JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر هذا البروتوكول إجراء تحضيرا محسنا ومتقنا لعينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ. وهي مناسبة للتطبيقات التي تنطوي على تحليل نقاط الاشتباك العصبي في عضويات الشبكية الناضجة.

Abstract

عضويات الشبكية (ROs) هي نظام زراعة ثلاثي الأبعاد يحاكي سمات الشبكية البشرية التي تميزت عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) في ظل ظروف محددة. تمت دراسة تطور المشبك العصبي ونضجه في ROs من الناحية المناعية والكيميائية والوظيفية. ومع ذلك ، فإن الدليل المباشر على البنية التحتية الملامسة المشبكية محدود ، حيث يحتوي على كل من نقاط الاشتباك العصبي الشريطية الخاصة والمشابك الكيميائية التقليدية. يتميز المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) بدقة عالية وتاريخ محترم يوضح تطور الشبكية ونضج المشبك العصبي في البشر والأنواع المختلفة. إنها أداة قوية لاستكشاف البنية المشبكية في ROs وتستخدم على نطاق واسع في مجال البحث في ROs. لذلك ، لاستكشاف بنية جهات الاتصال المشبكية RO بشكل أفضل على المستوى النانوي والحصول على أدلة مجهرية عالية الجودة ، قمنا بتطوير طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لإعداد عينة RO TEM. تصف هذه الورقة البروتوكول والكواشف المستخدمة والخطوات التفصيلية ، بما في ذلك إعداد تثبيت RO ، وما بعد التثبيت ، والتضمين ، والتصور.

Introduction

تظهر شبكية العين ، وهي عضو حسي بصري حيوي في البشر والثدييات ، بنية مغلفة مميزة تتميز بثلاث طبقات نووية تضم الخلايا العصبية السومة وطبقتين شبكيتين تشكلهما الوصلات المشبكية1 ، بما في ذلك المشابك التقليدية والمشبك الشريطيالمتخصص 2,3. يلعب المشبك الشريطي دورا مهما في نقل نبضات الحويصلة بطريقة متدرجة 2,3. تتضمن عملية الرؤية نقل الإشارات الكهروضوئية عبر مستويات مختلفة من الخلايا العصبية والمشابك العصبية ، لتصل في النهاية إلى القشرة البصرية 4,5.

تمثل عضويات الشبكية (ROs) نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد (3D) مشتق من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، تحاكي الحالات الفسيولوجية لأنسجة الشبكية في المختبر1،6،7. هذا النهج واعد لدراسة أمراض الشبكية8 ، وفحص الأدوية9 ، والعمل كعلاج محتمل للحالات التنكسية الشبكية التي لا رجعة فيها مثل التهاب الشبكية الصباغي10 والزرق11. كنظام توصيل بصري قوي في المختبر ، فإن المشبك داخل ROs هو هيكل حاسم يسهل تحويل الإشارة الفعالة ونقلها5.

يمكن تقسيم تطور RO تقريبا إلى ثلاث مراحل وفقا لسماتها المورفولوجية وملامح التعبير الجزيئي 6,12. تتكون التناضحيات العكسية في المرحلة 1 (حوالي D21-D60) من الخلايا السلفية العصبية للشبكية ، والعديد من خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، وعدد قليل من خلايا الأمكرين النجمية (SACs) ، المقابلة للحقبة الأولى من تطور الجنين البشري. في المرحلة 2 (حوالي D50-D150) ، تعبر ROs عن بعض سلائف المستقبلات الضوئية ، والخلايا العصبية البينية ، والجينات المرتبطة بتكوين المشابك ، والتي تمثل مرحلة انتقالية. تطور المستقبلات الضوئية النضج في المرحلة 3 ROs (حوالي بعد D100-D150) ، المقابلة للمرحلة الثالثة من نمو الجنين البشري6،12،13. والجدير بالذكر أنه بالمقارنة مع ROs في المرحلة 1 والمرحلة 2 ، فإن ROs في المرحلة 3 لها بنية رقائقية مميزة نضجت نقاط الاشتباك العصبي الخاصة بها12 ، بما في ذلك وجود نقاط الاشتباك العصبي الشريطية14. علاوة على ذلك ، أكدت دراسة حديثة أن نقاط الاشتباك العصبي الناضجة موجودة في نقل الإشارات الضوئية ، مما يشير إلى أنها وظيفية13. وبالتالي ، غالبا ما يتم اختيار ROs في المرحلة 3 للتحقيق في البنية المشبكية.

يتم تطبيق الكيمياء الهيستولوجية المناعية على نطاق واسع لدراسة التعبير عن البروتينات الجزيئية المختلفة. ومع ذلك ، فإن الحد من المجهر الضوئي يكمن في قدرته على مراقبة عدد محدود فقط من الخلايا والجزيئات المحددة في وقت واحد ، مما يؤدي إلى عدم وجود تحليل شامل للعلاقات بين الخلايا والبيئة المحيطة بها. يتميز المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) بدقة عالية ، بدقة محدودة تبلغ 0.1-0.2 نانومتر ، متجاوزا المجهر الضوئي بمقدار ~ 10-20 مرة15. يعوض عن عيوب الفحص المجهري الضوئي ويستخدم لتوضيح تطور الشبكية ونضج المشبك العصبي في البشر16،17 والأنواع المختلفة18،19،20،21. يتيح TEM التمييز المباشر للمكونات قبل المشبكية وما بعد المشبكية18,20 ، ويسمح أيضا بالمراقبة الشاملة للهياكل تحت الخلوية مثل الشرائط 2,3 والحويصلات22 والميتوكوندريا23. لذلك ، يعد TEM أداة أساسية لتحديد أنواع نقاط الاشتباك العصبي واستكشاف البنية التحتية لجهات الاتصال المشبكية في ROs على المستوى النانوي.

من الأهمية بمكان ملاحظة أن تحضير العينة له أهمية كبيرة للحصول على صور مجهرية إلكترونية عالية الجودة. على الرغم من أن بعض الدراسات قد أجرت EM على ROs12،13،24 ، إلا أن الإجراءات التفصيلية غير واضحة. نظرا لأن جودة صورة المجهر الإلكتروني تعتمد على تأثير تثبيت RO وتخلل الكاشف إلى حد كبير ، يجب مراعاة العديد من العوامل المهمة أثناء التحضير. وبالتالي ، من أجل التحقيق بشكل أفضل في جهات الاتصال المشبكية في ROs ، نقدم طريقة ذات قابلية استنساخ جيدة توضح نقاط تشغيل تثبيت RO وتضمينه وتحديد مواقع المراقبة.

Protocol

1. الحصول على مكاتب تسلم الطلبات من iPSCs25

ملاحظة: تم اشتقاق ROs من iPSCs عن طريق تعديل الإجراء المبلغ عنه سابقا.

  1. فصل iPSCs عند التقاء ~ 90٪ باستخدام البروتياز البكتيري (انظر جدول المواد). تقطيع المستعمرات إلى قطع وكشطها مع رافع الخلية.
  2. بعد التجميع ، أعد تعليق مجموعات الخلايا في 0.25 مل من Matrigel المثلج البارد. بعد 20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، يتم تشتيت الجل المتصلب بوسط DMEM/F12 (مكمل N2 0.5٪، مكمل B27 1٪، 0.1 ملليمتر β-ميركابتوإيثانول، 0.2 ملليمتر بديل ل-جلوتامين، 100 وحدة / مل من البنسلين و100 ملغ/مل من الستربتومايسين). حدد هذا الوقت على أنه اليوم 0 من التمايز.
  3. بعد 5 أيام من الثقافة العائمة ، تتجمع الخلايا لتشكيل أكياس الخلايا. انقل هذه الخراجات الخلوية إلى طبق بتري 100 مم حيث ستلتصق الآن وتنمو.
  4. في اليوم 15 ، استخدم البروتياز البكتيري لفصل الخلايا الملتصقة واستزراعتها في وسط DMEM / F12 (مكمل 2٪ B27 ، 0.1 mM من الأحماض الأمينية غير الأساسية).
  5. في اليوم 21 ، قم بتغيير الوسط ب 20 مل من الوسط المحتوي على المصل (وسط DMEM / F12 ، 8٪ FBS ، 2٪ مكمل B27 ، 100 mM Taurine ، و 2 mM L-glutamine بديل) ، واستبدل الوسط كل أسبوع.

2. التثبيت الأمامي ل ROs

  1. انقل برفق أحد ROs المستزرعة (~ D180 ، حجم قطره حوالي 1 ~ 2 مم هو الأمثل) من طبق بتري إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل مع ماصة ووضع علامة على المعلومات ذات الصلة حول ROs.
    ملاحظة: قطع ROs إلى النصف أو قطع الأنسجة سيئة التنظيم باستخدام ماكينة حلاقة تحت المجهر في الطبق الذي يحتوي على مثبت إذا كانت ROs كبيرة جدا.
  2. قم بإزالة وسط الاستزراع من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل باستخدام ماصة. أضف 1.5 مل من 2٪ بارافورمالدهيد -2٪ غلوتارالدهيد المثبت المخفف في 0.1 M فوسفات عازلة (PB) ، درجة الحموضة 7.4 ، وثبت في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 4 ساعات. قم بتخزين أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: يمكن إيقاف هذه الخطوة مؤقتا لمدة 1 أسبوع ولكن يوصى بإعادة التشغيل في أقرب وقت ممكن. إذا تركت ROs لفترة أطول ، فقد يتسبب ذلك في التحلل الذاتي للخلايا مما يؤدي إلى تدمير البنية التحتية ل ROs. نظرا لهشاشة ROs ، تجنب العمليات الدورية أو المتذبذبة أو التقليب أو العمليات القاسية.

3. التثبيت اللاحق لمكاتب تسلم الطلبات

  1. قم بإزالة مثبت 2٪ بارافورمالدهايد -2٪ جلوتارالدهيد واغسله ب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.01 م (PBS) عند درجة حموضة 7.4 لمدة 3 × 10 دقائق. قم بتعليق ROs برفق في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل أثناء عملية الغسيل للشطف الكامل. لكل يوم إضافي من التثبيت ، قم بزيادة عدد الغسلات بمقدار اثنين لإزالة المثبت المتبقي قدر الإمكان.
  2. قم بإزالة أي PBS متبقي باستخدام ماصة واستبدلها ب ~ 150 ميكرولتر من حمض الأوسميك 1٪ (OsO4) حتى يتم غمر كتل الأنسجة. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في صندوق مظلم لحمايتها من الضوء والتسلل في RT لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: OsO4 هو مؤكسد قوي ويجب التعامل معه في غطاء الدخان.

4. تلطيخ والجفاف

ملاحظة: يجب تشغيل مزيل الرطوبة لتجفيف البيئة من هذه الخطوة.

  1. قم بإزالة OsO4 باستخدام ماصة ، واغسلها ب 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) 3 × 10 دقائق ، ثم اغسل 3 × 10 دقائق بالماء منزوع الأيونات.
    ملاحظة: لضمان الشطف الكامل ل ROs ، نوصي بتعليق ROs. نضح OsO4 في زجاجة مخصصة للتخلص منها.
  2. قم بإزالة آخر غسل بالماء منزوع الأيونات واستبدله ب ~ 150 ميكرولتر لكل أنبوب (ضمان التسلل الكامل لكتل الأنسجة) من أسيتات اليورانيوم والبقع لمدة 1-2 ساعة في RT. حماية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من الضوء.
  3. قم بإزالة أسيتات اليورانيوم واستبدلها ب 1 مل من الأسيتون بنسبة 50٪ في غطاء الدخان ، مع تجفيفها لمدة 10 دقائق. ثم ، استخدم 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪ و 100٪ أسيتون للجفاف المتدرج لل ROs على التوالي. يستمر كل جفاف لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: اترك بعض السوائل لامتصاص ROs لكل تبادل لمنع التعرض للهواء والرطوبة. بالإضافة إلى ذلك ، تعمل بسرعة في أسرع وقت ممكن لأن الأسيتون متقلب. نضح أسيتات اليورانيوم في زجاجة مخصصة للتخلص منها.

5. التسلل

  1. تخلص من الأسيتون وأضف ~ 150 ميكرولتر من الخليط المكون من الأسيتون وراتنج Epon-812 بنسبة 1: 1. ضعه في فرن 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. قم بإزالة الخليط أعلاه واستبدله بخليط يتكون من الأسيتون وراتنج Epon-812 بنسبة 1: 4. ضعه في فرن على حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
  3. انقل ROs إلى الأنابيب الجديدة التي تحتوي على ~ 500 ميكرولتر من راتنجات الايبوكسي النقية بعناية وضعها في فرن 45 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.

6. التضمين

  1. قم بإعداد 30-50 مل من راتنجات الايبوكسي النقية في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل عن طريق خلط مجموعة الكاشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مسبقا. قم بتدوير راتنجات الايبوكسي النقية رأسا على عقب ببطء لمدة 30 دقيقة لتقليل فقاعات الهواء التي يدخلها الخلاط. ثم اتركيه في فرن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. أضف 2/3 حجم راتنجات الايبوكسي النقية إلى أخدود قالب التضمين.
  2. استخدم عود أسنان لاختيار ROs في قالب التضمين المجهز براتنجات الايبوكسي النقية.
  3. املأ الأخدود براتنجات الايبوكسي النقية حتى يبرز قليلا أو ينتفخ.
  4. اضبط موضع ROs على طرفي قالب التضمين للتضمين الاتجاهي. ضع قالب التضمين في فرن 45 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة ثم ضعه في فرن 65 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة.

7. تحديد المواقع شبه رقيقة

  1. صنفر راتنجات الايبوكسي الزائدة حول الأنسجة من نهايات الجوانب الأربعة الأطول من كتلة التضمين لتشكيل وجه شبه منحرف. قم بتثبيت كتلة التضمين في حامل تثبيت العينة وقم بربط البرغي باستخدام مفك البراغي L. ثم قم بتثبيت سكاكين زجاجية على حامل السكين وشد الجوز يدويا.
  2. قم بقص الراتنج الزائد حتى تتعرض المنطقة المرغوبة.
  3. املأ حوض السكين الزجاجي بالماء. قطع شرائح شبه رقيقة بسمك 1 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم شبه رقيقة ووضعها على شريحة مجهر بإبرة.
  4. أضف 50 ميكرولتر من 1٪ تولويدين أزرق لصبغ شرائح شبه رقيقة واحتضانها لمدة دقيقة واحدة عند 95 درجة مئوية على لوح التسخين. شطف بالماء المقطر لمدة 2 دقيقة. استخدم مجهرا بصريا عاديا 20x لمراقبة بنية الأقسام.

8. تقسيم رقيقة جدا

  1. قم بتثبيت كتل التضمين والسكاكين الزجاجية كما هو موضح في الخطوة 7.1. اضبط المسافة بين السكين وكتلة الأنسجة ومستوى السائل في الحوض وسرعة التقطيع. قطع المقاطع فائقة النحافة بسمك ~ 70-100 نانومتر باستخدام ميكروتوم فائق النحافة واغرف الشرائح على شبكة نحاسية (200 شبكة) مع الفيلم الداعم.
  2. قم بتلطيخ المقاطع فائقة الرقة باستخدام سترات الرصاص بنسبة 3٪ لمدة 15 دقيقة لتعزيز التباين في إجراء التلوين المزدوج.

9. تصوير ROs بواسطة TEM

  1. قم بتشغيل البرنامج (انظر جدول المواد).
  2. انقر فوق الزر "وضع الذاكرة " وقم بتمييز كل قسم فائق النحافة تقريبا.
  3. البحث عن الهياكل متشابك.
    1. يميز الهيكل الرقائقي لل ROs عند التكبير المنخفض.
    2. حدد موقع الطبقة النووية الخارجية (ONL) ، والتي توضح بنية نووية ذات كثافة إلكترون أعمق. بعد ذلك ، انتقل إلى محطة المستقبلات الضوئية حيث تتراكم العديد من الحويصلات. ابحث عن أطراف القضيب بشريط متشابك واحد والأطراف المخروطية ذات الأشرطة المشبكية المتعددة.
    3. انتقل إلى طبقة الضفيرة الداخلية (IPL) وابحث عن بنية مماثلة بشريط صغير.
  4. التقط الصورة المجهرية.
    1. انقر فوق ابدأ وأدخل طاقة التكبير المقابلة.
    2. احفظ الصور.

النتائج

يوفر إنشاء 3D ROs من خلال تمايز iPSC أداة قوية لدراسة آليات أمراض الشبكية والعلاج باستبدال الخلايا الجذعية. على الرغم من أن آخرين قد أظهروا الروابط المشبكية في ROs وظيفيا وكيميائيا مناعيا ، إلا أن الأدلة المباشرة على نقاط الاشتباك العصبي التقليدية والشريطية محدودة للغاية. نق?...

Discussion

في هذه المقالة ، قدمنا بروتوكولا مفصلا لمراقبة البنية التحتية المشبكية التقليدية والشريطية في ROs بواسطة TEM. يعتمد هذا البروتوكول على طرق تحضير الشبكية الموصوفة سابقا مع بعض التعديلات20. لتحسين معدل نجاح معالجة العينات وجودة الصور المجهرية TEM ، ضع في اعتبارك ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFA1105503) ، ومختبر الدولة الرئيسي لعلم الأعصاب (SKLN-202103) ، ومؤسسة تشجيانغ للعلوم الطبيعية في الصين (Y21H120019) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (82070981).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Petri dishCorning430167
AcetoneElectron Microscopy Science10000
B27 supplementGibcoA3582801
Cell lifterSanta Cruzsc-395251
Copper gridsBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.AZH400HH
DigitalMicrograph SoftwareGatan, Inc.Software
DispaseStemCell Technologies#07913Bacterial protease
DMEM/F12 mediumGibco#11320033
Embedding moldBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ10592
Epon-812 resinElectron Microscopy Science#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)Biological Industries#04-0021A
GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
hiPSCShownin Biotechnology Co. Ltd.RC01001-A
Lead citrateBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ02618
L-GlutaMaxLife Technologies#35050061L-glutamine substitute
MatrigelCorning356234
Microscope slideCITOTEST80312-3161
N2 supplementGibco17502048
Na2HPO4· 12H2OSigma71650A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2OSigma71507A component of PB/PBS
Non-essential amino acidsSigma#M7145
Optical microscopeLab Binocular Biological MicroscopeXsz-107bnii
OsO4TED PELLA4008-160501
OvenBluepardBPG9040A
ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
Penicillin-StreptomycinGibco#15140-122
Semi/ultrathin microtomeReichert-Jung396649
TaurineSigma#T0625
Toluidine blueSangon BiotechE670105-0100
Transmission Electron MicroscopesHITACHIH-7500
Uranyl acetateTED PELLACA96049
β-mercaptoethanolSigma444203

References

  1. Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489 (2021).
  2. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  3. Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. Ribbon synapses of the retina. Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).
  4. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The organization of the retina and visual. , (1995).
  5. Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2. Elife. 7, e30388 (2018).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  8. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
  9. Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. Human-on-chip for therapy development and fundamental science. Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).
  10. Chahine Karam, F., et al. Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability. J Pers Med. 12 (3), 502 (2022).
  11. Lo, J., et al. Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies. Mol Aspects Med. 94, 101219 (2023).
  12. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  13. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  14. Cora, V., et al. A cleared view on retinal organoids. Cells. 8 (5), 391 (2019).
  15. Żak, A. M. Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives. Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).
  16. Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. The anatomy of the foveola reinvestigated. PeerJ. 6, e4482 (2018).
  17. Syrbe, S., et al. Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study. Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).
  18. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  19. Liu, X., et al. Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish. Front Cell Dev Biol. 11, 1169941 (2023).
  20. Yang, Q., et al. Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  21. Zhang, J., et al. Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background. Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).
  22. De Robertis, E., Franchi, C. M. Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones. J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).
  23. Frey, T. G., Mannella, C. A. The internal structure of mitochondria. Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).
  24. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  25. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Front Cell Dev Biol. 8, 128 (2020).
  26. Afanasyeva, T. a. V., et al. A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications. Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved