Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão

Resumo

Este protocolo fornece um procedimento de preparação otimizado e elaborado para amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão. É adequado para aplicações que envolvem a análise de sinapses em organoides retinianos maduros.

Resumo

Os organoides retinianos (ROs) são um sistema de cultura tridimensional que imita as características da retina humana que se diferenciaram das células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) sob condições específicas. O desenvolvimento e a maturação da sinapse em ROs têm sido estudados imunocitoquímica e funcionalmente. No entanto, a evidência direta da ultraestrutura de contato sináptico é limitada, contendo sinapses de fita especiais e sinapses químicas convencionais. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) é caracterizada por alta resolução e uma história respeitável elucidando o desenvolvimento da retina e a maturação das sinapses em humanos e várias espécies. É uma ferramenta poderosa para explorar a estrutura sináptica em ROs e é amplamente utilizada no campo de pesquisa de ROs. Portanto, para explorar melhor a estrutura dos contatos sinápticos de RO em nanoescala e obter evidências microscópicas de alta qualidade, desenvolvemos um método simples e repetível de preparação de amostras de RO TEM. Este artigo descreve o protocolo, os reagentes usados e as etapas detalhadas, incluindo a preparação da fixação do RO, pós-fixação, incorporação e visualização.

Introdução

A retina, um órgão sensorial visual vital em humanos e mamíferos, exibe uma estrutura laminada distinta caracterizada por três camadas nucleares que abrigam somas de neurônios e duas camadas plexiformes formadas por conexões sinápticas¹, incluindo sinapses convencionais e a sinapse de fita especializada ^2,3. A sinapse da fita desempenha um papel crucial na transmissão de impulsos de vesículas de maneira gradual ^2,3. O processo de visão envolve a transmissão de sinais eletro-ópticos através de vários níveis de neurônios e sinapses, atingindo o córtex visual ^4,5.

Os organoides retinianos (ROs) representam um sistema de cultura tridimensional (3D) derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), mimetizando os estados fisiológicos do tecido retiniano in vitro ^1,6,7. Essa abordagem é promissora para estudar doenças da retina⁸, triagem de drogas⁹ e servir como uma terapia potencial para condições degenerativas irreversíveis da retina, como retinite pigmentosa¹⁰ e glaucoma¹¹. Como um poderoso sistema de condução óptica in vitro, a sinapse dentro das ROs é uma estrutura crucial que facilita a transformação e transferência efetivas^{do sinal 5}.

O desenvolvimento de RO pode ser dividido em três estágios de acordo com suas características morfológicas e perfis de expressão molecular ^6,12. As ROs no estágio 1 (em torno de D21-D60) compreendem células progenitoras neurais da retina, muitas células ganglionares da retina (RGCs) e algumas células amácrinas starburst (SACs), correspondendo à primeira época do desenvolvimento fetal humano. No estágio 2 (em torno de D50-D150), as ROs expressam alguns precursores de fotorreceptores, interneurônios e genes relacionados à sinaptogênese, o que representa uma fase de transição. Os fotorreceptores desenvolvem maturidade no estágio 3 ROs (por volta de D100-D150), correspondendo ao terceiro estágio do desenvolvimento fetal humano ^6,12,13. Notavelmente, em comparação com ROs no estágio 1 e estágio 2, os ROs no estágio 3 têm uma estrutura lamelar distinta cujas sinapses amadureceram¹², incluindo a presença de sinapses de fita¹⁴. Além disso, um estudo recente confirmou que as sinapses maduras existem na transmissão de sinais luminosos, indicando que são funcionais¹³. Assim, os ROs no estágio 3 são frequentemente selecionados para investigar a estrutura sináptica.

A imuno-histoquímica é amplamente aplicada ao estudo da expressão de várias proteínas moleculares. No entanto, a limitação da microscopia óptica reside em sua capacidade de observar apenas um número restrito de células e moléculas específicas por vez, resultando na falta de uma análise abrangente das relações entre as células e o ambiente circundante. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) é caracterizada por alta resolução, com resolução limitada de 0,1-0,2 nm, superando o microscópio óptico em ~10-20 vezes¹⁵. Ele compensa os defeitos da microscopia óptica e é usado para elucidar o desenvolvimento da retina e a maturação das sinapses em humanos^16,17 e várias espécies 18,19,20,21. O MET permite a distinção direta dos componentes pré-sinápticos e pós-sinápticos^18,20 e até permite a observação abrangente de estruturas subcelulares, como fitas ^2,3, vesículas²² e mitocôndrias²³. Portanto, o MET é uma ferramenta essencial para identificar tipos de sinapses e explorar a ultraestrutura dos contatos sinápticos em ROs em nanoescala.

É crucial observar que a preparação da amostra é de grande importância para a aquisição de micrografias eletrônicas de alta qualidade. Embora alguns estudos tenham realizado ME em ROs 12,13,24, os procedimentos detalhados não são claros. Como a qualidade da imagem de microscopia eletrônica depende em grande parte do efeito da fixação do RO e da permeação do reagente, vários fatores importantes precisam ser considerados durante a preparação. Consequentemente, para melhor investigar os contatos sinápticos em ROs, apresentamos um método com boa reprodutibilidade que mostra os pontos de operação de fixação de RO, incorporação e identificação de locais de observação.

Protocolo

1. Obtenção de ROs de iPSCs²⁵

NOTA: Os ROs foram derivados de iPSCs modificando o procedimento relatado anteriormente.

1. Dissocie iPSCs em ~ 90% de confluência usando uma protease bacteriana (consulte a Tabela de Materiais). Corte as colônias em pedaços e raspe-os com um levantador de células.
2. Após a coleta, ressuspenda os aglomerados de células em 0,25 mL de Matrigel gelado. Após 20 min de incubação a 37 °C, espalhe o gel solidificado com o meio DMEM/F12 (suplemento de N2 a 0,5%, suplemento a B27 a 1%, β-mercaptoetanol a 0,1 mM, substituto de L-glutamina a 0,2 mM, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 mg/mL). Defina esse tempo como dia 0 de diferenciação.
3. Após 5 dias de cultura flutuante, as células se agrupam para formar cistos celulares. Transfira esses cistos celulares para uma placa de Petri de 100 mm, onde eles agora irão aderir e crescer.
4. No dia 15, use protease bacteriana para dissociar as células aderentes e cultive-as em meio DMEM/F12 (suplemento de B27 a 2%, aminoácidos não essenciais 0,1 mM).
5. No dia 21, troque o meio por 20 mL de meio contendo soro (meio DMEM/F12, 8% de FBS, suplemento de B27 a 2%, 100 mM de taurina e 2 mM de substituto de L-glutamina) e substitua o meio todas as semanas.

2. Fixação anterior de ROs

1. Mova suavemente uma das ROs cultivadas (~ D180, um tamanho de cerca de 1 ~ 2 mm de diâmetro é o ideal) da placa de Petri para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com uma pipeta e marque as informações relevantes sobre as ROs.
   NOTA: Corte as ROs ao meio ou corte o tecido mal estruturado com uma navalha ao microscópio no prato que contém o fixador se as ROs forem muito grandes.
2. Remova o meio de cultura de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com uma pipeta. Adicione 1,5 mL de fixador de paraformaldeído a 2% e glutaraldeído a 2% diluído em tampão fosfato 0,1 M (PB), pH 7,4, e fixe em temperatura ambiente (RT) por 4 h. Armazene os tubos da microcentrífuga a 4 °C durante a noite.
   NOTA: Esta etapa pode ser pausada por 1 semana, mas recomenda-se reiniciar o mais cedo possível. Se os ROs forem deixados por mais tempo, pode causar autólise das células, levando à destruição da ultraestrutura dos ROs. Devido à fragilidade das ROs, evite operações rotativas, oscilantes, inversões ou severas.

3. Pós-fixação de ROs

1. Remova o fixador de paraformaldeído a 2% e glutaraldeído a 2% e lave com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato 0,01 M (PBS) em pH 7,4 por 3 x 10 min. Suspenda suavemente as ROs nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL durante o processo de lavagem para enxaguar completamente. Para cada dia adicional de fixação, aumente o número de lavagens em duas para remover o fixador residual o máximo possível.
2. Remova qualquer PBS restante usando uma pipeta e substitua-o por ~ 150 μL de ácido ósmico a 1% (OsO4) até que os blocos de tecido estejam submersos. Coloque os tubos da microcentrífuga em uma caixa escura para protegê-los da luz e se infiltrar em RT por 1 h.
   NOTA: OsO4 é um oxidante forte e deve ser manuseado em uma capela de exaustão.

4. Coloração e desidratação

NOTA: O desumidificador deve ser ligado para secar o ambiente a partir desta etapa.

1. Remova OsO4 usando uma pipeta, lave com PBS 0,01 M (pH 7,4) 3 x 10 min e, em seguida, lave 3 x 10 min com água deionizada.
   NOTA: Para garantir o enxágue completo das ROs, recomendamos suspender as ROs. Aspire OsO4 em um frasco de descarte dedicado.
2. Remova a última lavagem com água deionizada e substitua por ~ 150 μL por tubo (garanta a infiltração total dos blocos de tecido) de acetato de urânio e manche por 1-2 h em RT. Proteja os tubos da microcentrífuga da luz.
3. Retirar o acetato de urânio e substituí-lo por 1 mL de acetona a 50% na hotte, desidratando durante 10 min. Em seguida, use acetona 70%, 80%, 90%, 100% e 100% para desidratação gradiente das ROs sucessivamente. Cada desidratação dura 10 min.
   NOTA: Deixe um pouco de líquido para embeber os ROs para cada troca para evitar a exposição ao ar e à umidade. Além disso, opere rapidamente o mais rápido possível porque a acetona é volátil. Aspirar o acetato de urânio para um frasco de eliminação específico.

5. Infiltração

1. Descarte a acetona e adicione ~ 150 μL da mistura composta por acetona e resina Epon-812 na proporção de 1:1. Leve ao forno a 37 °C por 1 h.
2. Remova a mistura acima e substitua-a por uma mistura composta de acetona e resina Epon-812 na proporção de 1:4. Coloque-o em um forno a 37 ° C durante a noite.
3. Transfira os ROs para os novos tubos contendo ~ 500 μL de resina epóxi pura com cuidado e coloque-os em um forno a 45 ° C por 1 h.

6. Incorporação

1. Prepare os 30-50 mL de resina epóxi pura em um tubo de centrífuga de 50 mL misturando o kit de reagentes de acordo com as instruções do fabricante com antecedência. Gire a resina epóxi pura de cabeça para baixo lentamente por 30 min para reduzir as bolhas de ar introduzidas pelo misturador. Em seguida, deixe em forno a 37 °C por 20 min. Adicione 2/3 do volume de resina epóxi pura à ranhura do molde de incorporação.
2. Use um palito para pegar ROs no molde de incorporação equipado com resina epóxi pura.
3. Preencha a ranhura com resina epóxi pura até que ela se projete ou fique ligeiramente saliente.
4. Ajuste a posição das ROs em ambas as extremidades do molde de incorporação para incorporação direcional. Coloque o molde de embutir em um forno a 45 °C por 1-2 h e depois coloque-o em um forno a 65 °C por 48-72 h.

7. Posicionamento semifino

1. Lixe o excesso de resina epóxi ao redor do tecido das extremidades dos quatro lados mais longos do bloco de incorporação para formar uma face trapezoidal. Instale o bloco de incorporação no suporte de montagem de amostra e aparafuse o parafuso com uma chave de fenda L. Em seguida, instale facas de vidro no suporte da faca e aperte a porca manualmente.
2. Apare o excesso de resina até que a área desejada seja exposta.
3. Encha a calha da faca de vidro com água. Corte fatias semifinas com uma espessura de 1 μm usando um micrótomo semifino e coloque-as em uma lâmina de microscópio com uma agulha.
4. Adicione 50 μL de azul de toluidina a 1% para tingir fatias semifinas e incube por 1 min a 95 °C na placa de aquecimento. Enxágüe com água destilada por 2 min. Use um microscópio óptico comum de 20x para observar a estrutura das seções.

8. Seccionamento ultrafino

1. Instale os blocos de embutir e as facas de vidro conforme descrito na etapa 7.1. Ajuste a distância entre a faca e o bloco de tecido, o nível do líquido da pia e a velocidade de corte. Corte as seções ultrafinas com espessura de ~ 70-100 nm com um micrótomo ultrafino e coloque as fatias na malha de cobre (200 mesh) com o filme de suporte.
2. Pinte seções ultrafinas com citrato de chumbo a 3% por 15 min para aumentar o contraste em um procedimento de coloração dupla.

9. Imageamento de ROs por TEM

1. Inicie o software (consulte a Tabela de Materiais).
2. Clique no botão Modo de memória e marque cada seção ultrafina aproximadamente.
3. Procure estruturas sinápticas.
   1. Distinguir a estrutura laminada de ROs em baixa ampliação.
   2. Localize a camada nuclear externa (ONL), que mostra uma estrutura nuclear com uma densidade eletrônica mais profunda. Posteriormente, navegue até o terminal do fotorreceptor, onde numerosas vesículas se acumulam. Procure os terminais de haste com uma única fita sináptica e os terminais de cone com várias fitas sinápticas.
   3. Vá para a camada plexiforme interna (IPL) e procure uma estrutura semelhante com uma pequena fita.
4. Capture a imagem microscópica.
   1. Clique em Iniciar e insira a potência de ampliação correspondente.
   2. Salve as imagens.

Resultados

O estabelecimento de ROs 3D por meio da diferenciação de iPSC fornece uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos de doenças da retina e a terapia de reposição de células-tronco. Embora outros tenham demonstrado as conexões sinápticas em ROs funcional e imunocitoquimicamente, a evidência direta de sinapses convencionais e de fita é muito limitada. Aqui apresentamos um método para investigar a ultraestrutura de dois tipos de sinapses em ROs por MET. Após 180 dias de cul...

Discussão

Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para observação da ultraestrutura sináptica convencional e de fita em ROs por TEM. Esse protocolo é baseado nos métodos de preparo retiniano descritos anteriormente com algumas modificações²⁰. Para melhorar a taxa de sucesso do tratamento da amostra e a qualidade das micrografias de MET, considere os seguintes pontos-chave. Em primeiro lugar, é importante reconhecer que as ROs se desenvolvem a partir de iPS...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	430167
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
B27 supplement	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Copper grids	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	AZH400HH
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Bacterial protease
DMEM/F12 medium	Gibco	#11320033
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ10592
Epon-812 resin	Electron Microscopy Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Lead citrate	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-glutamine substitute
Matrigel	Corning	356234
Microscope slide	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of PB/PBS
Non-essential amino acids	Sigma	#M7145
Optical microscope	Lab Binocular Biological Microscope	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Oven	Bluepard	BPG9040A
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
Transmission Electron Microscopes	HITACHI	H-7500
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoethanol	Sigma	444203