内部质量控制。
2. 使用推荐的大 肠杆菌 参考菌株每周对 RAST 方法进行内部质量控制，如下所述。
   1. 在管架上放置 4 个无菌玻璃管。在第一管中分配 3 mL 无菌盐水，在第二管、第三管和第四管中分配 990 μL 无菌盐水。
   2. 在铺板培养基上从过夜培养物的分离菌落中制备 0.5 McFarland QC 菌株悬浮液。
   3. 使用无菌移液器和吸头，将 10 μL 悬浮液从第一管转移到第二管。
   4. 混合后，将 10 μL 悬浮液从第二管转移到第三管，然后转移到最后一管。
   5. 从最后一管中，使用带针头的无菌注射器取出 1 mL 接种物，并将其添加到未接种的 aBC 中。
   6. 使用带针头的无菌注射器同时在 aBC 中加入 5 mL 无菌羊血，并在 CBCMS 中孵育，直到由于 aBC 底部液体乳剂传感器的颜色变化而标记为阳性。
   7. 重复步骤 1-3 中说明的步骤，分别通过 SIP、DIP 和 RAST 进行识别。预期结果是 QC 菌株应通过 aMIAST 的两种鉴定方案正确识别，并且 RAST 板中的区域直径应在规定范围内²⁸。

5. 统计分析

1. 考虑使用 SIP 作为金标准进行微生物鉴定，如果通过 DIP 获得相同的鉴定，则将其视为一致。
2. 如果 RR-GN，即使用 SIP 鉴定的大 肠杆菌、 肺炎克雷伯菌、 铜绿假单胞菌和 鲍曼不动杆菌 复合体之一在 DIP 中不一致，则将其视为严重错误 （ME），而将相反视为非常重大错误 （VME），因为它有可能发布错误识别的报告。
3. 计算 RR-GN 的一致率，即一致 RR-GN 总数与 SIP 识别的 RR-GN 总数乘以 100 的比率。
4. 计算 ME 率为被鉴定为具有非 RR-GN 的 +naBCs 数量与通过 SIP 识别的具有 RR-GN 的 +naBCs 总数乘以 100 的比率。
5. 将 VME 率计算为被错误识别为 DIP 中具有 RR-GN 的 +naBC 数量与总数的比率。的 DIP 测试的 +naBC 乘以 100。
6. 将分离鉴定时间 （TTI） 计算为从 CBCMS 标记血培养标记开始，两种方案鉴定分离株所需的时间。
7. 计算 DIP 和 SIP 之间的差异作为 TTI 的降低。仅针对具有 RR-GN 的一致 +naBCs 计算此值。请注意 CBCMS 和 aMIAST 时钟中的相应时间点。
8. 使用电子表格管理数据和分析。对连续变量使用 Mann-Whitney U 检验，将 ≤ 0.05 的双侧 p 值视为统计意义显著性。

结果

一般结局
在研究期间，使用 DIP 和 SIP 通过 aMIAST 鉴定了 240 个 +naBCs。其中，15% （36/240） +naBCs 在铺板培养基上孵育过夜后被发现是多微生物。在 204 个 +naBCs 中，SIP 鉴定的 RR-GN 比例为 51.5% （105/204）。其中，47.6% （50/105） 为 大肠杆菌，19% （20/105） 为肺炎克雷伯菌，8.6% （9/105） 铜 绿假单 胞菌及 24.8% （26/105） 鲍曼不动杆菌 复合体。 表 1 中...

讨论

使用 DIP，我们成功地鉴定了 RR-GNs，具有相当的诊断准确性。aBC 阳性标记后的平均 TTI 仅为 507 分钟 （~ 8.5 h）。因此，当与 EUCAST RAST 方法一起进行 AST 测定时，它可以在 8 小时 AST 读数时间内给出分离物鉴定。这种方法有可能实施 EUCAST RAST 方法，从而消除对基于质谱的鉴定的需求。对于希望在常规工作流程中实施 EUCAST RAST 方法以减少临床报告时间并规避其实施的主要障碍的资源匮乏环境来说，这...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli