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Resumo

A EUCAST desenvolveu um protocolo direto de teste de suscetibilidade antimicrobiana (AST) para hemoculturas automatizadas. No entanto, sua dependência da identificação microbiana baseada em espectrometria de massa pode ser evitada usando um protocolo de preparação direta de inóculo em um sistema automatizado de identificação microbiana. Essa abordagem pode fornecer relatórios de AST dentro de 24 horas após a coleta da amostra.

Resumo

A sepse Gram-negativa (GN) é uma emergência médica em que o manejo em ambientes com recursos limitados depende de técnicas convencionais de cultura microbiológica que fornecem resultados em 3-4 dias. Reconhecendo esse atraso no tempo de resposta (TAT), tanto o EUCAST quanto o CLSI desenvolveram protocolos para determinar os resultados da AST diretamente de frascos de hemocultura automatizados sinalizados positivamente (+aBCs). O protocolo EUCAST rapid AST (RAST) foi introduzido pela primeira vez em 2018, onde podem ser relatados pontos de interrupção do diâmetro da zona para quatro agentes etiológicos comuns da sepse GN, ou seja, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e complexo Acinetobacter baumannii . No entanto, os laboratórios clínicos que implementaram esse método em seu fluxo de trabalho de rotina dependem da identificação microbiana baseada em espectrometria de massa, que não está facilmente disponível, impedindo assim sua implementação em ambientes com recursos limitados. Para contorná-lo, avaliamos um protocolo de inóculo direto (DIP) usando um sistema comercial automatizado de identificação microbiana e teste de suscetibilidade antimicrobiana (aMIAST) para permitir a identificação microbiana precoce dentro de 8 h após a sinalização positiva de aBC. Avaliamos este protocolo de janeiro a outubro de 2023 para identificar os quatro GN relatáveis RAST (RR-GN) no aBC sinalizado positivamente. Os resultados da identificação microbiana na DIP foram comparados com o protocolo de preparação de inóculo padrão (SIP) em aMIAST. De 204 +aBCs com GN monomórfico (+naBC), um dos 4 RR-GN foi identificado em 105 +naBCs por SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 e complexo A. baumannii : 26). Destes, 94% (98/105) foram corretamente identificados pelo DIP, enquanto as taxas de erro maior e muito maior foram de 6% (7/105) e 1,7% (4/240), respectivamente. Quando a DIP para identificação microbiana é feita usando o método EUCAST RAST, relatórios clínicos provisórios podem ser fornecidos dentro de 24 horas após o recebimento da amostra. Essa abordagem tem o potencial de reduzir significativamente o TAT, permitindo a instituição precoce de terapia antimicrobiana apropriada.

Introdução

A sepse, um importante problema de saúde global, é definida como disfunção orgânica com risco de vida devido a uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção. O Global Burden of Diseases Study estimou que houve 48,9 milhões de casos de sepse e 11 milhões de mortes relacionadas à sepse em todo o mundo em 2017, o que representou quase 20% de todas as mortes globais1. Cercade 2 /3 das infecções da corrente sanguínea (ICS) que causam mortalidade são devidas a patógenos bacterianos gram-negativos2. As principais causas de mortalidade entre gram-negativos (GN) são Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, que respondem por cerca de 40% dos casos entre 33 patógenos bacterianos2.

As hemoculturas continuam sendo o padrão-ouro para o diagnóstico de BSI, e a rápida identificação microbiana, juntamente com os resultados do teste de suscetibilidade antimicrobiana (AST), é a chave para o tratamento. Estima-se que haja um aumento de 9% nas chances de mortalidade com cada hora de atraso na instituição de antimicrobianos apropriados na sepse3. O tempo de resposta (TAT) de relatórios de hemocultura microbiologicamente positivos com resultados AST é de cerca de 48-72 h com as ferramentas microbiológicas disponíveis em ambientes com recursos limitados, mesmo com sistemas automatizados. Como resultado desse TAT abaixo da média, antimicrobianos de amplo espectro são usados empiricamente, contribuindo para o crescente problema da resistência antimicrobiana (AMR). Reconhecendo essa extrema necessidade de reduzir o TAT para técnicas de cultura microbiológica para sepse, o EUCAST e o CLSI estão se movendo para a realização de AST diretamente de frascos de hemocultura sinalizados positivamente (+aBC)4,5.

Em 2018, a EUCAST introduziu pela primeira vez o método AST rápido (RAST) para determinar AST pelo método de difusão de disco Kirby-Bauer em tempos de incubação curtos, ou seja, 4 h, 6 h e 8 h, diretamente de +aBC 6,7. O método está atualmente validado para determinar AST para +aBCs contendo uma das 8 causas mais comuns de ICS, a saber, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e complexo A. baumannii entre gram-negativos e Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium e Streptococcus pneumoniae entre gram-positivos8. Os pontos de interrupção para determinação de AST em vários intervalos de tempo são fornecidos de acordo com as espécies microbianas listadas acima. Portanto, antes da interpretação categórica dos resultados da AST, a identificação microbiana é necessária. No entanto, o padrão RAST não especifica o método para permitir a identificação microbiana dentro desse período de tempo.

A maioria dos estudos que avaliam o método EUCAST RAST em seu cenário usou a identificação microbiana baseada em espectrometria de massa após curta incubação em meio plaqueado para identificar microrganismos 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . No entanto, os instrumentos de espectrometria de massa não estão amplamente disponíveis, especialmente em países de baixa e média renda (LMICs), o que limita muito a utilidade potencial desse método. Poucos estudos relataram a implementação desse método em seus centros sem o uso de espectrometria de massa 18,19,20. Tayşi et al.18 relataram uma ampla categorização de GN entre Enterobacterales, Pseudomonas e Acinetobacter spp. com base na morfologia da coloração de Gram e no teste da oxidase antes de interpretar os resultados da AST. Em outros estudos desse centro, de Gupta et al.19 e Siddiqui et al.20, a identificação microbiana em nível de espécie foi feita preparando um pellet bacteriano a partir da mistura de caldo de sangue sinalizada positivamente e inoculando-o nos testes bioquímicos convencionais. Embora Tayşi et al.18 não tenham comentado sobre a precisão da identificação microbiana com sua abordagem, Gupta et al.19 relataram que, com sua abordagem, em 165/176 (94%) casos, um Gram-negativo relatável por RAST (RR-GN), ou seja, de E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii complexo. No entanto, com a última abordagem, a leitura dos resultados do RAST foi feita retrospectivamente usando pontos de interrupção de 8 h de diâmetro de zona somente após a incubação completa dos resultados bioquímicos convencionais, ou seja, 18-24 h após a inoculação, e o tempo médio para relatório foi de cerca de 2 dias.

Para reduzir ainda mais o TAT dos relatórios clínicos, propomos uma metodologia alternativa para permitir a identificação precoce de GN presente em +aBCs usando aMIAST. Antes da introdução de sistemas de identificação microbiana baseados em espectrometria de massa, esses sistemas de identificação automatizados eram considerados o padrão de atendimento para identificação microbiana, onde a identificação era possibilitada por alterações colorimétricas e/ou fluorométricas induzidas por bactérias de teste quando inoculadas em testes bioquímicos miniaturizados abrigados em um e combinando os resultados com seu banco de dados de isolados. O tempo médio de identificação nesses sistemas é de cerca de 4 h a 8 h, no entanto, eles são limitados pelo fato de que os fabricantes recomendam o crescimento noturno de micróbios antes que seus respectivos cartões de identificação possam ser inoculados. Esse requisito limita muito sua utilidade na redução do tempo de relatório.

Poucos estudos avaliaram métodos para identificar diretamente micróbios de +aBCs usando esses sistemas automatizados 21,22,23,24,25,26,27. No caso de +aBCs contendo GN monomórfico, a maioria dos estudos mostrou excelente concordância entre a inoculação direta de pellets bacterianos feitos de mistura de caldo de sangue positiva e incubação de colônias padrão. No entanto, no caso dos gram-positivos, as taxas de concordância foram abaixo do ideal. Como o tempo médio para positividade de +aBCs está entre 8 h e 16 h e a identificação de GN leva ~4 h a 8 h em um sistema automatizado de identificação microbiana, levantamos a hipótese de que, empregando o protocolo de inoculação direta na identificação microbiana automatizada, podemos concluir o relatório clínico de +aBCs com GN tendo um RR-GN dentro de 24 h após o recebimento da amostra.

Cenário para o estudo
O presente estudo foi realizado no laboratório de bacteriologia clínica de um instituto acadêmico de cuidados terciários de importância nacional (INI) com 950 leitos na Índia Central, de janeiro a outubro de 2023. O laboratório está equipado com um sistema de monitorização contínua da hemocultura (CBCMS) e aMIAST. O laboratório de bacteriologia funciona 24 horas por dia, com a disponibilidade de técnicos e microbiologistas para processar e relatar qualquer frasco de hemocultura sinalizado positivamente (+aBCs).

Métodos microbianos usados aqui
O fluxo de trabalho do estudo é mostrado na Figura 1. Os +aBCs que mostram GNs monomórficos (+naBC) foram processados por inoculação direta dos cartões de identificação correspondentes para permitir a identificação e AST usando o protocolo EUCAST RAST. Esses resultados foram comparados com o método padrão de tratamento (SoC) para +aBCs, ou seja, subcultura em meio convencional plaqueado por meio de ágar sangue de ovelha (SBA), ágar chocolate (CA) e ágar MacConkey (MA), incubado aerobicamente por 16 h a 24 h, seguido de cartões de identificação e AST dados por aMIAST quando colônias isoladas aparecem. Hemoculturas mostrando cocos gram-positivos, bacilos gram-positivos, células de levedura em brotamento e ≥2 microrganismos diferentes na coloração inicial de Gram ou em meio plaqueado foram excluídas do estudo.

Protocolo

O estudo, financiado pela bolsa de pesquisa interna concedida ao Dr. Ayush Gupta pelo AIIMS Bhopal, foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana Institucional (IHEC) vide carta nº: IHEC- LOP/2022/IL072.

NOTA: Um volume amostral de 5 ml foi utilizado com base nos estudos realizados por Quesada et al.25 e Munoz-Davila et al.27.

1. Protocolo de inóculo padrão (SIP) para identificação bacteriana usando aMIAST

  1. Use luvas limpas e, dentro de um gabinete de biossegurança Classe IIa (BSC), desinfete o septo de +naBC com um cotonete contendo álcool isopropílico 70%.
  2. Retire aproximadamente 1 mL da mistura de caldo de sangue usando uma seringa estéril com uma agulha de 21 G.
  3. Dispense 1 gota grande da mistura de caldo de sangue da agulha na superfície do meio plaqueado, ou seja, SBA, CA e MA. Riscar as placas e incubar as placas de cultura numa incubadora a 37 °C ± 2 °C em condições aeróbias durante 18-24 h.
  4. Após a incubação, examinar as placas quanto ao aparecimento de colónias isoladas num BSC e prosseguir para a identificação e AST por aMIAST.
  5. Para cada isolado, coloque um tubo de poliestireno aMIAST no suporte do tubo aMIAST e adicione 3 mL de solução salina estéril usando um dispensador conectado ao frasco de solução salina.
  6. Toque de três a cinco colônias morfologicamente semelhantes com um fio de inoculação estéril e reto e transfira o inóculo bacteriano para o primeiro tubo.
  7. Ajuste a turbidez usando solução salina estéril no tubo inoculado entre 0,47-0,63 McFarland usando um densitômetro.
  8. Coloque a fixação capilar do cartão de identificação gram-negativo aMIAST no primeiro tubo.
  9. Coloque os cartões selecionados em uma posição apropriada no. O inóculo no está pronto e chega ao aMIAST na seção de enchimento.
    CUIDADO: A idade da suspensão não deve exceder 30 minutos antes de inocular os cartões.
  10. Carregue o em sua posição na câmara de enchimento com o código de barras de amostra voltado para dentro.
  11. Feche a porta e pressione Preencher na tela da interface do usuário. O enchimento é um ciclo de 70 s. Quando o ciclo estiver concluído, a luz indicadora azul no sistema piscará. A colocação dos cartões no sistema aMIAST distribui o inóculo dentro das pequenas câmaras dos cartões pela máquina.
  12. Remova o da câmara de enchimento, feche a porta e coloque na câmara de carregamento. Os códigos de barras são digitalizados automaticamente e verificados em relação à lista de trabalho eletrônica de virtual. Os canudos são selados automaticamente e os cartões são carregados automaticamente no carrossel. A seta azul piscando no aMIAST indica que o carregamento foi concluído.
  13. Remova os resíduos de quando terminar. Consulte o procedimento de descarte de resíduos na literatura do produto ou siga outras práticas padrão. Utilizar o resto da suspensão nos tubos para subcultura em ágar CLED para verificação da pureza dos isolados.
  14. Leia os resultados depois que o instrumento concluir a análise.

2. Protocolo de inóculo direto (DIP) para identificação bacteriana usando aMIAST

  1. Use luvas estéreis e, dentro de um gabinete de biossegurança, limpe o septo de +naBC com um cotonete contendo álcool isopropílico 70%.
  2. Usando uma seringa estéril com uma agulha de 21 G, retire 5 mL de alíquota da mistura de caldo de sangue de +naBC e transfira-a para um tubo separador de soro (SST) após desinfetar o septo de borracha com álcool isopropílico a 70% (Figura 2A).
  3. Centrifugue esta alíquota por 10 min a 160 x g para depositar as células sanguíneas na mistura de caldo de sangue. Após a primeira centrifugação, observe o sobrenadante no qual as células sanguíneas se estabelecerão.
  4. Abra a tampa do frasco para injetáveis dentro de uma cabine de biossegurança e, usando uma ponta estéril e uma pipeta, remova cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para um novo frasco para injetáveis de coleta de sangue simples (tampa vermelha) removendo sua tampa.
  5. Coloque a tampa no frasco para injetáveis e centrifugue novamente por 10 min a 2000 x g. Após a segunda centrifugação, um pellet bacteriano se formará no fundo.
  6. Aspire o sobrenadante e descarte-o usando uma pipeta estéril e uma ponta. O pellet bacteriano permanecerá no fundo do tubo e será usado para inocular o cartão de identificação aMIAST.
    NOTA: Um tubo separador de soro foi usado na primeira centrifugação a 160 x g. Isso foi baseado em estudos feitos por Quesada et al.25 e Munoz-Davila et al.27, onde a primeira etapa de centrifugação foi feita aproximadamente a 30 x g e 60 x g, respectivamente. A mistura de caldo de sangue de um + aBC foi primeiro centrifugada em baixa velocidade em um SST para expulsar as células sanguíneas.
  7. Coloque um tubo de poliestireno aMIAST no suporte do tubo aMIAST e adicione 3 mL de solução salina estéril usando um dispensador conectado ao frasco de solução salina.
  8. Usando uma alça de inoculação estéril, retire o pellet bacteriano do fundo do frasco e inocule-o no tubo aMIAST
  9. Repita as etapas 1.7-1.14.

3. AST pelo protocolo EUCAST RAST4

  1. Mantenha as placas de ágar Mueller-Hinton (MHA) circulares de 90 mm não inoculadas prontas no gabinete de biossegurança.
  2. Use luvas estéreis e, dentro de um gabinete de biossegurança, limpe o septo de +naBC com um cotonete contendo álcool isopropílico 70%.
  3. Usando uma seringa estéril, aspire 125 μL ± 25 μL de mistura de caldo de sangue não diluído de + naBC e adicione a cada placa de MHA no centro.
  4. Espalhe o caldo suavemente sobre os pratos usando um cotonete estéril em três direções e aplique ≤ 6 discos antimicrobianos em cada prato.
  5. Incubar as placas numa incubadora aeróbica a 35 °C± 1 °C durante 8 h. Após a conclusão da incubação, observar a pureza do isolado.
  6. Leia as zonas de inibição às 8 h ± 5 min. Interprete os resultados usando a tabela de pontos de interrupção RAST para incubação curta após verificar os resultados de identificação bacteriana no aMIAST.
  7. Relate os resultados da AST somente se o isolado for identificado como um dos RR-GN e as placas MHA e CLED estiverem crescendo um único morfotipo.

4. Controle de qualidade

  1. Realize o controle de qualidade interno para o protocolo SIP do aMIAST de acordo com as instruções do fabricante, usando as cepas de referência recomendadas.
  2. Realizar o controlo interno da qualidade do método RAST semanalmente, utilizando a estirpe de referência recomendada de E. coli , conforme descrito abaixo.
    1. Disponha 4 tubos de vidro estéreis em um suporte para tubos. Dispense 3 mL de solução salina estéril no primeiro tubo e 990 μL de solução salina estéril em cada um dos segundo, terceiro e quarto tubos.
    2. Faça uma suspensão de 0,5 McFarland da cepa QC das colônias isoladas de uma cultura noturna em mídia revestida.
    3. Usando uma pipeta e ponta estéreis, transfira 10 μL de suspensão do primeiro tubo para o segundo tubo.
    4. Após a mistura, transferir 10 μL de suspensão do segundo para o terceiro tubo e, em seguida, para o último tubo.
    5. Do último tubo, pegue 1 mL do inóculo usando uma seringa estéril com uma agulha e adicione-o a um aBC não inoculado.
    6. Adicione simultaneamente 5 mL de sangue de ovelha estéril no aBC usando uma seringa estéril com uma agulha e incube-o no CBCMS até que dê positivo devido à mudança na cor do sensor de emulsão líquida na base do aBC.
    7. Repita as etapas conforme explicado nas etapas 1-3 para identificação por SIP, DIP e RAST, respectivamente. Os resultados esperados são que a deformação CQ deve ser identificada corretamente por ambos os protocolos de identificação do aMIAST e os diâmetros das zonas nas placas RAST devem estar dentro da faixa especificada28.

5. Análise estatística

  1. Considere a identificação microbiana usando SIP como padrão-ouro e se a mesma identificação for obtida por DIP, considere-a como concordante.
  2. Se um RR-GN, ou seja, um complexo de E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii identificado usando SIP for discordante no DIP, considere isso como erro maior (EM), enquanto considere o inverso como erro muito grande (VME), pois tem o potencial de emitir um relatório com identificação errada.
  3. Calcule a taxa de concordância para RR-GN como a razão entre o número total de RR-GN concordantes e o número total de RR-GN identificados pelo SIP multiplicado por 100.
  4. Calcule a taxa de EM como a razão entre o número de +naBCs identificados como tendo um não-RR-GN e o número total de +naBCs com RR-GN identificados pelo SIP multiplicado por 100.
  5. Calcule a taxa de VME como a razão entre o número de +naBCs identificados erroneamente como tendo um RR-GN em DIP e o número total. de +naBCs testados por DIP multiplicados por 100.
  6. Calcule o tempo para identificação do isolamento (TTI) como o tempo necessário para identificar o isolado por ambos os protocolos a partir do momento da sinalização da hemocultura pelo CBCMS.
  7. Calcule as diferenças entre o DIP e o SIP como uma redução no TTI. Calcule isso apenas para os +naBCs concordantes com um RR-GN. Observe os respectivos pontos de tempo dos relógios do CBCMS e do aMIAST.
  8. Gerencie dados e analise usando uma planilha. Utilizar o teste U de Mann-Whitney para variáveis contínuas, considerando um valor de p bilateral de ≤ 0,05 como estatisticamente significativo.

Resultados

Resultados gerais
Durante o período do estudo, 240 +naBCs foram identificados por aMIAST usando DIP e SIP. Destes, 15% (36/240) +naBCs foram considerados polimicrobianos após incubação noturna no meio plaqueado. Dos 204 +naBCs, a proporção de NR-GN identificada pelo SIP foi de 51,5% (105/204). Dentre eles, 47,6% (50/105) eram E. coli, 19% (20/105) K. pneumoniae, 8,6% (9/105) P. aeruginosa e 24,8% (26/105) complexo A. baumannii . Uma descrição detalhada de to...

Discussão

Usando o DIP, identificamos com sucesso os RR-GNs com considerável precisão diagnóstica. O TTI médio após sinalização positiva de aBC foi de apenas 507 min (~ 8,5 h). Assim, quando feito em conjunto com o método EUCAST RAST para determinação de AST, ele pode fornecer identificação isolada em 8 h de tempo de leitura de AST. Esta abordagem tem o potencial de implementar o método EUCAST RAST, evitando a necessidade de identificação baseada em espectrometria de massa. Isso é uma bênção para os ambientes de...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O estudo foi financiado pela bolsa de pesquisa interna concedida ao Dr. Ayush Gupta pela AIIMS Bhopal. Reconhecemos a contribuição dos técnicos de laboratório e médicos residentes que realizaram e leram os testes diligentemente durante o horário de rotina e emergência.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD035-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Amoxyclav disk (20/10 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD063-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Cefotaxime disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD295E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ceftazidime disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD062A-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ciprofloxacin disk (5 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD060-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD010-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Gentamicin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD016-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Imipenem disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD073-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Levofloxacin disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD216-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Meropenem disk 10 µg Himedia, Mumbai, IndiaSD727-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD292E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Tobramycin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD044-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
ATCC Escherichia coli 25922Microbiologics, Minnesota USA0335ARecommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France412CM8423Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, IndiaDFP-2/21-22/149For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2Himedia, Mumbai, IndiaM834-500GPreparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BLLaby Instruments, Ambala, IndiaHLL/2021-22/021Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser BrandTech, Essex CT, EnglandV1200Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar Himedia, Mumbai, IndiaM008-500GDifferential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, IndiaNJ478162Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India521020Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar Himedia, Mumbai, IndiaM173-500GAntimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4Himedia, Mumbai, IndiaLA019For streaking onto culture media
Nichrome straight wireHimedia, Mumbai, IndiaLA022For stab inoculation
Nulife sterile GlovesMRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, IndiaFor safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367815Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep bloodLabline Trading Co., Hyderabad, India70014Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367954Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)Himedia, Mumbai, IndiaPW005-1X500NOLawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/ccNihal Healthcare, Solan, India2213805NB2Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kitbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France422219Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceV1204Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France533306-4 REVStand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubesbioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceTubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceVKC15144Automated identification and AST system
VITEK-2 GN cardbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France21341Identification of Gram negative bacilli

Referências

  1. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990–2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  2. Ikuta, K. S., et al. Global mortality associated with 33 bacterial pathogens in 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 400 (10369), 2221-2248 (2022).
  3. Liu, V. X., et al. The timing of early antibiotics and hospital mortality in sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 196 (7), 856-863 (2017).
  4. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 4.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 33rd ed. CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2023).
  6. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2018).
  7. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2018).
  8. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 6.1. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  9. Soo, Y. T., Waled, S. N. M. B., Ng, S., Peh, Y. H., Chew, K. L. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (5), 993-998 (2020).
  10. Berinson, B., et al. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST): Analytical performance and impact on patient management. J Antimicrob Chemother. 76 (5), 1332-1338 (2021).
  11. Strubbe, G., Messiaen, A. S., Vandendriessche, S., Verhasselt, B., Boelens, J. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) compared to conventional susceptibility testing: implementation and potential added value in a tertiary hospital in Belgium. Acta Clinica Belgica: Int J Clin Lab Med. 78 (5), 385-391 (2023).
  12. Jasuja, J. K., Zimmermann, S., Burckhardt, I. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) for positive blood cultures in clinical practice using a total lab automation. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (7), 1305-1313 (2020).
  13. Martins, A., et al. Rapid antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae by disk diffusion directly from blood culture bottles using the EUCAST RAST breakpoints. J Glob Antimicrob Resist. 22, 637-642 (2020).
  14. Ekwall-Larson, A., Fröding, I., Mert, B., Åkerlund, A., Özenci, V. Analytical performance and potential clinical utility of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing in blood cultures after four hours of incubation. Microbiol Spectr. 11 (2), e500122 (2023).
  15. Cerrudo, V., et al. Usefulness of EUCAST rapid antibiotic susceptibility breakpoints and screening cut-off values directly from blood cultures for the inference of β-lactam resistance mechanisms in Enterobacterales. JAC-Antimicrob Resist. 5 (1), 017 (2023).
  16. Shan, Y., et al. Evaluation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test for enterobacterales-containing blood cultures in China. J Clin Microbiol. 60 (4), e0255921 (2022).
  17. Jonasson, E., Matuschek, E., Kahlmeter, G. The EUCAST rapid disc diffusion method for antimicrobial susceptibility testing directly from positive blood culture bottles. J Antimicrob Chemother. 75 (4), 968-978 (2020).
  18. Tayşi, M. R., et al. Implementation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test (RAST) directly from positive blood culture bottles without the advanced identification systems. J Antimicrobial Chemotherapy. 77 (4), 1020-1026 (2022).
  19. Gupta, A., et al. A prospective study evaluating the effect of a ‘Diagnostic Stewardship Care-Bundle’ for automated blood culture diagnostics. J Glob Antimicrob Resist. 34, 119-126 (2023).
  20. Siddiqui, F., Gupta, A., Purwar, S., Saigal, S., Sharma, J. P. A prospective study to reduce turnaround time of microbiologically positive blood cultures in patients with sepsis in intensive care unit. Indian J Med Microbiol. 40 (4), 541-546 (2022).
  21. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiol Infect Dis. 72 (1), 20-31 (2012).
  22. Lemos, T. C., Cogo, L. L., Maestri, A. C., Hadad, M., Nogueira, K. d. a. S. Is it possible to perform bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing with a positive blood culture bottle for quick diagnosis of bloodstream infections. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 51 (2), 215-218 (2018).
  23. Funke, G., Funke-Kissling, P. Use of the BD PHOENIX automated microbiology system for direct identification and susceptibility testing of gram-negative rods from positive blood cultures in a three-phase trial. J Clin Microbiol. 42 (4), 1466-1470 (2004).
  24. Nimer, N. A., Al-Saa’da, R. J., Abuelaish, O. Accuracy of the VITEK 2 system for a rapid and direct identification and susceptibility testing of Gram negative rods and Gram-positive cocci in blood samples. East Mediterr Health J. 22 (3), 193-200 (2016).
  25. Quesada, M. D., et al. Performance of VITEK-2 Compact and overnight MicroScan panels for direct identification and susceptibility testing of Gram-negative bacilli from positive FAN BacT/ALERT blood culture bottles. Clin Microbiol Infect. 16 (2), 137-140 (2010).
  26. De Cueto, M., Ceballos, E., Martinez-Martinez, L., Perea, E. J., Pascual, A. Use of positive blood cultures for direct identification and susceptibility testing with the Vitek 2 system. J Clin Microbiol. 42 (8), 3734-3738 (2004).
  27. Munoz-Dávila, M. J., Yagüe, G., Albert, M., García-Lucas, T. Comparative evaluation of Vitek 2 identification and susceptibility testing of Gram-negative rods directly and isolated from BacT/ALERT-positive blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 31 (5), 663-669 (2012).
  28. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Quality control criteria for the implementation of the RAST method. Version 6.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  29. Chen, J. R., Lee, S. Y., Yang, B. H., Lu, J. J. Rapid identification and susceptibility testing using the VITEK 2 system using culture fluids from positive BacT/ALERT blood cultures. J Microbiol, Immunol Infect. 41 (3), 259-264 (2008).
  30. Bruins, M. J., Bloembergen, P., Ruijs, G. J. H. M., Wolfhagen, M. J. H. M. Identification and susceptibility testing of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa by direct inoculation from positive BACTEC blood culture bottles into Vitek 2. J Clin Microbiol. 42 (1), 7-11 (2004).
  31. Lupetti, A., Barnini, S., Castagna, B., Nibbering, P. H., Campa, M. Rapid identification and antimicrobial susceptibility testing of Gram-positive cocci in blood cultures by direct inoculation into the BD Phoenix system. Clin Microbiol Infect. 16 (7), 986-991 (2010).
  32. Barreales, A., Lara, M., Hernández, I., Díez, O. Rapid identification and susceptibility testing of Gram-positive cocci in BacT/ALERT blood cultures by direct inoculation into the Vitek 2 system. Rev Esp Quimioter. 24 (3), 131-135 (2011).

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