투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 시료 준비

요약

이 프로토콜은 투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 샘플에 대한 최적화되고 정교한 준비 절차를 제공합니다. 성숙한 망막 오가노이드의 시냅스 분석과 관련된 응용 분야에 적합합니다.

초록

망막 오가노이드(RO)는 특정 조건에서 유도만능줄기세포(iPSC)와 구별된 인간의 망막 특징을 모방한 3차원 배양 시스템입니다. RO에서의 시냅스 발달 및 성숙은 면역세포화학적, 기능적으로 연구되어 왔습니다. 그러나 시냅스 접촉 초세구조의 직접적인 증거는 제한적이며, 특수 리본 시냅스와 기존의 화학적 시냅스를 모두 포함합니다. 투과 전자 현미경(TEM)은 고해상도와 인간과 다양한 종의 망막 발달 및 시냅스 성숙을 설명하는 존경할 만한 역사가 특징입니다. RO의 시냅스 구조를 탐구하는 강력한 도구이며 RO의 연구 분야에서 널리 사용됩니다. 따라서 나노 스케일에서 RO 시냅스 접촉의 구조를 더 잘 탐구하고 고품질의 현미경 증거를 얻기 위해 간단하고 반복 가능한 RO TEM 샘플 준비 방법을 개발했습니다. 이 백서에서는 프로토콜, 사용된 시약, RO 고정 준비, 사후 고정, 임베딩 및 시각화를 포함한 자세한 단계를 설명합니다.

서문

인간과 포유류의 중요한 시각 감각 기관인 망막은 뉴런 소마를 수용하는 3개의 핵층과 기존 시냅스와 특수 리본 시냅스 ^2,3을 포함한 시냅스 연결^1에 의해 형성된 2개의 망상층을 특징으로 하는 뚜렷한 적층 구조를 나타냅니다. 리본 시냅스는 단계적 방식으로 소포 자극을 전달하는 데 중요한 역할을 합니다 ^2,3. 시각 과정은 뉴런과 시냅스의 다양한 수준을 가로지르는 전기 광학 신호 전달을 포함하며, 궁극적으로 시각 피질 ^4,5에 도달합니다.

망막 오가노이드(RO)는 유도만능줄기세포(iPSC)에서 유래한 3차원(3D) 배양 시스템을 나타내며, in vitro ^1,6,7

프로토콜

1. iPSC에서 RO 얻기²⁵

참고: RO는 이전에 보고된 절차를 수정하여 iPSC에서 파생되었습니다.

1. 박테리아 프로테아제를 사용하여 ~90% 합류점에서 iPSC를 해리합니다( 재료 표 참조). 콜로니를 조각으로 자르고 셀 리프터로 긁어냅니다.
2. 채취 후 세포 클러스터를 0.25mL의 얼음처럼 차가운 Matrigel에 재현탁시킵니다. 37°C에서 20분 배양한 후 응고된 겔에 DMEM/F12 배지(0.5% N2 보충제, 1% B27 보충제, 0.1mM β-메르캅토에탄올, 0.2mM L-글루타민 대체물, 100U/mL 페니실린 및 100mg/mL 스트렙토마이신)를 뿌립니다. 이 시간을 차별화의 0일차로 정의합니다.
3. 5일 동안 부유 배양 후 세포가 모여 세포 낭종을 형성합니다. 이 세포 낭종을 100mm 페트리 접시에 옮기면 이제 부착되고 자랍니다.
4. 15일째에 박테리아 프로테아제를 사용하여 부착 세포를 해리하고 DMEM/F12 배지(2% B27 보충제, 0.1mM 비필수 아미노산)에서....

토론

이 기사에서는 TEM에 의한 RO의 기존 및 리본 시냅스 초미구조를 관찰하기 위한 자세한 프로토콜을 제시했습니다. 이 프로토콜은 이전에 설명한 망막 준비 방법에 기초하며, 약간의 변형이 가미되어^있다(20). 샘플 처리의 성공률과 TEM 현미경 사진의 품질을 개선하려면 다음 핵심 사항을 고려하십시오. 첫째, RO가 iPSC에서 발생하여 혈관 구조

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	430167
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
B27 supplement	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Copper grids	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	AZH400HH
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Bacterial protease
DMEM/F12 medium	Gibco	#11320033
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ10592
Epon-812 resin	Electron Microscopy Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Lead citrate	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-glutamine substitute
Matrigel	Corning	356234
Microscope slide	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of PB/PBS
Non-essential amino acids	Sigma	#M7145
Optical microscope	Lab Binocular Biological Microscope	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Oven	Bluepard	BPG9040A
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
Transmission Electron Microscopes	HITACHI	H-7500
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoethanol	Sigma	444203