זיהוי מיקרוביאלי ישיר באמצעות מערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית כדי להקל על שיטת EUCAST RAST ללא ספקטרומטריית מסות

Summary

EUCAST פיתחה פרוטוקול בדיקת רגישות מיקרוביאלית ישירה (AST) עבור תרביות דם אוטומטיות. עם זאת, ניתן לייתר את תלותו בזיהוי מיקרוביאלי מבוסס ספקטרומטריית מסות על ידי שימוש בפרוטוקול הכנת חיסון ישיר במערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית. גישה זו יכולה לספק דוחות AST תוך 24 שעות מאיסוף הדגימות.

Abstract

אלח דם גראם-שלילי (GN) הוא מצב חירום רפואי שבו ניהול בסביבות מוגבלות במשאבים מסתמך על טכניקות תרבית מיקרוביולוגיות קונבנציונליות המספקות תוצאות תוך 3-4 ימים. מתוך הכרה בעיכוב זה בזמן האספקה (TAT), הן EUCAST והן CLSI פיתחו פרוטוקולים לקביעת תוצאות AST ישירות מבקבוקי תרבית דם אוטומטיים המסומנים באופן חיובי (+aBCs). פרוטוקול EUCAST rapid AST (RAST) הוצג לראשונה בשנת 2018, שם ניתן לדווח על נקודות שבירה בקוטר אזור עבור ארבעה סוכנים אטיולוגיים נפוצים של אלח דם GN, כלומר, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, וקומפלקס Acinetobacter baumannii . עם זאת, אותן מעבדות קליניות שיישמו שיטה זו בזרימת העבודה השגרתית שלהן מסתמכות על זיהוי מיקרוביאלי מבוסס ספקטרומטריית מסות, שאינו זמין בקלות, ובכך מונעות את יישומה בסביבות מוגבלות במשאבים. כדי לעקוף אותו, הערכנו פרוטוקול חיסון ישיר (DIP) באמצעות מערכת מסחרית אוטומטית לזיהוי מיקרוביאלי ובדיקת רגישות מיקרוביאלית (aMIAST) כדי לאפשר זיהוי מיקרוביאלי מוקדם תוך 8 שעות מסימון חיובי של aBC. הערכנו פרוטוקול זה מינואר עד אוקטובר 2023 כדי לזהות את ארבעת GN (RR-GN) RAST הניתנים לדיווח ב- aBC המסומן באופן חיובי. תוצאות הזיהוי המיקרוביאלי ב-DIP הושוו לפרוטוקול הכנת האינוקולום הסטנדרטי (SIP) ב-aMIAST. מתוך 204 +aBCs עם GN מונומורפי (+naBC), אחד מ-4 RR-GN זוהה ב-105 +naBCs על ידי SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 ו-A. baumannii complex: 26). מתוכם, 94% (98/105) זוהו נכון על ידי מח"ש ואילו טעויות גדולות וטעויות גדולות מאוד היו 6% (7/105) ו-1.7% (4/240), בהתאמה. כאשר DIP לזיהוי מיקרוביאלי נעשה בשיטת EUCAST RAST, ניתן לספק דוחות קליניים זמניים תוך 24 שעות מקבלת הדגימה. לגישה זו יש פוטנציאל להפחית באופן משמעותי את ה- TAT, ולאפשר מוסד מוקדם של טיפול אנטי מיקרוביאלי מתאים.

Introduction

אלח דם, בעיה בריאותית עולמית חשובה, מוגדר כתפקוד לקוי של איברים מסכני חיים עקב תגובת מארח לא מווסתת לזיהום. מחקר נטל המחלות העולמי העריך כי היו 48.9 מיליון מקרים של אלח דם ו -11 מיליון מקרי מוות הקשורים לאלח דם ברחבי העולם בשנת 2017, אשר היוו כמעט 20% מכלל מקרי המוות העולמיים¹. בסביבות 2/3^rd של זיהומים בזרם הדם (BSI) הגורמים לתמותה נובעים מפתוגנים חיידקיים שליליים גרם². הגורמים המובילים לתמותה בקרב גראם שליליים (GN) הם Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, ו - Acinetobacter baumannii, המהווים כ -40% מהמקרים בקרב 33 פתוגנים חיידקיים

Protocol

המחקר, שמומן על ידי מענק מחקר פנימי שניתן לד"ר איוש גופטה על ידי AIIMS Bhopal, אושר על ידי ועדת האתיקה האנושית המוסדית (IHEC) vide letter no: IHEC- LOP/2022/IL072.

הערה: נפח דגימה של 5 מ"ל שימש בהתבסס על מחקרים שנעשו על ידי Quesada et ^al.25 ו Munoz-Davila et ^al.27.

1. פרוטוקול חיסונים סטנדרטי (SIP) לזיהוי חיידקים באמצעות aMIAST

1. יש ללבוש כפפות נקיות, ובתוך ארון בטיחות ביולוגית Class IIa (BSC), לחטא את המחיצה של +naBC עם מטוש המכיל 70% אלכוהול איזופרופיל.
2. צייר כ 1 מ"ל של תערובת מרק דם באמצעות מזרק סטרילי עם מחט 21 גרם.
3. מו....

תוצאות

תוצאות כלליות
במהלך תקופת המחקר, 240+naBCs עברו זיהוי על ידי aMIAST באמצעות DIP ו- SIP. מתוכם, 15% (36/240) +naBCs נמצאו פולימיקרוביאליים לאחר דגירה לילית על המצע המצופה (plated media). מתוך 204 +naBCs, שיעור RR-GN שזוהה על ידי SIP היה 51.5% (105/204). ביניהם, 47.6% (50/105) היו E. coli, 19% (20/105) K. pneumoniae, 8.6% (9/105) P. aeruginosa ו .......

Discussion

באמצעות DIP, זיהינו בהצלחה את RR-GNs עם דיוק אבחוני ניכר. ממוצע ה- TTI לאחר סימון חיובי של aBC היה רק 507 דקות (~ 8.5 שעות). לכן, כאשר נעשה בשילוב עם שיטת EUCAST RAST לקביעת AST, זה יכול לתת זיהוי בידוד ב 8 שעות AST זמן קריאה. לגישה זו יש פוטנציאל ליישם את שיטת EUCAST RAST המייתרת את הצורך בזיהוי מבוסס ספקטרומטריית מסות. ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli