질량 분석법 없이 EUCAST RAST 방법을 용이하게 하기 위해 자동 미생물 식별 시스템을 사용한 직접 미생물 식별

요약

EUCAST는 자동 혈액 배양을 위한 직접 항균제 감수성 검사(AST) 프로토콜을 개발했습니다. 그러나 질량 분석 기반 미생물 식별에 대한 의존성은 자동화된 미생물 식별 시스템에서 직접 접종 준비 프로토콜을 사용하여 제거할 수 있습니다. 이 접근 방식은 검체 채취 후 24시간 이내에 AST 보고서를 제공할 수 있습니다.

초록

그람 음성(GN) 패혈증은 자원이 제한된 환경에서 3-4일 내에 결과를 제공하는 기존의 미생물 배양 기술에 의존하는 의료 응급 상황입니다. 이러한 처리 시간(TAT)의 지연을 인식하여 EUCAST와 CLSI는 양성 플래그가 지정된 자동 혈액 배양 병(+aBC)에서 직접 AST 결과를 결정하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. EUCAST rapid AST(RAST) 프로토콜은 2018년에 처음 도입되었으며, GN 패혈증의 4가지 일반적인 원인 병원체, 즉 대장균, 폐렴균, 녹농균, 아시네토박터 바우마니 복합체에 대한 구역 지름 중단점을 보고할 수 있습니다. 그러나 일상적인 워크플로우에서 이 방법을 구현한 임상 실험실은 쉽게 사용할 수 없는 질량 분석 기반 미생물 식별에 의존하므로 자원이 제한된 환경에서 구현할 수 없습니다. 이를 피하기 위해 상용 자동 미생물 식별 및 항균제 감수성 검사 시스템(aMIAST)을 사용하여 직접 접종 프로토콜(DIP)을 평가하여 aBC 양성 플래그 후 8시간 이내에 미생물을 조기에 식별할 수 있도록 했습니다. 2023년 1월부터 10월까지 이 프로토콜을 평가하여 긍정적으로 플래그가 지정된 aBC에서 4개의 RAST 보고 가능 GN(RR-GN)을 식별했습니다. DIP의 미생물 식별 결과를 aMIAST의 표준 접종 준비 프로토콜(SIP)과 비교했습니다. 단형성 GN(+naBC)을 가진 204개의 +aBC 중에서, 4개의 RR-GN 중 하나가 SIP에 의해 105개의 +naBCs에서 확인되었다(E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 및 A. baumannii complex: 26). 이 중 94%(98/105)는 DIP에 의해 정확하게 식별된 반면 주요 오류율과 매우 중요한 오류율은 각각 6%(7/105) 및 1.7%(4/240)였습니다. EUCAST RAST 방법을 사용하여 미생물 식별을 위한 DIP를 수행하는 경우 검체 수령 후 24시간 이내에 임시 임상 보고서를 제공할 수 있습니다. 이 접근법은 TAT를 크게 줄여 적절한 항균 요법을 조기에 시행할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

서문

전 세계적으로 중요한 건강 문제인 패혈증은 감염에 대한 숙주 반응 조절 장애로 인해 생명을 위협하는 장기 기능 장애로 정의됩니다. 글로벌 질병 부담 연구(Global Burden of Diseases Study)에 따르면 2017년 전 세계적으로 4,890만 건의 패혈증 사례와 1,100만 명의 패혈증 관련 사망자가 발생한 것으로 추정되었으며, 이는 전^{세계 사망자의} 거의 20%를 차지합니다1. 사망을 유발하는 혈류 감염(BSI^{)의 약} 2/3는 그람 음성 세균 병원체에 의한 것이다². 그람음성병원체(GN)의 주요 사망 원인은 대장균(Escherichia coli), 폐렴균( Klebsiella pneumoniae), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)이며, 이들은 33종의 세균성 병원체 중 발병 사례의 약 40%를 차지한다².

혈액 배양은 BSI 진단을 위한 황금 표준으로 남아 있으며, 항균제 감수성 검사(AST) 결과와 함께 신속한 미생물 식별이 관리의....

프로토콜

AIIMS Bhopal이 Ayush Gupta 박사에게 제공한 교내 연구 보조금으로 자금을 지원받은 이 연구는 IHEC(Institutional Human Ethics Committee) 비디오 레터 번호: IHEC-LOP/2022/IL072의 승인을 받았습니다.

참고: 5ml의 샘플 부피는 Quesada et ^al.25 및 Munoz-Davila et ^al.27이 수행한 연구를 기반으로 사용되었습니다.

1. aMIAST를 사용한 세균 식별을 위한 표준 접종 프로토콜(SIP)

1. 깨끗한 장갑을 착용하고 Class-IIa 생물 안전 캐비닛(BSC) 내부에서 70% 이소프로필 알코올이 포함된 면봉으로 +naBC의 중격을 소독합니다.
2. 21G 바늘이 있는 멸균 주사기를 사용하여 약 1mL의 혈액-육수 혼합물을 그립니다.
3. 바늘에서 혈액 육수 혼합물 1 방울을 도금 매체, 즉 SBA, CA 및 MA의 표면에 분배합니다. 플레이트를 줄무늬로 만들고 배양 플레이트를 37°C ± 2°C의 호기성 조건에서 18-24시간 동안 배양합니다.
....

토론

DIP를 사용하여 상당한 진단 정확도로 RR-GN을 성공적으로 식별했습니다. aBC의 양성 플래그 후 평균 TTI는 507분(~ 8.5시간)에 불과했습니다. 따라서 AST 측정을 위한 EUCAST RAST 방법과 함께 수행하면 8시간 AST 판독 시간에 격리 식별을 제공할 수 있습니다. 이 접근법은 질량 분석법 기반 식별의 필요성을 없애는 EUCAST RAST 방법을 구현할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이는 임상 보고 시간을 줄이고 구?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli