A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر هذا البروتوكول إجراء تحضيرا محسنا ومتقنا لعينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ. وهي مناسبة للتطبيقات التي تنطوي على تحليل نقاط الاشتباك العصبي في عضويات الشبكية الناضجة.

Abstract

عضويات الشبكية (ROs) هي نظام زراعة ثلاثي الأبعاد يحاكي سمات الشبكية البشرية التي تميزت عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) في ظل ظروف محددة. تمت دراسة تطور المشبك العصبي ونضجه في ROs من الناحية المناعية والكيميائية والوظيفية. ومع ذلك ، فإن الدليل المباشر على البنية التحتية الملامسة المشبكية محدود ، حيث يحتوي على كل من نقاط الاشتباك العصبي الشريطية الخاصة والمشابك الكيميائية التقليدية. يتميز المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) بدقة عالية وتاريخ محترم يوضح تطور الشبكية ونضج المشبك العصبي في البشر والأنواع المختلفة. إنها أداة قوية لاستكشاف البنية المشبكية في ROs وتستخدم على نطاق واسع في مجال البحث في ROs. لذلك ، لاستكشاف بنية جهات الاتصال المشبكية RO بشكل أفضل على المستوى النانوي والحصول على أدلة مجهرية عالية الجودة ، قمنا بتطوير طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لإعداد عينة RO TEM. تصف هذه الورقة البروتوكول والكواشف المستخدمة والخطوات التفصيلية ، بما في ذلك إعداد تثبيت RO ، وما بعد التثبيت ، والتضمين ، والتصور.

Introduction

تظهر شبكية العين ، وهي عضو حسي بصري حيوي في البشر والثدييات ، بنية مغلفة مميزة تتميز بثلاث طبقات نووية تضم الخلايا العصبية السومة وطبقتين شبكيتين تشكلهما الوصلات المشبكية1 ، بما في ذلك المشابك التقليدية والمشبك الشريطيالمتخصص 2,3. يلعب المشبك الشريطي دورا مهما في نقل نبضات الحويصلة بطريقة متدرجة 2,3. تتضمن عملية الرؤية نقل الإشارات الكهروضوئية عبر مستويات مختلفة من الخلايا العصبية والمشابك العصبية ، لتصل في النهاية إلى القشرة البصرية 4,5....

Protocol

1. الحصول على مكاتب تسلم الطلبات من iPSCs25

ملاحظة: تم اشتقاق ROs من iPSCs عن طريق تعديل الإجراء المبلغ عنه سابقا.

  1. فصل iPSCs عند التقاء ~ 90٪ باستخدام البروتياز البكتيري (انظر جدول المواد). تقطيع المستعمرات إلى قطع وكشطها مع رافع الخلية.
  2. بعد التجميع ، أعد تعليق مجموعات الخلايا في 0.25 مل من Matrigel المثلج البارد. بعد 20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، يتم تشتيت الجل المتصلب بوسط DMEM/F12 (مكمل N2 0.5٪، مكمل B27 1٪، 0.1 ملليمتر β-ميركابتوإيثانول، 0.2 ملليمتر بديل ل-جلوتامين، 100 وحدة / مل من البنسلين و100 ملغ/....

النتائج

يوفر إنشاء 3D ROs من خلال تمايز iPSC أداة قوية لدراسة آليات أمراض الشبكية والعلاج باستبدال الخلايا الجذعية. على الرغم من أن آخرين قد أظهروا الروابط المشبكية في ROs وظيفيا وكيميائيا مناعيا ، إلا أن الأدلة المباشرة على نقاط الاشتباك العصبي التقليدية والشريطية محدودة للغاية. نق?.......

Discussion

في هذه المقالة ، قدمنا بروتوكولا مفصلا لمراقبة البنية التحتية المشبكية التقليدية والشريطية في ROs بواسطة TEM. يعتمد هذا البروتوكول على طرق تحضير الشبكية الموصوفة سابقا مع بعض التعديلات20. لتحسين معدل نجاح معالجة العينات وجودة الصور المجهرية TEM ، ضع في اعتبارك ?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFA1105503) ، ومختبر الدولة الرئيسي لعلم الأعصاب (SKLN-202103) ، ومؤسسة تشجيانغ للعلوم الطبيعية في الصين (Y21H120019) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (82070981).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Petri dishCorning430167
AcetoneElectron Microscopy Science10000
B27 supplementGibcoA3582801
Cell lifterSanta Cruzsc-395251
Copper gridsBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.AZH400HH
DigitalMicrograph SoftwareGatan, Inc.Software
DispaseStemCell Technologies#07913Bacterial protease
DMEM/F12 mediumGibco#11320033
Embedding moldBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ10592
Epon-812 resinElectron Microscopy Science#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)Biological Industries#04-0021A
GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
hiPSCShownin Biotechnology Co. Ltd.RC01001-A
Lead citrateBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ02618
L-GlutaMaxLife Technologies#35050061L-glutamine substitute
MatrigelCorning356234
Microscope slideCITOTEST80312-3161
N2 supplementGibco17502048
Na2HPO4· 12H2OSigma71650A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2OSigma71507A component of PB/PBS
Non-essential amino acidsSigma#M7145
Optical microscopeLab Binocular Biological MicroscopeXsz-107bnii
OsO4TED PELLA4008-160501
OvenBluepardBPG9040A
ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
Penicillin-StreptomycinGibco#15140-122
Semi/ultrathin microtomeReichert-Jung396649
TaurineSigma#T0625
Toluidine blueSangon BiotechE670105-0100
Transmission Electron MicroscopesHITACHIH-7500
Uranyl acetateTED PELLACA96049
β-mercaptoethanolSigma444203

References

  1. Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489 (2021).
  2. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved