Kütle Spektrometresi Olmadan EUCAST RAST Yöntemini Kolaylaştırmak için Otomatik Bir Mikrobiyal Tanımlama Sistemi Kullanarak Doğrudan Mikrobiyal Tanımlama

Özet

EUCAST, otomatik kan kültürleri için doğrudan bir antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) protokolü geliştirmiştir. Bununla birlikte, kütle spektrometresi tabanlı mikrobiyal tanımlamaya bağımlılığı, otomatik bir mikrobiyal tanımlama sisteminde doğrudan bir aşı hazırlama protokolü kullanılarak ortadan kaldırılabilir. Bu yaklaşım, numune alındıktan sonraki 24 saat içinde AST raporları sağlayabilir.

Özet

Gram-negatif (GN) sepsis, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda yönetimin konvansiyonel mikrobiyolojik kültür tekniklerine dayandığı ve 3-4 gün içinde sonuç veren tıbbi bir acil durumdur. Geri dönüş süresindeki (TAT) bu gecikmeyi kabul eden hem EUCAST hem de CLSI, AST sonuçlarını doğrudan pozitif işaretli otomatik kan kültürü şişelerinden (+aBC'ler) belirlemek için protokoller geliştirmiştir. EUCAST hızlı AST (RAST) protokolü ilk olarak 2018 yılında tanıtılmış olup, GN sepsisinin dört yaygın etiyolojik ajanı olan Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter baumannii kompleksi için bölge çapı kırılma noktaları bildirilebilir. Bununla birlikte, bu yöntemi rutin iş akışlarında uygulayan klinik laboratuvarlar, kolayca bulunamayan kütle spektrometresi tabanlı mikrobiyal tanımlamaya güvenir ve bu nedenle kaynak sınırlı ortamlarda uygulanmasını engeller. Bunu aşmak için, aBC'nin pozitif olarak işaretlenmesinden sonraki 8 saat içinde erken mikrobiyal tanımlamayı sağlamak için ticari bir otomatik mikrobiyal tanımlama ve antimikrobiyal duyarlılık test sistemi (aMIAST) kullanarak bir doğrudan aşılama protokolünü (DIP) değerlendirdik. Bu protokolü Ocak-Ekim 2023 tarihleri arasında, pozitif olarak işaretlenmiş aBC'deki dört RAST raporlanabilir GN'YI (RR-GN) belirlemek için değerlendirdik. DIP'deki mikrobiyal tanımlama sonuçları, aMIAST'taki standart inokulum hazırlama protokolü (SIP) ile karşılaştırıldı. Monomorfik GN'ye (+naBC) sahip 204 +aBC'den 4 RR-GN'den biri 105 +naBC'de SIP ile tanımlanmıştır (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 ve A. baumannii kompleksi: 26). Bunların %94'ü (98/105) DIP ile doğru bir şekilde tanımlanırken, majör hata ve çok majör hata oranları sırasıyla %6 (7/105) ve %1,7 (4/240) idi. Mikrobiyal tanımlama için DIP, EUCAST RAST yöntemi kullanılarak yapıldığında, numunenin alınmasından sonraki 24 saat içinde geçici klinik raporlar sağlanabilir. Bu yaklaşım, TAT'ı önemli ölçüde azaltma potansiyeline sahiptir ve uygun antimikrobiyal tedavinin erken kurulmasını sağlar.

Giriş

Önemli bir küresel sağlık sorunu olan sepsis, enfeksiyona karşı bozulmuş bir konak yanıtına bağlı olarak yaşamı tehdit eden organ fonksiyon bozukluğu olarak tanımlanır. Küresel Hastalık Yükü Çalışması, 2017 yılında dünya çapında 48,9 milyon sepsis vakası ve 11 milyon sepsis ile ilişkili ölüm olduğunu ve bunun tüm küresel ölümlerin neredeyse %20'sini oluşturduğunu tahmin etmektedir¹. Mortaliteye^neden olan kan dolaşımı enfeksiyonlarının (KSE) yaklaşık 2/3'ü gram negatif bakteriyel patojenlere bağlıdır². Gram negatifler (GN) arasında önde gelen mortalite nedenleri, 33 bakteriyel patojen arasındaki vakaların yakla....

Protokol

AIIMS Bhopal tarafından Dr. Ayush Gupta'ya verilen intramural araştırma hibesi ile finanse edilen çalışma, Kurumsal İnsan Etik Komitesi (IHEC) tarafından vide letter no: IHEC- LOP/2022/IL072 tarafından onaylandı.

NOT: Quesada ve ^ark.25 ve Munoz-Davila ve ^ark.27 tarafından yapılan çalışmalara dayanarak 5 ml'lik bir numune hacmi kullanılmıştır.

1. aMIAST kullanarak bakteri tanımlaması için standart aşı protokolü (SIP)

1. Temiz eldivenler giyin ve Sınıf-IIa biyogüvenlik kabini (BSC) içinde +naBC septumunu %70 izopropil alkol içeren bir çubukla d....

Tartışmalar

DIP kullanarak, RR-GN'leri önemli bir tanısal doğrulukla başarıyla tanımladık. aBC'nin pozitif işaretlenmesinden sonra ortalama TTI sadece 507 dakika (~ 8.5 saat) idi. Bu nedenle, AST tayini için EUCAST RAST yöntemi ile birlikte yapıldığında, 8 saatlik AST okuma süresinde izolat tanımlaması verebilir. Bu yaklaşım, kütle spektrometresi tabanlı tanımlama ihtiyacını ortadan kaldıran EUCAST RAST yöntemini uygulama potansiyeline sahiptir. Bu, klinik raporlama süresini kısaltmak ve uygulanmasının .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli