JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

EUCAST, otomatik kan kültürleri için doğrudan bir antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) protokolü geliştirmiştir. Bununla birlikte, kütle spektrometresi tabanlı mikrobiyal tanımlamaya bağımlılığı, otomatik bir mikrobiyal tanımlama sisteminde doğrudan bir aşı hazırlama protokolü kullanılarak ortadan kaldırılabilir. Bu yaklaşım, numune alındıktan sonraki 24 saat içinde AST raporları sağlayabilir.

Özet

Gram-negatif (GN) sepsis, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda yönetimin konvansiyonel mikrobiyolojik kültür tekniklerine dayandığı ve 3-4 gün içinde sonuç veren tıbbi bir acil durumdur. Geri dönüş süresindeki (TAT) bu gecikmeyi kabul eden hem EUCAST hem de CLSI, AST sonuçlarını doğrudan pozitif işaretli otomatik kan kültürü şişelerinden (+aBC'ler) belirlemek için protokoller geliştirmiştir. EUCAST hızlı AST (RAST) protokolü ilk olarak 2018 yılında tanıtılmış olup, GN sepsisinin dört yaygın etiyolojik ajanı olan Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter baumannii kompleksi için bölge çapı kırılma noktaları bildirilebilir. Bununla birlikte, bu yöntemi rutin iş akışlarında uygulayan klinik laboratuvarlar, kolayca bulunamayan kütle spektrometresi tabanlı mikrobiyal tanımlamaya güvenir ve bu nedenle kaynak sınırlı ortamlarda uygulanmasını engeller. Bunu aşmak için, aBC'nin pozitif olarak işaretlenmesinden sonraki 8 saat içinde erken mikrobiyal tanımlamayı sağlamak için ticari bir otomatik mikrobiyal tanımlama ve antimikrobiyal duyarlılık test sistemi (aMIAST) kullanarak bir doğrudan aşılama protokolünü (DIP) değerlendirdik. Bu protokolü Ocak-Ekim 2023 tarihleri arasında, pozitif olarak işaretlenmiş aBC'deki dört RAST raporlanabilir GN'YI (RR-GN) belirlemek için değerlendirdik. DIP'deki mikrobiyal tanımlama sonuçları, aMIAST'taki standart inokulum hazırlama protokolü (SIP) ile karşılaştırıldı. Monomorfik GN'ye (+naBC) sahip 204 +aBC'den 4 RR-GN'den biri 105 +naBC'de SIP ile tanımlanmıştır (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 ve A. baumannii kompleksi: 26). Bunların %94'ü (98/105) DIP ile doğru bir şekilde tanımlanırken, majör hata ve çok majör hata oranları sırasıyla %6 (7/105) ve %1,7 (4/240) idi. Mikrobiyal tanımlama için DIP, EUCAST RAST yöntemi kullanılarak yapıldığında, numunenin alınmasından sonraki 24 saat içinde geçici klinik raporlar sağlanabilir. Bu yaklaşım, TAT'ı önemli ölçüde azaltma potansiyeline sahiptir ve uygun antimikrobiyal tedavinin erken kurulmasını sağlar.

Giriş

Önemli bir küresel sağlık sorunu olan sepsis, enfeksiyona karşı bozulmuş bir konak yanıtına bağlı olarak yaşamı tehdit eden organ fonksiyon bozukluğu olarak tanımlanır. Küresel Hastalık Yükü Çalışması, 2017 yılında dünya çapında 48,9 milyon sepsis vakası ve 11 milyon sepsis ile ilişkili ölüm olduğunu ve bunun tüm küresel ölümlerin neredeyse %20'sini oluşturduğunu tahmin etmektedir1. Mortaliteyeneden olan kan dolaşımı enfeksiyonlarının (KSE) yaklaşık 2/3'ü gram negatif bakteriyel patojenlere bağlıdır2. Gram negatifler (GN) arasında önde gelen mortalite nedenleri, 33 bakteriyel patojen arasındaki vakaların yaklaşık %40'ını oluşturan Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter baumannii'dir 2.

Kan kültürleri, KSE'nin teşhisi için altın standart olmaya devam etmektedir ve antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) sonuçları ile birlikte hızlı mikrobiyal tanımlama, yönetimin anahtarıdır. Sepsis3'te uygun antimikrobiyallerin uygulanmasında her bir saatlik gecikme ile mortalite oranlarında %9'luk bir artış olduğu tahmin edilmektedir. AST sonuçları ile mikrobiyolojik olarak pozitif kan kültürü raporlarının geri dönüş süresi (TAT), otomatik sistemlerde bile, kaynak sınırlı ortamlarda mevcut mikrobiyolojik araçlarla yaklaşık 48-72 saattir. Bu ortalamanın altındaki TAT'ın bir sonucu olarak, geniş spektrumlu antimikrobiyaller ampirik olarak kullanılır ve bu da gelişmekte olan antimikrobiyal direnç (AMR) sorununa katkıda bulunur. Sepsis için mikrobiyolojik kültür teknikleri için TAT'ı azaltmaya yönelik bu ciddi ihtiyacı kabul eden EUCAST ve CLSI, AST'yi doğrudan pozitif işaretli kan kültürü şişelerinden (+aBC)4,5 gerçekleştirmeye doğru ilerliyor.

2018'de EUCAST, ilk olarak Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemiyle kısa inkübasyon sürelerinde, yani 4 saat, 6 saat ve 8 saat, doğrudan + aBC 6,7'den AST'yi belirlemek için hızlı AST (RAST) yöntemini tanıttı. Yöntem şu anda, gram negatifler arasında BSI'nin en yaygın 8 nedeninden biri olan E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa ve A. baumannii kompleksini içeren + aBC'ler için AST belirlemek için ve gram pozitifler arasında Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium ve Streptococcus pneumoniae 8. Çeşitli zaman aralıklarında AST tayini için kesme noktaları, yukarıda listelenen mikrobiyal türlere göre sağlanır. Bu nedenle, AST sonuçlarının kategorik olarak yorumlanmasından önce, mikrobiyal tanımlama gereklidir. Bununla birlikte, RAST standardı, bu zaman çerçevesi içinde mikrobiyal tanımlamayı sağlayacak yöntemi belirtmez.

EUCAST RAST yöntemini kendi ortamlarında değerlendiren çalışmaların çoğu, mikroorganizmaları tanımlamak için kaplanmış ortam üzerinde kısa bir inkübasyondan sonra kütle spektrometresi tabanlı mikrobiyal tanımlamakullanmıştır 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Bununla birlikte, kütle spektrometresi cihazları, özellikle düşük ila orta gelirli ülkelerde (LMIC'ler) yaygın olarak mevcut değildir ve bu da bu yöntemin potansiyel kullanışlılığını büyük ölçüde sınırlar. Az sayıda çalışma, bu yöntemin merkezlerinde kütle spektrometresikullanılmadan uygulandığını bildirmiştir 18,19,20. Tayşi ve ark.18, AST sonuçlarını yorumlamadan önce gram boyama morfolojisi ve oksidaz testine dayanarak Enterobacterales, Pseudomonas ve Acinetobacter spp. arasında geniş bir GN kategorizasyonu bildirmişlerdir. Bu merkezden Gupta ve ark.19 ve Siddiqui ve ark.20 tarafından yapılan diğer çalışmalarda, pozitif olarak işaretlenmiş kan suyu karışımından bir bakteri peleti hazırlanarak ve geleneksel biyokimyasal testlere aşılanarak tür düzeyinde mikrobiyal tanımlama yapıldı. Tayşi ve ark.18 yaklaşımları ile mikrobiyal tanımlamanın doğruluğu hakkında yorum yapmazken, Gupta ve ark.19 165/176 (%94) olguda yaklaşımları ile RAST raporlanabilir gram-negatif (RR-GN), yani E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa ve A. baumannii'den herhangi biri olduğunu bildirmişlerdirkarmaşık. Bununla birlikte, ikinci yaklaşımla, RAST sonuçlarının okunması, yalnızca geleneksel biyokimyasal sonuçların tam inkübasyonundan sonra, yani aşılamadan 18-24 saat sonra, 8 saatlik bölge çapı kırılma noktaları kullanılarak geriye dönük olarak yapıldı ve raporlama için ortalama süre yaklaşık 2 gündü.

Klinik raporların TAT'sini daha da azaltmak için, aMIAST kullanarak +aBC'lerde bulunan GN'nin erken tanımlanmasını sağlamak için alternatif bir metodoloji öneriyoruz. Kütle spektrometresi tabanlı mikrobiyal tanımlama sistemlerinin piyasaya sürülmesinden önce, bu otomatik tanımlama sistemleri, tanımlamanın, bir kasette barındırılan minyatür biyokimyasal testlerde aşılandığında test bakterileri tarafından indüklenen kolorimetrik ve/veya florometrik değişikliklerle sağlandığı mikrobiyal tanımlama için bakım standardı olarak kabul edildi ve sonuçları izolat veri tabanlarıyla eşleştirdi. Bu sistemlerde tanımlama için ortalama süre 4 saat ila 8 saat civarındadır, ancak üreticilerin, ilgili kimlik kartları aşılanmadan önce mikropların gece boyunca büyümesini önermeleri gerçeğiyle sınırlıdır. Bu gereklilik, raporlama süresini kısaltmadaki kullanışlılıklarını büyük ölçüde sınırlar.

Bu otomatik sistemleri kullanarak +aBC'lerden mikropları doğrudan tanımlama yöntemlerini değerlendiren az sayıda çalışmavardır 21,22,23,24,25,26,27. Monomorfik GN içeren +aBC'ler söz konusu olduğunda, çalışmaların çoğu, pozitif kan suyu karışımından yapılan bakteri peletinden doğrudan inokülasyon ile standart koloni inkübasyonu arasında mükemmel bir uyum göstermiştir. Bununla birlikte, gram pozitifler söz konusu olduğunda, uyum oranları optimalin altındaydı. +aBC'lerin pozitifliğe kadar ortalama süresi 8 saat ile 16 saat arasında olduğundan ve GN'nin tanımlanması otomatik bir mikrobiyal tanımlama sisteminde ~ 4 saat ila 8 saat sürdüğünden, otomatik mikrobiyal tanımlamada doğrudan aşılama protokolünü kullanarak, numune alındıktan sonraki 24 saat içinde RR-GN'ye sahip GN ile +aBC'lerin klinik raporlamasını tamamlayabileceğimizi varsayıyoruz.

Çalışma için ayar
Bu çalışma, Ocak-Ekim 2023 tarihleri arasında Orta Hindistan'da 950 yataklı, akademik, ulusal öneme sahip üçüncü basamak bir bakım enstitüsünün (INI) klinik bakteriyoloji laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. Laboratuvar, sürekli kan kültürü izleme sistemi (CBCMS) ve aMIAST ile donatılmıştır. Bakteriyoloji laboratuvarı, pozitif işaretli kan kültürü şişelerini (+aBC'ler) işlemek ve raporlamak için teknisyenlerin ve mikrobiyologların mevcudiyeti ile günün her saati işlevseldir.

Burada kullanılan mikrobiyal yöntemler
Etüdün iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Monomorfik GN'leri (+naBC) gösteren +aBC'ler, EUCAST RAST protokolü kullanılarak tanımlama ve AST'yi mümkün kılmak için karşılık gelen tanımlama kartlarının doğrudan aşılanmasıyla işlendi. Bu sonuçlar, + aBC'ler için bakım standardı (SoC) yöntemi ile karşılaştırıldı, yani koyun kanı agar (SBA), çikolata agar (CA) ve MacConkey agar (MA) yoluyla geleneksel kaplamalı ortamda alt kültürleme, 16 saat ila 24 saat boyunca aerobik olarak inkübe edildi ve ardından izole koloniler ortaya çıktığında aMIAST tarafından verilen tanımlama ve AST kartları geldi. Gram pozitif koklar, gram pozitif basiller, tomurcuklanan maya hücreleri ve ≥2 farklı mikroorganizmayı başlangıç gram boyama veya kaplama besiyeri üzerinde gösteren kan kültürleri çalışma dışı bırakıldı.

Protokol

AIIMS Bhopal tarafından Dr. Ayush Gupta'ya verilen intramural araştırma hibesi ile finanse edilen çalışma, Kurumsal İnsan Etik Komitesi (IHEC) tarafından vide letter no: IHEC- LOP/2022/IL072 tarafından onaylandı.

NOT: Quesada ve ark.25 ve Munoz-Davila ve ark.27 tarafından yapılan çalışmalara dayanarak 5 ml'lik bir numune hacmi kullanılmıştır.

1. aMIAST kullanarak bakteri tanımlaması için standart aşı protokolü (SIP)

  1. Temiz eldivenler giyin ve Sınıf-IIa biyogüvenlik kabini (BSC) içinde +naBC septumunu %70 izopropil alkol içeren bir çubukla dezenfekte edin.
  2. 21 G iğneli steril bir şırınga kullanarak yaklaşık 1 mL kan suyu karışımı çizin.
  3. İğneden 1 büyük damla kan suyu karışımını kaplanmış ortamın yüzeyine, yani SBA, CA ve MA'ya dağıtın. Plakaları çizin ve kültür plakalarını aerobik koşullar altında 37 °C ± 2 °C'de 18-24 saat inkübatörde inkübe edin.
  4. İnkübasyondan sonra, bir BSC'de izole edilmiş kolonilerin görünümü için plakaları inceleyin ve aMIAST tarafından tanımlama ve AST için daha fazla ilerleyin.
  5. Her izolat için, aMIAST tüp standına bir aMIAST polistiren tüpü yerleştirin ve salin şişesine bağlı bir dağıtıcı kullanarak içine 3 mL steril salin ekleyin.
  6. Steril bir düz aşılama teli ile morfolojik olarak benzer üç ila beş koloniye dokunun ve bakteri aşısını ilk tüpe aktarın.
  7. Bir dansitometre kullanarak aşılanmış tüpte 0.47-0.63 McFarland arasında steril salin kullanarak bulanıklığı ayarlayın.
  8. Gram negatif aMIAST kimlik kartının kılcal ekini ilk tüpe yerleştirin.
  9. Seçilen kartları kaset üzerinde uygun bir konuma yerleştirin. Kasetteki aşı hazırdır ve doldurma bölümündeki aMIAST'a gelir.
    DİKKAT: Kartları aşılamadan önce askıya alma yaşı 30 dakikayı geçmemelidir.
  10. Kaseti, numune barkodu içeriye bakacak şekilde doldurma haznesindeki konumuna yükleyin.
  11. Kapıyı kapatın ve Kullanıcı Arayüzü Ekranında Doldur'a basın. Doldurma 70 s'lik bir döngüdür. Döngü tamamlandığında, sistemdeki mavi gösterge ışığı yanıp sönecektir. Kartların aMIAST sistemine yerleştirilmesi, aşılamanın makine tarafından kartların küçük odacıklarına dağıtılmasını sağlar.
  12. Kaseti doldurma haznesinden çıkarın, kapıyı kapatın ve yükleme haznesine yerleştirin. Barkodlar otomatik olarak taranır ve sanal kaset elektronik çalışma listesinin korunmasına göre kontrol edilir. Pipetler otomatik olarak mühürlenir ve kartlar otomatik olarak atlıkarıncaya yüklenir. AMIAST üzerinde yanıp sönen mavi ok, yüklemenin tamamlandığını gösterir.
  13. İşiniz bittiğinde kaset atıklarını çıkarın. Ürün literatüründeki atık bertaraf prosedürüne bakın veya diğer standart uygulamaları takip edin. İzolatların saflık kontrolü için tüplerdeki süspansiyonun geri kalanını CLED agar üzerinde alt kültüre kullanın.
  14. Cihaz analizi tamamladıktan sonra sonuçları okuyun.

2. aMIAST kullanarak bakteri tanımlaması için doğrudan aşılama protokolü (DIP)

  1. Steril eldiven giyin ve bir biyogüvenlik kabini içinde +naBC septumunu %70 izopropil alkol içeren bir çubukla temizleyin.
  2. 21 G iğneli steril bir şırınga kullanarak, + naBC'nin kan suyu karışımından 5 mL alikot alın ve kauçuk septumu %70 izopropil alkol ile dezenfekte ettikten sonra bir serum ayırıcı tüpe (SST) aktarın (Şekil 2A).
  3. Kan suyu karışımındaki kan hücrelerini yerleştirmek için bu alikotu 160 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. İlk santrifüjlemeden sonra, kan hücrelerinin yerleşeceği süpernatanı gözlemleyin.
  4. Bir biyogüvenlik kabini içindeki şişenin kapağını açın ve steril bir uç ve pipet kullanarak, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve üst kısmını çıkararak yeni bir düz kan alma şişesine (kırmızı üst) aktarın.
  5. Kapağı şişenin üzerine yerleştirin ve 2000 x g'da 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. İkinci santrifüjlemeden sonra, altta bir bakteri peleti oluşacaktır.
  6. Süpernatanı aspire edin ve steril bir pipet ve uç kullanarak atın. Bakteri peleti tüpün dibinde kalacak ve aMIAST kimlik kartını aşılamak için kullanılacaktır.
    NOT: İlk santrifüjlemede 160 x g'da bir serum ayırıcı tüp kullanılmıştır. Bu, Quesada ve ark.25 ve Munoz-Davila ve ark.27 tarafından yapılan ve ilk santrifüjleme adımının sırasıyla yaklaşık 30 x g ve 60 x g'da yapıldığı çalışmalara dayanıyordu. Bir + aBC'den elde edilen kan suyu karışımı, kan hücrelerini dışarı atmak için önce bir SST'de düşük hızda santrifüjlendi.
  7. AMIAST tüp standına bir aMIAST polistiren tüpü yerleştirin ve salin şişesine bağlı bir dağıtıcı kullanarak içine 3 mL steril salin ekleyin.
  8. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, bakteri peletini şişenin altından alın ve aMIAST tüpüne aşılayın
  9. 1.7-1.14 adımlarını tekrarlayın.

3. EUCAST RAST protokolü 4 ile AST

  1. Aşılanmamış 90 mm dairesel Mueller-Hinton agar (MHA) plakalarını biyogüvenlik kabininde hazır bulundurunuz.
  2. Steril eldiven giyin ve bir biyogüvenlik kabini içinde +naBC septumunu %70 izopropil alkol içeren bir çubukla temizleyin.
  3. Steril bir şırınga kullanarak, + naBC'den 125 μL ± 25 μL seyreltilmemiş kan suyu karışımını aspire edin ve merkezdeki her MHA plakasına ekleyin.
  4. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak et suyunu üç yönde plakaların üzerine nazikçe yayın ve her plakaya ≤ 6 antimikrobiyal disk uygulayın.
  5. Plakaları aerobik bir inkübatörde 35 °C± 1 °C'de 8 saat inkübe edin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, izolatın saflığını gözlemleyin.
  6. İnhibisyon bölgelerini 8 saat ± 5 dakikada okuyun. AMIAST'ta bakteri tanımlama sonuçlarını kontrol ettikten sonra kısa inkübasyon için RAST kesme noktası tablosunu kullanarak sonuçları yorumlayın.
  7. AST sonuçlarını, yalnızca izolat RR-GN'den biri olarak tanımlanırsa ve MHA ve CLED plakaları tek bir morfotip oluşturuyorsa rapor edin.

4. Kalite kontrol

  1. Önerilen referans suşları kullanarak üreticinin talimatlarına göre aMIAST'ın SIP protokolü için dahili kalite kontrolünü gerçekleştirin.
  2. Aşağıda açıklandığı gibi önerilen referans E. coli suşunu kullanarak RAST yönteminin dahili kalite kontrolünü haftalık olarak gerçekleştirin.
    1. Bir tüp standına 4 steril cam tüp yerleştirin. İlk tüpe 3 mL steril salin ve ikinci, üçüncü ve dördüncü tüplerin her birine 990 μL steril salin dağıtın.
    2. Kaplanmış ortam üzerinde bir gece boyunca bir kültürün izole edilmiş kolonilerinden QC suşunun 0.5 McFarland süspansiyonunu yapın.
    3. Steril bir pipet ve uç kullanarak, birinci tüpten ikinci tüpe 10 μL süspansiyon aktarın.
    4. Karıştırdıktan sonra, 10 μL süspansiyonu ikinci tüpten üçüncü tüpe ve daha sonra son tüpe aktarın.
    5. Son tüpten, bir iğne ile steril bir şırınga kullanarak 1 mL aşı alın ve aşılanmamış bir aBC'ye ekleyin.
    6. Bir iğne ile steril bir şırınga kullanarak aBC'ye aynı anda 5 mL steril koyun kanı ekleyin ve aBC'nin tabanındaki sıvı emülsiyon sensörünün rengindeki değişiklik nedeniyle pozitif olarak işaretlenene kadar CBCMS'de inkübe edin.
    7. Sırasıyla SIP, DIP ve RAST ile tanımlama için 1-3 arasındaki adımları tekrarlayın. Beklenen sonuçlar, QC suşunun aMIAST'ın her iki tanımlama protokolü tarafından doğru bir şekilde tanımlanması ve RAST plakalarındaki bölge çaplarının belirtilen aralık28 içinde olması gerektiğidir.

5. İstatistiksel analiz

  1. SIP'yi altın standart olarak kullanarak mikrobiyal tanımlamayı düşünün ve aynı tanımlama DIP ile elde edilirse, bunu uyumlu olarak kabul edin.
  2. SIP kullanılarak tanımlanan bir RR-GN, yani E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa ve A. baumannii komplekslerinden biri DIP'de uyumsuzsa, bunu Büyük hata (ME) olarak kabul edin, tersini ise çok büyük hata (VME) olarak kabul edin, çünkü yanlış tanımlama ile bir rapor düzenleme potansiyeline sahiptir.
  3. RR-GN için uyum oranını, toplam uyumlu RR-GN sayısının SIP tarafından tanımlanan toplam RR-GN sayısına oranının 100 ile çarpımı olarak hesaplayın.
  4. ME oranını, RR-GN olmayan olarak tanımlanan +naBC'lerin sayısının, SIP ile tanımlanan RR-GN'li toplam +naBC sayısına oranının 100 ile çarpımı olarak hesaplayın.
  5. VME oranını, DIP'de bir RR-GN'ye sahip olarak yanlış tanımlanan +naBC'lerin sayısının toplam no'ya oranı olarak hesaplayın. DIP ile test edilen +naBC'lerin 100 ile çarpılması.
  6. Tanımlama süresini (TTI), CBCMS tarafından kan kültürü işaretleme zamanından itibaren her iki protokol tarafından izolatı tanımlamak için geçen süre olarak hesaplayın.
  7. TTI'da bir azalma olarak DIP ve SIP arasındaki farkları hesaplayın. Bunu yalnızca bir RR-GN'ye sahip uyumlu +naBC'ler için hesaplayın. CBCMS ve aMIAST saatlerinden ilgili zaman noktalarını not edin.
  8. Bir elektronik tablo kullanarak verileri yönetin ve analiz edin. Sürekli değişkenler için Mann-Whitney U testini kullanın ve ≤ 0.05'lik iki taraflı p değerini istatistiksel olarak anlamlı kabul edin.

Sonuçlar

Genel sonuçlar
Çalışma süresi boyunca, 240 + naBC, hem DIP hem de SIP kullanılarak aMIAST tarafından tanımlandı. Bunların% 15'inin (36/240) + naBC'lerin kaplanmış ortam üzerinde gece boyunca inkübe edildikten sonra polimikrobiyal olduğu bulundu. 204 +naBC'den SIP ile tanımlanan RR-GN oranı %51.5 (105/204) idi. Bunların %47.6'sı (50/105) E. coli, %19'u (20/105) K. pneumoniae, %8.6'sı (9/105) P. aeruginosa ve %24.8'i (26/105) A. baumannii kompleksi...

Tartışmalar

DIP kullanarak, RR-GN'leri önemli bir tanısal doğrulukla başarıyla tanımladık. aBC'nin pozitif işaretlenmesinden sonra ortalama TTI sadece 507 dakika (~ 8.5 saat) idi. Bu nedenle, AST tayini için EUCAST RAST yöntemi ile birlikte yapıldığında, 8 saatlik AST okuma süresinde izolat tanımlaması verebilir. Bu yaklaşım, kütle spektrometresi tabanlı tanımlama ihtiyacını ortadan kaldıran EUCAST RAST yöntemini uygulama potansiyeline sahiptir. Bu, klinik raporlama süresini kısaltmak ve uygulanmasının ...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Çalışma, AIIMS Bhopal tarafından Dr. Ayush Gupta'ya verilen intramural araştırma hibesi ile finanse edildi. Rutin ve acil durum saatlerinde testleri özenle gerçekleştiren ve okuyan laboratuvar teknisyenlerinin ve asistan doktorların katkılarını takdir ediyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD035-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Amoxyclav disk (20/10 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD063-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Cefotaxime disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD295E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ceftazidime disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD062A-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ciprofloxacin disk (5 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD060-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD010-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Gentamicin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD016-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Imipenem disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD073-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Levofloxacin disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD216-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Meropenem disk 10 µg Himedia, Mumbai, IndiaSD727-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD292E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Tobramycin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD044-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
ATCC Escherichia coli 25922Microbiologics, Minnesota USA0335ARecommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France412CM8423Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, IndiaDFP-2/21-22/149For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2Himedia, Mumbai, IndiaM834-500GPreparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BLLaby Instruments, Ambala, IndiaHLL/2021-22/021Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser BrandTech, Essex CT, EnglandV1200Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar Himedia, Mumbai, IndiaM008-500GDifferential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, IndiaNJ478162Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India521020Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar Himedia, Mumbai, IndiaM173-500GAntimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4Himedia, Mumbai, IndiaLA019For streaking onto culture media
Nichrome straight wireHimedia, Mumbai, IndiaLA022For stab inoculation
Nulife sterile GlovesMRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, IndiaFor safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367815Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep bloodLabline Trading Co., Hyderabad, India70014Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367954Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)Himedia, Mumbai, IndiaPW005-1X500NOLawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/ccNihal Healthcare, Solan, India2213805NB2Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kitbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France422219Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceV1204Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France533306-4 REVStand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubesbioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceTubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceVKC15144Automated identification and AST system
VITEK-2 GN cardbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France21341Identification of Gram negative bacilli

Referanslar

  1. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990–2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  2. Ikuta, K. S., et al. Global mortality associated with 33 bacterial pathogens in 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 400 (10369), 2221-2248 (2022).
  3. Liu, V. X., et al. The timing of early antibiotics and hospital mortality in sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 196 (7), 856-863 (2017).
  4. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 4.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 33rd ed. CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2023).
  6. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2018).
  7. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2018).
  8. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 6.1. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  9. Soo, Y. T., Waled, S. N. M. B., Ng, S., Peh, Y. H., Chew, K. L. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (5), 993-998 (2020).
  10. Berinson, B., et al. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST): Analytical performance and impact on patient management. J Antimicrob Chemother. 76 (5), 1332-1338 (2021).
  11. Strubbe, G., Messiaen, A. S., Vandendriessche, S., Verhasselt, B., Boelens, J. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) compared to conventional susceptibility testing: implementation and potential added value in a tertiary hospital in Belgium. Acta Clinica Belgica: Int J Clin Lab Med. 78 (5), 385-391 (2023).
  12. Jasuja, J. K., Zimmermann, S., Burckhardt, I. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) for positive blood cultures in clinical practice using a total lab automation. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (7), 1305-1313 (2020).
  13. Martins, A., et al. Rapid antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae by disk diffusion directly from blood culture bottles using the EUCAST RAST breakpoints. J Glob Antimicrob Resist. 22, 637-642 (2020).
  14. Ekwall-Larson, A., Fröding, I., Mert, B., Åkerlund, A., Özenci, V. Analytical performance and potential clinical utility of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing in blood cultures after four hours of incubation. Microbiol Spectr. 11 (2), e500122 (2023).
  15. Cerrudo, V., et al. Usefulness of EUCAST rapid antibiotic susceptibility breakpoints and screening cut-off values directly from blood cultures for the inference of β-lactam resistance mechanisms in Enterobacterales. JAC-Antimicrob Resist. 5 (1), 017 (2023).
  16. Shan, Y., et al. Evaluation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test for enterobacterales-containing blood cultures in China. J Clin Microbiol. 60 (4), e0255921 (2022).
  17. Jonasson, E., Matuschek, E., Kahlmeter, G. The EUCAST rapid disc diffusion method for antimicrobial susceptibility testing directly from positive blood culture bottles. J Antimicrob Chemother. 75 (4), 968-978 (2020).
  18. Tayşi, M. R., et al. Implementation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test (RAST) directly from positive blood culture bottles without the advanced identification systems. J Antimicrobial Chemotherapy. 77 (4), 1020-1026 (2022).
  19. Gupta, A., et al. A prospective study evaluating the effect of a ‘Diagnostic Stewardship Care-Bundle’ for automated blood culture diagnostics. J Glob Antimicrob Resist. 34, 119-126 (2023).
  20. Siddiqui, F., Gupta, A., Purwar, S., Saigal, S., Sharma, J. P. A prospective study to reduce turnaround time of microbiologically positive blood cultures in patients with sepsis in intensive care unit. Indian J Med Microbiol. 40 (4), 541-546 (2022).
  21. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiol Infect Dis. 72 (1), 20-31 (2012).
  22. Lemos, T. C., Cogo, L. L., Maestri, A. C., Hadad, M., Nogueira, K. d. a. S. Is it possible to perform bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing with a positive blood culture bottle for quick diagnosis of bloodstream infections. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 51 (2), 215-218 (2018).
  23. Funke, G., Funke-Kissling, P. Use of the BD PHOENIX automated microbiology system for direct identification and susceptibility testing of gram-negative rods from positive blood cultures in a three-phase trial. J Clin Microbiol. 42 (4), 1466-1470 (2004).
  24. Nimer, N. A., Al-Saa’da, R. J., Abuelaish, O. Accuracy of the VITEK 2 system for a rapid and direct identification and susceptibility testing of Gram negative rods and Gram-positive cocci in blood samples. East Mediterr Health J. 22 (3), 193-200 (2016).
  25. Quesada, M. D., et al. Performance of VITEK-2 Compact and overnight MicroScan panels for direct identification and susceptibility testing of Gram-negative bacilli from positive FAN BacT/ALERT blood culture bottles. Clin Microbiol Infect. 16 (2), 137-140 (2010).
  26. De Cueto, M., Ceballos, E., Martinez-Martinez, L., Perea, E. J., Pascual, A. Use of positive blood cultures for direct identification and susceptibility testing with the Vitek 2 system. J Clin Microbiol. 42 (8), 3734-3738 (2004).
  27. Munoz-Dávila, M. J., Yagüe, G., Albert, M., García-Lucas, T. Comparative evaluation of Vitek 2 identification and susceptibility testing of Gram-negative rods directly and isolated from BacT/ALERT-positive blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 31 (5), 663-669 (2012).
  28. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Quality control criteria for the implementation of the RAST method. Version 6.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
  29. Chen, J. R., Lee, S. Y., Yang, B. H., Lu, J. J. Rapid identification and susceptibility testing using the VITEK 2 system using culture fluids from positive BacT/ALERT blood cultures. J Microbiol, Immunol Infect. 41 (3), 259-264 (2008).
  30. Bruins, M. J., Bloembergen, P., Ruijs, G. J. H. M., Wolfhagen, M. J. H. M. Identification and susceptibility testing of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa by direct inoculation from positive BACTEC blood culture bottles into Vitek 2. J Clin Microbiol. 42 (1), 7-11 (2004).
  31. Lupetti, A., Barnini, S., Castagna, B., Nibbering, P. H., Campa, M. Rapid identification and antimicrobial susceptibility testing of Gram-positive cocci in blood cultures by direct inoculation into the BD Phoenix system. Clin Microbiol Infect. 16 (7), 986-991 (2010).
  32. Barreales, A., Lara, M., Hernández, I., Díez, O. Rapid identification and susceptibility testing of Gram-positive cocci in BacT/ALERT blood cultures by direct inoculation into the Vitek 2 system. Rev Esp Quimioter. 24 (3), 131-135 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Gram negatif SepsisOtomatik Kan K lt rEUCAST RASTMikrobiyal Tan mlamaOtomatik Mikrobiyal Tan mlama ve Antimikrobiyal Duyarl l k Test SistemiDirekt nokulum ProtokolStandart nokulum Haz rlama ProtokolEscherichia ColiKlebsiella PneumoniaePseudomonas AeruginosaAcinetobacter Baumannii KompleksiKaynak S n rl AyarlarGeri D n S resi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır