JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

EUCAST פיתחה פרוטוקול בדיקת רגישות מיקרוביאלית ישירה (AST) עבור תרביות דם אוטומטיות. עם זאת, ניתן לייתר את תלותו בזיהוי מיקרוביאלי מבוסס ספקטרומטריית מסות על ידי שימוש בפרוטוקול הכנת חיסון ישיר במערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית. גישה זו יכולה לספק דוחות AST תוך 24 שעות מאיסוף הדגימות.

Abstract

אלח דם גראם-שלילי (GN) הוא מצב חירום רפואי שבו ניהול בסביבות מוגבלות במשאבים מסתמך על טכניקות תרבית מיקרוביולוגיות קונבנציונליות המספקות תוצאות תוך 3-4 ימים. מתוך הכרה בעיכוב זה בזמן האספקה (TAT), הן EUCAST והן CLSI פיתחו פרוטוקולים לקביעת תוצאות AST ישירות מבקבוקי תרבית דם אוטומטיים המסומנים באופן חיובי (+aBCs). פרוטוקול EUCAST rapid AST (RAST) הוצג לראשונה בשנת 2018, שם ניתן לדווח על נקודות שבירה בקוטר אזור עבור ארבעה סוכנים אטיולוגיים נפוצים של אלח דם GN, כלומר, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, וקומפלקס Acinetobacter baumannii . עם זאת, אותן מעבדות קליניות שיישמו שיטה זו בזרימת העבודה השגרתית שלהן מסתמכות על זיהוי מיקרוביאלי מבוסס ספקטרומטריית מסות, שאינו זמין בקלות, ובכך מונעות את יישומה בסביבות מוגבלות במשאבים. כדי לעקוף אותו, הערכנו פרוטוקול חיסון ישיר (DIP) באמצעות מערכת מסחרית אוטומטית לזיהוי מיקרוביאלי ובדיקת רגישות מיקרוביאלית (aMIAST) כדי לאפשר זיהוי מיקרוביאלי מוקדם תוך 8 שעות מסימון חיובי של aBC. הערכנו פרוטוקול זה מינואר עד אוקטובר 2023 כדי לזהות את ארבעת GN (RR-GN) RAST הניתנים לדיווח ב- aBC המסומן באופן חיובי. תוצאות הזיהוי המיקרוביאלי ב-DIP הושוו לפרוטוקול הכנת האינוקולום הסטנדרטי (SIP) ב-aMIAST. מתוך 204 +aBCs עם GN מונומורפי (+naBC), אחד מ-4 RR-GN זוהה ב-105 +naBCs על ידי SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 ו-A. baumannii complex: 26). מתוכם, 94% (98/105) זוהו נכון על ידי מח"ש ואילו טעויות גדולות וטעויות גדולות מאוד היו 6% (7/105) ו-1.7% (4/240), בהתאמה. כאשר DIP לזיהוי מיקרוביאלי נעשה בשיטת EUCAST RAST, ניתן לספק דוחות קליניים זמניים תוך 24 שעות מקבלת הדגימה. לגישה זו יש פוטנציאל להפחית באופן משמעותי את ה- TAT, ולאפשר מוסד מוקדם של טיפול אנטי מיקרוביאלי מתאים.

Introduction

אלח דם, בעיה בריאותית עולמית חשובה, מוגדר כתפקוד לקוי של איברים מסכני חיים עקב תגובת מארח לא מווסתת לזיהום. מחקר נטל המחלות העולמי העריך כי היו 48.9 מיליון מקרים של אלח דם ו -11 מיליון מקרי מוות הקשורים לאלח דם ברחבי העולם בשנת 2017, אשר היוו כמעט 20% מכלל מקרי המוות העולמיים1. בסביבות 2/3rd של זיהומים בזרם הדם (BSI) הגורמים לתמותה נובעים מפתוגנים חיידקיים שליליים גרם2. הגורמים המובילים לתמותה בקרב גראם שליליים (GN) הם Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, ו - Acinetobacter baumannii, המהווים כ -40% מהמקרים בקרב 33 פתוגנים חיידקיים2.

תרביות דם הן עדיין תקן הזהב לאבחון BSI, וזיהוי מיקרוביאלי מהיר יחד עם תוצאות בדיקות רגישות מיקרוביאליות (AST) הוא המפתח לניהול. ההערכה היא כי יש עלייה של 9% בסיכויים לתמותה עם עיכוב של כל שעה בהחדרת אנטי מיקרוביאלים מתאימים באלח דם3. זמן התפנית (TAT) של דוחות תרבית דם מיקרוביולוגית חיובית עם תוצאות AST הוא סביב 48-72 שעות עם הכלים המיקרוביולוגיים הזמינים בסביבות מוגבלות במשאבים, אפילו עם מערכות אוטומטיות. כתוצאה מתת-ה-TAT הזה, נעשה שימוש אמפירי באנטי-מיקרוביאלים רחבי-טווח, מה שתורם לבעיה המתפתחת של עמידות אנטי-מיקרוביאלית (AMR). מתוך הכרה בצורך הנואש הזה להפחית את ה-TAT עבור טכניקות תרבית מיקרוביולוגיות לאלח דם, EUCAST ו-CLSI מתקדמים לקראת ביצוע AST ישירות מבקבוקי תרבית דם עם סימון חיובי (+aBC)4,5.

בשנת 2018, EUCAST הציגה לראשונה את שיטת AST מהיר (RAST) לקביעת AST על ידי שיטת דיפוזיית דיסק קירבי-באואר בזמני דגירה קצרים, כלומר, 4 שעות, 6 שעות ו -8 שעות, ישירות מ +aBC 6,7. השיטה מאומתת כיום לקביעת AST עבור +aBCs המכילים אחד מ-8 הגורמים השכיחים ביותר ל-BSI, כלומר E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, ו-A. baumannii complex בקרב גראם-שליליים וסטפילוקוקוס אאורוס, Enterococcus faecalis, E. faecium ו-Streptococcus pneumoniae בקרב גראם חיוביים8. נקודות השבירה לקביעת AST בפרקי זמן שונים מסופקות בהתאם למינים מיקרוביאליים המפורטים לעיל. לפיכך, לפני פרשנות קטגורית של תוצאות AST, זיהוי מיקרוביאלי הוא הכרחי. עם זאת, תקן RAST אינו מציין את השיטה המאפשרת זיהוי מיקרוביאלי במסגרת זמן זו.

רוב המחקרים שהעריכו את שיטת EUCAST RAST בסביבתם השתמשו בזיהוי מיקרוביאלי מבוסס ספקטרומטריית מסות לאחר דגירה קצרה על מדיה מצופה כדי לזהות מיקרואורגניזמים 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . עם זאת, מכשירי ספקטרומטריית מסות אינם זמינים באופן נרחב, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה עד בינונית (LMICs), מה שמגביל מאוד את התועלת הפוטנציאלית של שיטה זו. מחקרים מעטים דיווחו על יישום שיטה זו במרכזים שלהם ללא שימוש בספקטרומטריית מסות 18,19,20. Tayşi et al.18 דיווחו על סיווג רחב של GN בין Enterobacterales, Pseudomonas, ו Acinetobacter spp. בהתבסס על מורפולוגיית כתם גרם ובדיקת אוקסידאז לפני פירוש תוצאות AST. במחקרים אחרים ממרכז זה, על ידי Gupta et al.19 ו- Siddiqui et al.20, זיהוי מיקרוביאלי ברמת המין נעשה על ידי הכנת גלולה חיידקית מתערובת מרק הדם המסומנת באופן חיובי וחיסונם בבדיקות הביוכימיות הקונבנציונליות. בעוד Tayşi et al.18 לא העירו על הדיוק של זיהוי מיקרוביאלי עם הגישה שלהם, Gupta et al.19 דיווחו כי עם הגישה שלהם ב 165/176 (94%) מקרים, RAST דיווח גרם שלילי (RR-GN), כלומר, אחד של E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, ו A. baumannii מורכב. עם זאת, בגישה השנייה, קריאת תוצאות RAST נעשתה בדיעבד באמצעות נקודות שבירה בקוטר אזור של 8 שעות רק לאחר הדגירה המלאה של תוצאות ביוכימיות קונבנציונליות, כלומר 18-24 שעות לאחר החיסון, והזמן הממוצע לדיווח היה בסביבות יומיים.

כדי להפחית עוד יותר את ה- TAT של דיווחים קליניים, אנו מציעים מתודולוגיה חלופית שתאפשר זיהוי מוקדם של GN הקיים ב- +aBCs באמצעות aMIAST. לפני כניסתן של מערכות זיהוי מיקרוביאליות מבוססות ספקטרומטריית מסות, מערכות זיהוי אוטומטיות אלה נחשבו לסטנדרט הטיפול בזיהוי מיקרוביאלי, כאשר הזיהוי התאפשר על ידי שינויים קולורימטריים ו / או פלואורומטריים הנגרמים על ידי חיידקי הבדיקה כאשר חוסנו בבדיקות ביוכימיות ממוזערות המאוחסנות בקלטת והתאמת התוצאות למסד הנתונים המבודד שלהם. הזמן הממוצע לזיהוי במערכות אלה הוא בין 4 שעות ל-8 שעות, אולם הן מוגבלות על ידי העובדה שהיצרנים ממליצים על גידול לילי של חיידקים לפני שניתן יהיה לחסן את תעודות הזהות שלהם. דרישה זו מגבילה מאוד את התועלת שלהם בצמצום זמן הדיווח.

מחקרים מעטים העריכו שיטות לזיהוי ישיר של מיקרובים מ- +aBCs באמצעות מערכות אוטומטיות אלה 21,22,23,24,25,26,27. במקרה של +aBCs המכילים GN מונומורפי, רוב המחקרים הראו התאמה מצוינת בין חיסון ישיר מכדורית חיידקית העשויה מתערובת מרק דם חיובית לבין דגירה סטנדרטית של מושבה. עם זאת, במקרה של גראם-חיוביים, שיעורי הקונקורדנציה היו תת-אופטימליים. מכיוון שהזמן הממוצע לחיוביות של +aBCs הוא בין 8 שעות ל -16 שעות וזיהוי של GN לוקח ~ 4 שעות עד 8 שעות במערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית, אנו משערים כי על ידי שימוש בפרוטוקול חיסון ישיר בזיהוי מיקרוביאלי אוטומטי, אנו יכולים להשלים את הדיווח הקליני של +aBCs כאשר ל- GN יש RR-GN תוך 24 שעות מקבלת הדגימה.

הגדרה למחקר
המחקר הנוכחי נערך במעבדה לבקטריולוגיה קלינית של מכון אקדמי בעל חשיבות לאומית (INI) במרכז הודו בין ינואר לאוקטובר 2023. המעבדה מצוידת במערכת ניטור תרבית דם רציפה (CBCMS) ו-aMIAST. המעבדה לבקטריולוגיה פועלת מסביב לשעון עם זמינות של טכנאים ומיקרוביולוגים לעיבוד ודיווח על כל בקבוק תרבית דם המסומן באופן חיובי (+aBCs).

שיטות מיקרוביאליות המשמשות כאן
זרימת העבודה של המחקר מוצגת באיור 1. +aBCs המציגים GNs מונומורפיים (+naBC) עובדו על ידי חיסון ישיר של כרטיסי זיהוי מתאימים כדי לאפשר זיהוי ו- AST באמצעות פרוטוקול EUCAST RAST. תוצאות אלה הושוו לשיטת הטיפול הסטנדרטי (SoC) עבור +aBCs, כלומר, תת-תרבית על מדיה מצופה קונבנציונלית באמצעות אגר דם כבשים (SBA), אגר שוקולד (CA) ואגר מקונקי (MA), מודגר באופן אירובי במשך 16 שעות עד 24 שעות ולאחר מכן כרטיסי זיהוי ו- AST הניתנים על ידי aMIAST כאשר מושבות מבודדות מופיעות. תרביות דם שהראו קוקוס גראם-חיובי, בצילוס גראם-חיובי, תאי שמרים ניצנים ו-≥2 מיקרואורגניזמים שונים על צביעת גרם ראשונית או מצע מצופה לא נכללו במחקר.

Protocol

המחקר, שמומן על ידי מענק מחקר פנימי שניתן לד"ר איוש גופטה על ידי AIIMS Bhopal, אושר על ידי ועדת האתיקה האנושית המוסדית (IHEC) vide letter no: IHEC- LOP/2022/IL072.

הערה: נפח דגימה של 5 מ"ל שימש בהתבסס על מחקרים שנעשו על ידי Quesada et al.25 ו Munoz-Davila et al.27.

1. פרוטוקול חיסונים סטנדרטי (SIP) לזיהוי חיידקים באמצעות aMIAST

  1. יש ללבוש כפפות נקיות, ובתוך ארון בטיחות ביולוגית Class IIa (BSC), לחטא את המחיצה של +naBC עם מטוש המכיל 70% אלכוהול איזופרופיל.
  2. צייר כ 1 מ"ל של תערובת מרק דם באמצעות מזרק סטרילי עם מחט 21 גרם.
  3. מוציאים טיפה אחת גדולה של תערובת מרק הדם מהמחט על פני השטח של המדיה המצופה, כלומר SBA, CA ו- MA. פזרו את הצלחות ודגרו על צלחות התרבית באינקובטור ב 37 ° C ± 2 ° C בתנאים אירוביים במשך 18-24 שעות.
  4. לאחר הדגירה, לבחון את הלוחות עבור המראה של מושבות מבודדות BSC ולהמשיך הלאה לזיהוי AST על ידי aMIAST.
  5. עבור כל מבודד, הניחו צינור פוליסטירן aMIAST במעמד צינור aMIAST והוסיפו לתוכו 3 מ"ל מלח סטרילי באמצעות מתקן המחובר לבקבוק המלח.
  6. געו בשלוש עד חמש מושבות דומות מורפולוגית בעזרת חוט חיסון סטרילי ישר והעבירו את החיסון החיידקי לצינור הראשון.
  7. התאימו את העכירות באמצעות מי מלח סטריליים בצינור המחוסן בין 0.47-0.63 מקפרלנד באמצעות מד צפיפות.
  8. מניחים את החיבור הנימי של כרטיס זיהוי aMIAST גרם שלילי בצינור הראשון.
  9. מקם את הקלפים שנבחרו במיקום מתאים על הקלטת. החיסון בקלטת מוכן ומגיע ל- aMIAST בקטע מילוי.
    אזהרה: גיל ההשעיה לא יעלה על 30 דקות לפני חיסון הכרטיסים.
  10. טען את הקלטת למיקומה בתא המילוי כשברקוד לדוגמה פונה פנימה.
  11. סגור את הדלת ולחץ על מילוי במסך ממשק המשתמש. מילוי הוא מחזור של 70 שניות. בסיום המחזור, נורית החיווי הכחולה במערכת תהבהב. הכנסת הקלפים למערכת aMIAST מפזרת את החיסון בתוך התאים הקטנים של הקלפים על ידי המכונה.
  12. מוציאים את הגרירה מתא המילוי, סוגרים את הדלת ומניחים בתא הטעינה. ברקודים נסרקים ונבדקים באופן אוטומטי מול רשימת עבודה אלקטרונית של קלטות וירטואליות. הקשיות נאטמות אוטומטית, והכרטיסים נטענים אוטומטית לקרוסלה. חץ כחול מהבהב ב- aMIAST מציין שהטעינה הסתיימה.
  13. הסר פסולת קלטות בסיום. ראה נוהל סילוק פסולת בספרות המוצר או פעל בהתאם לנהלים סטנדרטיים אחרים. השתמש בשארית המתלים בצינורות לתת-תרבית על אגר CLED לבדיקת טוהר המבודדים.
  14. קרא את התוצאות לאחר שהמכשיר משלים את הניתוח.

2. פרוטוקול חיסון ישיר (DIP) לזיהוי חיידקים באמצעות aMIAST

  1. ללבוש כפפות סטריליות, ובתוך ארון בטיחות ביולוגית, לנקות את המחיצה של +naBC עם מטוש המכיל 70% אלכוהול איזופרופיל.
  2. בעזרת מזרק סטרילי עם מחט של 21 גרם, קחו 5 מ"ל של אליקוט מתערובת מרק הדם של +naBC והעבירו אותו לצינור מפריד בסרום (SST) לאחר חיטוי מחיצת הגומי עם 70% אלכוהול איזופרופיל (איור 2A).
  3. צנטריפוגה זה aliquot במשך 10 דקות ב 160 x גרם כדי ליישב את תאי הדם בתערובת מרק הדם. לאחר הצנטריפוגה הראשונה, התבוננו בסופרנאטנט שבו תאי הדם יתיישבו.
  4. פתחו את פקק הבקבוקון בתוך ארון בטיחות ביולוגית, ובעזרת קצה סטרילי ופיפטה הסירו בזהירות את הסופרנאטנט והעבירו אותו לבקבוקון איסוף דם רגיל חדש (חלק עליון אדום) על ידי הסרת החלק העליון שלו.
  5. מניחים את הפקק על הבקבוקון וצנטריפוגות אותו שוב למשך 10 דקות ב 2000 x גרם. לאחר הצנטריפוגה השנייה, תיווצר גלולה חיידקית בתחתית.
  6. שאפו את הסופרנאטנט והשליכו אותו בעזרת פיפטה סטרילית וקצה. גלולת החיידק תישאר בתחתית הצינור ותשמש לחיסון תעודת הזהות של aMIAST.
    הערה: צינור מפריד סרום שימש בצנטריפוגה הראשונה ב 160 x גרם. זה התבסס על מחקרים שנעשו על ידי Quesada et al.25 ו Munoz-Davila et al.27, שבו צעד הצנטריפוגה הראשון נעשה בערך ב 30 x g ו 60 x g, בהתאמה. תערובת מרק הדם מ- +aBC צנטריפוגה תחילה במהירות נמוכה ב- SST כדי לפלוט את תאי הדם.
  7. מניחים צינור פוליסטירן aMIAST במעמד צינור aMIAST ומוסיפים לתוכו 3 מ"ל מלח סטרילי באמצעות מתקן המחובר לבקבוק המלח.
  8. באמצעות לולאת חיסון סטרילית, לוקחים את גלולת החיידקים מתחתית הבקבוקון ומחסנים אותה בצינור aMIAST
  9. חזור על שלבים 1.7-1.14.

3. AST לפי פרוטוקול EUCAST RAST4

  1. יש לשמור צלחות אגר מולר-הינטון עגולות (MHA) בקוטר 90 מ"מ לא מחוסנות מוכנות בארון הבטיחות הביולוגית.
  2. ללבוש כפפות סטריליות, ובתוך ארון בטיחות ביולוגית, לנקות את המחיצה של +naBC עם מטוש המכיל 70% אלכוהול איזופרופיל.
  3. בעזרת מזרק סטרילי, שואפים 125 μL ± 25 μL של תערובת מרק דם לא מדולל מ +naBC ומוסיפים לכל צלחת MHA במרכז.
  4. מורחים את המרק בעדינות על הצלחות בעזרת צמר גפן סטרילי לשלושה כיוונים ומורחים ≤ 6 דיסקים אנטי-מיקרוביאליים על כל צלחת.
  5. לדגור את הצלחות באינקובטור אירובי ב 35 °C (75 °F± 1 °C (75 °F) במשך 8 שעות. לאחר השלמת הדגירה, יש להקפיד על טוהר הבידוד.
  6. קרא את אזורי העיכוב ב- 8 שעות ± 5 דקות. פענח את התוצאות באמצעות טבלת נקודות השבירה של RAST עבור דגירה קצרה לאחר בדיקת תוצאות זיהוי החיידקים ב- aMIAST.
  7. דווח על תוצאות AST רק אם המבודד מזוהה כאחד מלוחות RR-GN ולוחות MHA ו- CLED מגדלים מורפוטיפ יחיד.

4. בקרת איכות

  1. בצע בקרת איכות פנימית עבור פרוטוקול SIP של aMIAST בהתאם להוראות היצרן באמצעות זני ייחוס מומלצים.
  2. בצע בקרת איכות פנימית של שיטת RAST מדי שבוע באמצעות זן הייחוס המומלץ של E. coli כמתואר להלן.
    1. סדרו 4 צינורות זכוכית סטריליים במעמד צינור. יש להוציא 3 מ"ל של מי מלח סטריליים בצינור הראשון ו-990 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים בכל אחד מהצינורות השני, השלישי והרביעי.
    2. בצע השעיה של 0.5 מקפרלנד של זן QC מהמושבות המבודדות של תרבות לילה על מדיה מצופה.
    3. באמצעות פיפטה סטרילית וקצה, להעביר 10 μL של השעיה מן הצינור הראשון אל הצינור השני.
    4. לאחר הערבוב, להעביר 10 μL של השעיה מן הצינור השני לצינור השלישי ולאחר מכן לאחר מכן אל הצינור האחרון.
    5. מן הצינור האחרון, לקחת 1 מ"ל של inoculum באמצעות מזרק סטרילי עם מחט ולהוסיף אותו aBC לא מחוסן.
    6. בו זמנית להוסיף 5 מ"ל של דם כבשים סטרילי ב aBC באמצעות מזרק סטרילי עם מחט לדגור אותו CBCMS עד שהוא מסמן חיובי עקב שינוי בצבע של חיישן תחליב נוזלי בבסיס aBC.
    7. חזור על שלבים כמוסבר בשלבים 1-3 לצורך זיהוי על-ידי SIP, DIP ו-RAST, בהתאמה. התוצאות הצפויות הן כי זן QC צריך להיות מזוהה כראוי על ידי שני פרוטוקולי זיהוי של aMIAST ואת קוטר האזור בלוחות RAST צריך להיות בטווח שצוין28.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. שקול זיהוי מיקרוביאלי באמצעות SIP כתקן זהב ואם אותו זיהוי מתקבל על ידי DIP, שקול אותו כקונקורדנציה.
  2. אם RR-GN, כלומר אחד מקומפלקס E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, ו- A. baumannii המזוהה באמצעות SIP הוא צורם ב- DIP, שקול זאת כשגיאה גדולה (ME) ואילו שקול את ההפך כשגיאה גדולה מאוד (VME) מכיוון שיש לו פוטנציאל להנפקת דוח עם זיהוי שגוי.
  3. חשב את שיעור הקונקורדנציה עבור RR-GN כיחס בין המספר הכולל של RR-GN לבין המספר הכולל של RR-GN המזוהה על ידי SIP כפול 100.
  4. חשב את שיעור ME כיחס בין מספר +naBCs המזוהים כבעלי non-RR-GN למספר הכולל של +naBCs עם RR-GN המזוהה על ידי SIP כפול 100.
  5. חשב את קצב VME כיחס בין מספר +naBCs שזוהו בטעות כבעלי RR-GN ב- DIP לבין המספר הכולל. של +naBCs שנבדקו על ידי DIP כפול 100.
  6. חשב את הזמן לזיהוי בידוד (TTI) כזמן שלקח לזהות את המבודד על ידי שני הפרוטוקולים מרגע סימון תרבית הדם על ידי CBCMS.
  7. חשב את ההפרשים בין DIP ו- SIP כהפחתה ב- TTI. חשב זאת רק עבור +naBCs קונקורדנטים בעלי RR-GN. שים לב לנקודות הזמן המתאימות מהשעונים של CBCMS ו- aMIAST.
  8. נהל נתונים ונתח באמצעות גיליון אלקטרוני. השתמש במבחן Mann-Whitney U עבור משתנים רציפים, בהתחשב בערך p דו-צדדי של ≤ 0.05 כמובהק סטטיסטית.

תוצאות

תוצאות כלליות
במהלך תקופת המחקר, 240+naBCs עברו זיהוי על ידי aMIAST באמצעות DIP ו- SIP. מתוכם, 15% (36/240) +naBCs נמצאו פולימיקרוביאליים לאחר דגירה לילית על המצע המצופה (plated media). מתוך 204 +naBCs, שיעור RR-GN שזוהה על ידי SIP היה 51.5% (105/204). ביניהם, 47.6% (50/105) היו E. coli, 19% (20/105) K. pneumoniae, 8.6% (9/105) P. aeruginosa ו ...

Discussion

באמצעות DIP, זיהינו בהצלחה את RR-GNs עם דיוק אבחוני ניכר. ממוצע ה- TTI לאחר סימון חיובי של aBC היה רק 507 דקות (~ 8.5 שעות). לכן, כאשר נעשה בשילוב עם שיטת EUCAST RAST לקביעת AST, זה יכול לתת זיהוי בידוד ב 8 שעות AST זמן קריאה. לגישה זו יש פוטנציאל ליישם את שיטת EUCAST RAST המייתרת את הצורך בזיהוי מבוסס ספקטרומטריית מסות. ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחקר מומן על ידי מענק מחקר פנימי שניתן לד"ר איוש גופטה על ידי AIIMS Bhopal. אנו מכירים בתרומתם של טכנאי המעבדה והרופאים המתמחים שביצעו וקראו את הבדיקות בשקידה בשעות השגרה והחירום.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD035-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Amoxyclav disk (20/10 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD063-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Cefotaxime disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD295E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ceftazidime disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD062A-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ciprofloxacin disk (5 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD060-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD010-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Gentamicin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD016-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Imipenem disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD073-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Levofloxacin disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD216-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Meropenem disk 10 µg Himedia, Mumbai, IndiaSD727-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD292E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Tobramycin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD044-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
ATCC Escherichia coli 25922Microbiologics, Minnesota USA0335ARecommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France412CM8423Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, IndiaDFP-2/21-22/149For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2Himedia, Mumbai, IndiaM834-500GPreparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BLLaby Instruments, Ambala, IndiaHLL/2021-22/021Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser BrandTech, Essex CT, EnglandV1200Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar Himedia, Mumbai, IndiaM008-500GDifferential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, IndiaNJ478162Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India521020Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar Himedia, Mumbai, IndiaM173-500GAntimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4Himedia, Mumbai, IndiaLA019For streaking onto culture media
Nichrome straight wireHimedia, Mumbai, IndiaLA022For stab inoculation
Nulife sterile GlovesMRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, IndiaFor safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367815Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep bloodLabline Trading Co., Hyderabad, India70014Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367954Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)Himedia, Mumbai, IndiaPW005-1X500NOLawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/ccNihal Healthcare, Solan, India2213805NB2Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kitbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France422219Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceV1204Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France533306-4 REVStand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubesbioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceTubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceVKC15144Automated identification and AST system
VITEK-2 GN cardbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France21341Identification of Gram negative bacilli

References

  1. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990–2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  2. Ikuta, K. S., et al. Global mortality associated with 33 bacterial pathogens in 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 400 (10369), 2221-2248 (2022).
  3. Liu, V. X., et al. The timing of early antibiotics and hospital mortality in sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 196 (7), 856-863 (2017).
  4. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 4.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 33rd ed. CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2023).
  6. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2018).
  7. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2018).
  8. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 6.1. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  9. Soo, Y. T., Waled, S. N. M. B., Ng, S., Peh, Y. H., Chew, K. L. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (5), 993-998 (2020).
  10. Berinson, B., et al. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST): Analytical performance and impact on patient management. J Antimicrob Chemother. 76 (5), 1332-1338 (2021).
  11. Strubbe, G., Messiaen, A. S., Vandendriessche, S., Verhasselt, B., Boelens, J. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) compared to conventional susceptibility testing: implementation and potential added value in a tertiary hospital in Belgium. Acta Clinica Belgica: Int J Clin Lab Med. 78 (5), 385-391 (2023).
  12. Jasuja, J. K., Zimmermann, S., Burckhardt, I. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) for positive blood cultures in clinical practice using a total lab automation. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (7), 1305-1313 (2020).
  13. Martins, A., et al. Rapid antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae by disk diffusion directly from blood culture bottles using the EUCAST RAST breakpoints. J Glob Antimicrob Resist. 22, 637-642 (2020).
  14. Ekwall-Larson, A., Fröding, I., Mert, B., Åkerlund, A., Özenci, V. Analytical performance and potential clinical utility of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing in blood cultures after four hours of incubation. Microbiol Spectr. 11 (2), e500122 (2023).
  15. Cerrudo, V., et al. Usefulness of EUCAST rapid antibiotic susceptibility breakpoints and screening cut-off values directly from blood cultures for the inference of β-lactam resistance mechanisms in Enterobacterales. JAC-Antimicrob Resist. 5 (1), 017 (2023).
  16. Shan, Y., et al. Evaluation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test for enterobacterales-containing blood cultures in China. J Clin Microbiol. 60 (4), e0255921 (2022).
  17. Jonasson, E., Matuschek, E., Kahlmeter, G. The EUCAST rapid disc diffusion method for antimicrobial susceptibility testing directly from positive blood culture bottles. J Antimicrob Chemother. 75 (4), 968-978 (2020).
  18. Tayşi, M. R., et al. Implementation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test (RAST) directly from positive blood culture bottles without the advanced identification systems. J Antimicrobial Chemotherapy. 77 (4), 1020-1026 (2022).
  19. Gupta, A., et al. A prospective study evaluating the effect of a ‘Diagnostic Stewardship Care-Bundle’ for automated blood culture diagnostics. J Glob Antimicrob Resist. 34, 119-126 (2023).
  20. Siddiqui, F., Gupta, A., Purwar, S., Saigal, S., Sharma, J. P. A prospective study to reduce turnaround time of microbiologically positive blood cultures in patients with sepsis in intensive care unit. Indian J Med Microbiol. 40 (4), 541-546 (2022).
  21. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiol Infect Dis. 72 (1), 20-31 (2012).
  22. Lemos, T. C., Cogo, L. L., Maestri, A. C., Hadad, M., Nogueira, K. d. a. S. Is it possible to perform bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing with a positive blood culture bottle for quick diagnosis of bloodstream infections. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 51 (2), 215-218 (2018).
  23. Funke, G., Funke-Kissling, P. Use of the BD PHOENIX automated microbiology system for direct identification and susceptibility testing of gram-negative rods from positive blood cultures in a three-phase trial. J Clin Microbiol. 42 (4), 1466-1470 (2004).
  24. Nimer, N. A., Al-Saa’da, R. J., Abuelaish, O. Accuracy of the VITEK 2 system for a rapid and direct identification and susceptibility testing of Gram negative rods and Gram-positive cocci in blood samples. East Mediterr Health J. 22 (3), 193-200 (2016).
  25. Quesada, M. D., et al. Performance of VITEK-2 Compact and overnight MicroScan panels for direct identification and susceptibility testing of Gram-negative bacilli from positive FAN BacT/ALERT blood culture bottles. Clin Microbiol Infect. 16 (2), 137-140 (2010).
  26. De Cueto, M., Ceballos, E., Martinez-Martinez, L., Perea, E. J., Pascual, A. Use of positive blood cultures for direct identification and susceptibility testing with the Vitek 2 system. J Clin Microbiol. 42 (8), 3734-3738 (2004).
  27. Munoz-Dávila, M. J., Yagüe, G., Albert, M., García-Lucas, T. Comparative evaluation of Vitek 2 identification and susceptibility testing of Gram-negative rods directly and isolated from BacT/ALERT-positive blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 31 (5), 663-669 (2012).
  28. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Quality control criteria for the implementation of the RAST method. Version 6.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  29. Chen, J. R., Lee, S. Y., Yang, B. H., Lu, J. J. Rapid identification and susceptibility testing using the VITEK 2 system using culture fluids from positive BacT/ALERT blood cultures. J Microbiol, Immunol Infect. 41 (3), 259-264 (2008).
  30. Bruins, M. J., Bloembergen, P., Ruijs, G. J. H. M., Wolfhagen, M. J. H. M. Identification and susceptibility testing of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa by direct inoculation from positive BACTEC blood culture bottles into Vitek 2. J Clin Microbiol. 42 (1), 7-11 (2004).
  31. Lupetti, A., Barnini, S., Castagna, B., Nibbering, P. H., Campa, M. Rapid identification and antimicrobial susceptibility testing of Gram-positive cocci in blood cultures by direct inoculation into the BD Phoenix system. Clin Microbiol Infect. 16 (7), 986-991 (2010).
  32. Barreales, A., Lara, M., Hernández, I., Díez, O. Rapid identification and susceptibility testing of Gram-positive cocci in BacT/ALERT blood cultures by direct inoculation into the Vitek 2 system. Rev Esp Quimioter. 24 (3), 131-135 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

EUCAST RASTEscherichia coliPseudomonas aeruginosaAcinetobacter Baumannii

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved