Identificación microbiana directa mediante un sistema automatizado de identificación microbiana para facilitar el método EUCAST RAST sin espectrometría de masas

Resumen

EUCAST ha desarrollado un protocolo de pruebas directas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) para hemocultivos automatizados. Sin embargo, su dependencia de la identificación microbiana basada en espectrometría de masas puede evitarse mediante el uso de un protocolo de preparación directa de inóculo en un sistema automatizado de identificación microbiana. Este enfoque puede proporcionar informes AST dentro de las 24 horas posteriores a la recolección de la muestra.

Resumen

La sepsis gramnegativa (GN) es una emergencia médica en la que el tratamiento en entornos de recursos limitados se basa en técnicas convencionales de cultivo microbiológico que proporcionan resultados en 3-4 días. Reconociendo este retraso en el tiempo de respuesta (TAT), tanto EUCAST como CLSI han desarrollado protocolos para determinar los resultados de AST directamente a partir de frascos de hemocultivo automatizados (+aBC) marcados positivamente. El protocolo EUCAST rapid AST (RAST) se introdujo por primera vez en 2018, donde se pueden informar puntos de corte de diámetro de zona para cuatro agentes etiológicos comunes de la sepsis GN, es decir, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aerugintosa y Acinetobacter baumannii complex. Sin embargo, los laboratorios clínicos que han implementado este método en su flujo de trabajo rutinario confían en la identificación microbiana basada en espectrometría de masas, que no está fácilmente disponible, lo que impide su implementación en entornos con recursos limitados. Para evitarlo, evaluamos un protocolo de inóculo directo (DIP) utilizando un sistema comercial automatizado de identificación microbiana y pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (aMIAST) para permitir la identificación microbiana temprana dentro de las 8 h posteriores a la señalización positiva de aBC. Evaluamos este protocolo de enero a octubre de 2023 para identificar los cuatro GN DE NOTIFICACIÓN OBLIGATORIA DE RAST (RR-GN) en el aBC marcado positivamente. Los resultados de la identificación microbiana en DIP se compararon con el protocolo estándar de preparación de inóculo (SIP) en aMIAST. De 204 +aBCs con GN monomórfica (+naBC), una de las 4 RR-GN fue identificada en 105 +naBCs por SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 y A. baumannii complex: 26). De estos, el 94% (98/105) fueron identificados correctamente por DIP, mientras que las tasas de error mayor y error muy grave fueron del 6% (7/105) y 1,7% (4/240), respectivamente. Cuando la DIP para la identificación microbiana se realiza utilizando el método EUCAST RAST, se pueden proporcionar informes clínicos provisionales dentro de las 24 horas posteriores a la recepción de la muestra. Este enfoque tiene el potencial de reducir significativamente el TAT, lo que permite la instauración temprana de una terapia antimicrobiana adecuada.

Introducción

La sepsis, un importante problema de salud mundial, se define como una disfunción orgánica potencialmente mortal debido a una respuesta desregulada del huésped a la infección. El Estudio sobre la Carga Mundial de Enfermedades estimó que en 2017 hubo 48,9 millones de casos de sepsis y 11 millones de muertes relacionadas con la sepsis en todo el mundo, lo que representó casi el 20% de todas las muertes mundiales¹. Alrededor de 2/3 de^las infecciones del torrente sanguíneo (ISB) que causan mortalidad se deben a patógenos bacterianos gramnegativos². Las principales causas de mortalidad entre los gramnegativos (GN) ....

Protocolo

El estudio, financiado por la beca de investigación interna otorgada al Dr. Ayush Gupta por AIIMS Bhopal, fue aprobado por el Comité Institucional de Ética Humana (IHEC) vide carta no: IHEC- LOP/2022/IL072.

NOTA: Se utilizó un volumen de muestra de 5 ml en base a los estudios realizados por Quesada et ^al.25 y Muñoz-Dávila et ^al.27.

1. Protocolo estándar de inóculo (SIP) para la identificación bacteriana mediante aMIAST

1. Use guantes limpios y, dentro de un gabinete de bioseguridad (BSC) de clase IIa, desinfecte el tabique de +naBC con un his....

Discusión

Utilizando DIP, identificamos con éxito los RR-GN con una precisión diagnóstica considerable. La media de TTI después del marcado positivo de aBC fue de solo 507 min (~ 8,5 h). Por lo tanto, cuando se realiza junto con el método EUCAST RAST para la determinación de AST, puede proporcionar una identificación aislada a las 8 h de tiempo de lectura de AST. Este enfoque tiene el potencial de implementar el método EUCAST RAST, obviando la necesidad de una identificación basada en espectrometría de masas. Esto es una.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli