Подготовка образцов органоидов сетчатки для просвечивающей электронной микроскопии

Резюме

Этот протокол обеспечивает оптимизированную и сложную процедуру подготовки образцов органоидов сетчатки для просвечивающей электронной микроскопии. Он подходит для приложений, связанных с анализом синапсов в зрелых органоидах сетчатки.

Аннотация

Органоиды сетчатки (РО) представляют собой трехмерную культуральную систему, имитирующую особенности сетчатки человека, которые дифференцировались от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) в определенных условиях. Развитие и созревание синапсов в АФ изучены иммуноцитохимически и функционально. Однако прямые доказательства синаптической контактной ультраструктуры ограничены, содержащей как специальные ленточные синапсы, так и обычные химические синапсы. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) характеризуется высоким разрешением и хорошей историей, выясняющей развитие сетчатки и созревание синапсов у человека и различных видов. Это мощный инструмент для изучения синаптической структуры в РО, который широко используется в области исследований РО. Поэтому для лучшего изучения структуры синаптических контактов RO на наноуровне и получения высококачественных микроскопических доказательств мы разработали простой и воспроизводимый метод подготовки образцов RO TEM. В этой статье описывается протокол, используемые реагенты и подробные шаги, включая подготовку к фиксации ОО, постфиксацию, встраивание и визуализацию.

Введение

Сетчатка, жизненно важный орган зрительной чувствительности у человека и млекопитающих, имеет отчетливую слоистую структуру, характеризующуюся тремя ядерными слоями, содержащими нейронные сомы, и двумя плексиформными слоями, образованными синаптическими связями¹, включая обычные синапсы и специализированный ленточный синапс ^2,3. Ленточный синапс играет решающую роль в передаче импульсов везикул в постепенном порядке ^2,3. Процесс зрения включает в себя передачу электрооптического сигнала через ра....

протокол

1. Получение RO от iPSCs²⁵

ПРИМЕЧАНИЕ: RO были получены из iPSC путем модификации ранее описанной процедуры.

1. Диссоциировать иПСК при слиянии ~90% с помощью бактериальной протеазы (см. Таблицу материалов). Измельчите колонии на кусочки и соскребите их с помощью клеточного подъемника.
2. После сбора повторно суспендируйте кластеры клеток в 0,25 мл ледяного Матригеля. После 20 минут инкубации при 37 °C рассыпьте затвердевший гель средой DMEM/F12 (0,5% добавка N2, 1% добавка B27, 0,1 мМ β-меркаптоэтанол, 0,2 мМ заменител....

Результаты

Создание 3D RO с помощью дифференцировки iPSC является мощным инструментом для изучения механизмов заболевания сетчатки и заместительной терапии стволовыми клетками. Хотя другие продемонстрировали синаптические связи в РО функционально и иммуноцитохимически, прямые ?.......

Обсуждение

В этой статье мы представили подробный протокол наблюдения за обычной и ленточной синаптической ультраструктурой в РО с помощью ПЭМ. Этот протокол основан на описанных ранее способах препарирования сетчатки с некоторыми модификациями²⁰. Чтобы повысить ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	430167
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
B27 supplement	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Copper grids	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	AZH400HH
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Bacterial protease
DMEM/F12 medium	Gibco	#11320033
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ10592
Epon-812 resin	Electron Microscopy Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Lead citrate	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-glutamine substitute
Matrigel	Corning	356234
Microscope slide	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of PB/PBS
Non-essential amino acids	Sigma	#M7145
Optical microscope	Lab Binocular Biological Microscope	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Oven	Bluepard	BPG9040A
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
Transmission Electron Microscopes	HITACHI	H-7500
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoethanol	Sigma	444203