質量分析を伴わないEUCAST RAST法を容易にする自動微生物同定システムを用いた直接微生物同定(英語)

要約

EUCASTは、自動血液培養のための直接抗菌剤感受性試験(AST)プロトコルを開発しました。しかし、質量分析に基づく微生物同定への依存は、自動微生物同定システムにおける直接接種調製プロトコルを使用することで回避することができます。このアプローチでは、サンプル収集から24時間以内にASTレポートを提供できます。

要約

グラム陰性(GN)敗血症は、リソースが限られている環境での管理が従来の微生物学的培養技術に依存している医療緊急事態であり、3〜4日で結果が得られます。このターンアラウンドタイム(TAT)の遅延を認識して、EUCASTとCLSIは、陽性フラグが立てられた自動血液培養ボトル(+aBC)から直接AST結果を決定するためのプロトコルを開発しました。EUCAST rapid AST (RAST) プロトコルは 2018 年に初めて導入され、GN 敗血症の 4 つの一般的な病因、すなわち大 腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、および アシネトバクター バウマニー 複合体のゾーン直径ブレークポイントを報告できます。しかし、この方法を日常的なワークフローに導入している臨床検査室は、質量分析法に基づく微生物同定に依存しており、これは容易に入手できないため、リソースが限られている環境でのこの分析法の導入は困難です。これを回避するために、市販の自動微生物同定および抗菌剤感受性試験システム(aMIAST)を使用して直接接種プロトコル(DIP)を評価し、aBCの陽性フラグから8時間以内の早期微生物同定を可能にしました。2023年1月から10月にかけてこのプロトコルを評価し、陽性フラグが立てられたaBCの4つのRAST報告可能GN(RR-GN)を特定しました。DIPにおける微生物同定結果を、aMIASTの標準的な接種物調製プロトコル(SIP)と比較した。単型GN(+naBC)を持つ204の+aBCのうち、4つのRR-GNのうちの1つがSIPによって105の+naBCで同定されました(大腸菌: 50、 K.pneumoniae: 20、 P.aeruginosa: 9 、A.baumannii 複合体:26)。これらのうち、94%(98/105)がDIPによって正しく識別されましたが、メジャーエラー率と非常にメジャーエラー率はそれぞれ6%(7/105)と1.7%(4/240)でした。EUCAST RAST法を使用して微生物同定のためのDIPを行うと、サンプルを受け取ってから24時間以内に暫定的な臨床レポートを提供できます。このアプローチは、TATを大幅に減少させる可能性を秘めており、適切な抗菌療法を早期に開始することを可能にします。

概要

敗血症は、重要な世界的な健康問題であり、感染に対する宿主の反応の調節不全による生命を脅かす臓器機能障害と定義されています。「Global Burden of Diseases Study」によると、2017年の世界の敗血症症例数は4,890万人、敗血症関連死者数は1,100万人で、これは全世界の死亡者数の約20%を占めています¹。死亡を引き起こす血流感染症(BSI)の約2^/ 3は、グラム陰性細菌性病原体によるものです²。グラム陰性菌(GN)の死亡原因としては、 大腸菌、 肺炎桿菌、 緑膿菌、ア シネトバクター・バウマニーが主な原因で、33種類の細菌性病原体のうち約40%を占めています²。

血液培養は依然としてBSIの診断のゴールドスタンダードであり、抗菌薬感受性試験(AST)の結果とともに微生物を迅速に同定することが管理の鍵となります。敗血症3では、適切な抗菌薬の投与が1時間遅れるごとに、死亡率が9%増加すると推定され^{ています。}AST結果を含む微生物学的に陽性の血液培養報告のターンアラウンドタイム(TAT)は、自動化されたシステムであっても、リソースが限られている環境で利用可能な微生物学的ツール....

プロトコル

この研究は、AIIMSボパールがアユシュ・グプタ博士に与えた学内研究助成金によって資金提供され、機関人間倫理委員会(IHEC)の書簡番号:IHEC-LOP/2022/IL072によって承認されました。

注:Quesadaら²⁵ およびMunoz-Davilaら²⁷によって行われた研究に基づいて、5mlのサンプル容量を使用しました。

1. aMIASTを用いた細菌同定のための標準接種プロトコール(SIP)

1. 清潔な手袋を着用し、クラスIIaバイオセーフティキャビネット(BSC)内で、70%イソプロピルアルコールを含む綿棒で+naBCの中隔を消毒します。
2. 21Gの針が付いた滅菌シリンジを使用して、約1 mLの血液とブロスの混合物を引き出します。.
3. 1 大滴の血液ブロス混合物を針から 1 滴、つまり SBA、CA、MA のめっき媒体の表面に分注します。プレートに線を引いて、インキュベーター内で培養プレートをインキュベーター内で37°C±2°C、好気性条件下で18〜24時間インキュベートします。
4. インキュベーション後、BSCで単離されたコロニーがプレートに出現するかどうかを調べ、さらにaMIASTによる同定とASTに進みます....

ディスカッション

DIPを用いて、RR-GNをかなりの診断精度で同定することに成功しました。aBCの陽性フラグ付け後の平均TTIはわずか507分(~8.5時間)でした。したがって、AST測定のためのEUCAST RAST法と組み合わせて使用すると、8時間のAST読み取り時間で分離物の同定を行うことができます。このアプローチは、EUCAST RAST法を実装する可能性を秘めており、質量分析ベースの同定の必要性を排除します。これは、EUCAST RA.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli