JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo fornisce una procedura di preparazione ottimizzata ed elaborata per campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione. È adatto per applicazioni che prevedono l'analisi delle sinapsi in organoidi retinici maturi.

Abstract

Gli organoidi retinici (RO) sono un sistema di coltura tridimensionale che imita le caratteristiche della retina umana che si sono differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) in condizioni specifiche. Lo sviluppo e la maturazione delle sinapsi nelle RO sono stati studiati immunocitochimicamente e funzionalmente. Tuttavia, l'evidenza diretta dell'ultrastruttura sinaptica di contatto è limitata, contenendo sia sinapsi speciali a nastro che sinapsi chimiche convenzionali. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è caratterizzata da un'alta risoluzione e da una storia rispettabile che chiarisce lo sviluppo retinico e la maturazione delle sinapsi nell'uomo e in varie specie. È un potente strumento per esplorare la struttura sinaptica nelle RO ed è ampiamente utilizzato nel campo della ricerca sulle RO. Pertanto, per esplorare meglio la struttura dei contatti sinaptici RO su scala nanometrica e ottenere prove microscopiche di alta qualità, abbiamo sviluppato un metodo semplice e ripetibile di preparazione del campione RO TEM. Questo documento descrive il protocollo, i reagenti utilizzati e i passaggi dettagliati, tra cui la preparazione della fissazione RO, la post-fissazione, l'incorporamento e la visualizzazione.

Introduzione

La retina, un organo sensoriale visivo vitale nell'uomo e nei mammiferi, mostra una struttura laminata distinta caratterizzata da tre strati nucleari che ospitano somi neuronali e due strati plessiformi formati da connessioni sinaptiche1, comprese le sinapsi convenzionali e la sinapsi a nastro specializzata 2,3. La sinapsi a nastro svolge un ruolo cruciale nella trasmissione degli impulsi delle vescicole in modo graduale 2,3. Il processo visivo coinvolge la trasmissione del segnale elettro-ottico attraverso vari livelli di neuroni e sinapsi, raggiungendo infine la corteccia visiva 4,5.

Gli organoidi retinici (RO) rappresentano un sistema di coltura tridimensionale (3D) derivato da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), che imita gli stati fisiologici del tessuto retinico in vitro 1,6,7. Questo approccio è promettente per lo studio delle malattie retiniche8, lo screening farmacologico9 e funge da potenziale terapia per le condizioni degenerative retiniche irreversibili come la retinite pigmentosa10 e il glaucoma11. Essendo un potente sistema di conduzione ottica in vitro, la sinapsi all'interno delle RO è una struttura cruciale che facilita l'efficace trasformazione e trasferimento del segnale5.

Lo sviluppo dell'RO può essere approssimativamente suddiviso in tre fasi in base ai loro tratti morfologici e profili di espressione molecolare 6,12. Le RO allo stadio 1 (circa D21-D60) comprendono cellule progenitrici neurali della retina, molte cellule gangliari retiniche (RGC) e alcune cellule amacrine starburst (SAC), corrispondenti alla prima epoca dello sviluppo fetale umano. Nello stadio 2 (circa D50-D150), gli RO esprimono alcuni precursori dei fotorecettori, interneuroni e geni correlati alla sinaptogenesi, che rappresenta una fase di transizione. I fotorecettori sviluppano la maturità nello stadio 3 delle RO (circa dopo D100-D150), corrispondente al terzo stadio dello sviluppo fetale umano 6,12,13. In particolare, rispetto alle RO dello stadio 1 e dello stadio 2, le RO dello stadio 3 hanno una struttura lamellare distinta le cui sinapsi sono maturate12, inclusa la presenza di sinapsi a nastro14. Inoltre, un recente studio ha confermato che le sinapsi mature esistono nella trasmissione di segnali luminosi, indicando che sono funzionali13. Pertanto, le RO allo stadio 3 sono spesso selezionate per studiare la struttura sinaptica.

L'immunoistochimica è ampiamente applicata allo studio dell'espressione di varie proteine molecolari. Tuttavia, il limite della microscopia ottica risiede nella sua capacità di osservare solo un numero limitato di cellule e molecole specifiche alla volta, con conseguente mancanza di un'analisi completa delle relazioni tra le cellule e l'ambiente circostante. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è caratterizzata da un'alta risoluzione, con una risoluzione limitata di 0,1-0,2 nm, superando il microscopio ottico di ~10-20 volte15. Compensa i difetti della microscopia ottica e viene utilizzato per chiarire lo sviluppo della retina e la maturazione delle sinapsi nell'uomo16,17 e in varie specie 18,19,20,21. La TEM consente la distinzione diretta delle componenti presinaptiche e postsinaptiche18,20 e consente anche l'osservazione completa di strutture subcellulari come i nastri 2,3, le vescicole22 e i mitocondri23. Pertanto, la TEM è uno strumento essenziale per identificare i tipi di sinapsi ed esplorare l'ultrastruttura dei contatti sinaptici nelle RO su scala nanometrica.

È fondamentale notare che la preparazione del campione è di grande importanza per l'acquisizione di micrografie elettroniche di alta qualità. Sebbene alcuni studi abbiano eseguito EM su RO 12,13,24, le procedure dettagliate non sono chiare. Poiché la qualità dell'immagine al microscopio elettronico dipende in larga misura dall'effetto della fissazione RO e della permeazione del reagente, durante la preparazione è necessario considerare vari fattori importanti. Di conseguenza, per studiare meglio i contatti sinaptici nelle RO, presentiamo un metodo con una buona riproducibilità che mostra i punti operativi del fissaggio, dell'inclusione e dell'identificazione dei siti di osservazione delle RO.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Ottenimento di RO da iPSC25

NOTA: Le RO sono state derivate dalle iPSC modificando la procedura precedentemente riportata.

  1. Dissociare le iPSC a ~90% di confluenza utilizzando una proteasi batterica (vedi Tabella dei materiali). Taglia le colonie a pezzi e raschia con un sollevatore di cellule.
  2. Dopo la raccolta, risospendere i gruppi di cellule in 0,25 mL di Matrigel ghiacciato. Dopo 20 minuti di incubazione a 37 °C, spargere il gel solidificato con il terreno DMEM/F12 (integratore di N2 allo 0,5%, integratore di B27 all'1%, 0,1 mM di β-mercaptoetanolo, 0,2 mM di sostituto della L-glutammina, 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina). Definisci questo tempo come il giorno 0 di differenziazione.
  3. Dopo 5 giorni di coltura galleggiante, le cellule si raggruppano per formare cisti cellulari. Trasferisci queste cisti cellulari in una capsula di Petri da 100 mm dove ora aderiranno e cresceranno.
  4. Il giorno 15, utilizzare la proteasi batterica per dissociare le cellule aderenti e coltivarle in terreno DMEM/F12 (integratore di B27 al 2%, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali).
  5. Il giorno 21, sostituire il terreno con 20 ml di terreno contenente siero (terreno DMEM/F12, 8% FBS, 2% integratore di B27, 100 mM di taurina e 2 mM di sostituto della L-glutammina) e sostituire il terreno ogni settimana.

2. Fissazione anteriore delle RO

  1. Spostare delicatamente una delle RO coltivate (~D180, una dimensione di circa 1~2 mm di diametro è ottimale) dalla piastra di Petri a provette per microcentrifuga da 1,5 mL con una pipetta e contrassegnare le informazioni rilevanti sulle RO.
    NOTA: Tagliare a metà le RO o tagliare il tessuto mal strutturato con un rasoio al microscopio nella piastra contenente il fissativo se le RO sono troppo grandi.
  2. Rimuovere il terreno di coltura da 1,5 mL di provette per microcentrifuga con una pipetta. Aggiungere 1,5 mL di fissativo paraformaldeide al 2% e glutaraldeide diluito in tampone fosfato (PB) 0,1 M, pH 7,4 e fissare a temperatura ambiente (RT) per 4 ore. Conservare le provette per microcentrifuga a 4 °C per una notte.
    NOTA: Questo passaggio può essere messo in pausa per 1 settimana, ma si consiglia di riavviarlo il prima possibile. Se le RO vengono lasciate più a lungo, può causare l'autolisi delle cellule che porta alla distruzione dell'ultrastruttura delle RO. A causa della fragilità degli RO, evitare operazioni di rotazione, oscillazione, ribaltamento o operazioni brusche.

3. Post-fissazione delle RO

  1. Rimuovere il fissativo 2% paraformaldeide-2% glutaraldeide e lavare con 1 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato 0,01 M (PBS) a pH 7,4 per 3 x 10 min. Sospendere delicatamente le RO nelle provette da microcentrifuga da 1,5 ml durante il processo di lavaggio per un risciacquo completo. Per ogni giorno aggiuntivo di fissaggio, aumentare il numero di lavaggi di due per rimuovere il più possibile il fissativo residuo.
  2. Rimuovere il PBS rimanente utilizzando una pipetta e sostituirlo con ~150 μL di acido osmico all'1% (OsO4) fino a quando i blocchi di tessuto non sono sommersi. Posizionare le provette per microcentrifuga in una scatola buia per proteggerle dalla luce e infiltrarle a RT per 1 ora.
    NOTA: OsO4 è un forte ossidante e deve essere maneggiato in una cappa aspirante.

4. Colorazione e disidratazione

NOTA: Il deumidificatore deve essere acceso per asciugare l'ambiente da questo passaggio.

  1. Rimuovere l'OsO4 utilizzando una pipetta, lavare con 0,01 M PBS (pH 7,4) 3 x 10 min, quindi lavare 3 x 10 min con acqua deionizzata.
    NOTA: Per garantire il completo risciacquo degli RO, si consiglia di sospendere gli RO. Aspirare OsO4 in un flacone per lo smaltimento dedicato.
  2. Rimuovere l'ultimo lavaggio con acqua deionizzata e sostituirlo con ~150 μL per provetta (garantire la completa infiltrazione dei blocchi di tessuto) di acetato di uranio e colorare per 1-2 ore a RT. Proteggere le provette da microcentrifuga dalla luce.
  3. Rimuovere l'acetato di uranio e sostituirlo con 1 mL di acetone al 50% nella cappa aspirante, disidratando per 10 minuti. Quindi, utilizzare acetone al 70%, 80%, 90%, 100% e 100% per la disidratazione graduale degli RO in successione. Ogni disidratazione dura 10 minuti.
    NOTA: Lasciare un po' di liquido in ammollo per ogni scambio per evitare l'esposizione all'aria e all'umidità. Inoltre, operare rapidamente il prima possibile perché l'acetone è volatile. Aspirare l'acetato di uranio in un apposito flacone per lo smaltimento.

5. Infiltrazione

  1. Scartare l'acetone e aggiungere ~150 μl della miscela composta da acetone e resina Epon-812 in un rapporto di 1:1. Mettere in forno a 37 °C per 1 ora.
  2. Rimuovere la miscela di cui sopra e sostituirla con una miscela composta da acetone e resina Epon-812 in un rapporto di 1:4. Mettere in forno a 37 °C per una notte.
  3. Trasferire con cura gli RO nelle nuove provette contenenti ~500 μL di resina epossidica pura e metterli in forno a 45 °C per 1 ora.

6. Incorporamento

  1. Preparare i 30-50 mL di resina epossidica pura in una provetta da centrifuga da 50 mL mescolando in anticipo il kit di reagenti secondo le istruzioni del produttore. Ruotare lentamente la resina epossidica pura per 30 minuti per ridurre le bolle d'aria introdotte dal miscelatore. Quindi, lasciare in forno a 37 °C per 20 min. Aggiungere 2/3 del volume di resina epossidica pura alla scanalatura dello stampo di inclusione.
  2. Usa uno stuzzicadenti per raccogliere gli RO nello stampo da inclusione dotato di resina epossidica pura.
  3. Riempire la scanalatura con resina epossidica pura fino a quando non sporge o si gonfia leggermente.
  4. Regolare la posizione delle RO su entrambe le estremità dello stampo di inclusione per l'incorporamento direzionale. Mettere lo stampo da incasso in forno a 45 °C per 1-2 ore e poi metterlo in forno a 65 °C per 48-72 ore.

7. Posizionamento semi-sottile

  1. Carteggiare la resina epossidica in eccesso attorno al tessuto dalle estremità dei quattro lati più lunghi del blocco di inclusione per formare una faccia trapezoidale. Installare il blocco di inclusione nel supporto di montaggio del campione e avvitare il bullone con un cacciavite a L. Quindi, installare i coltelli di vetro sul supporto per coltelli e serrare manualmente il dado.
  2. Taglia via la resina in eccesso fino a quando l'area desiderata non è esposta.
  3. Riempi d'acqua la mangiatoia del coltello di vetro. Tagliare le fette semisottili a uno spessore di 1 μm utilizzando un microtomo semisottile e adagiarle su un vetrino da microscopio con un ago.
  4. Aggiungere 50 μl di blu di toluidina all'1% per colorare le fette semisottili e incubare per 1 minuto a 95 °C sulla piastra riscaldante. Risciacquare con acqua distillata per 2 min. Utilizzare un normale microscopio ottico 20x per osservare la struttura delle sezioni.

8. Sezionamento ultrasottile

  1. Installare i blocchi di incorporamento e i coltelli di vetro come descritto al punto 7.1. Regola la distanza tra il coltello e il blocco di tessuto, il livello del liquido del lavandino e la velocità di affettatura. Tagliare le sezioni ultrasottili con uno spessore di ~70-100 nm con un microtomo ultrasottile e raccogliere le fette sulla rete di rame (200 mesh) con la pellicola di supporto.
  2. Colorare le sezioni ultrasottili con citrato di piombo al 3% per 15 minuti per migliorare il contrasto in una procedura di doppia colorazione.

9. Imaging RO mediante TEM

  1. Avviare il software (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Fare clic sul pulsante Modalità memoria e contrassegnare approssimativamente ogni sezione ultrasottile.
  3. Ricerca di strutture sinaptiche.
    1. Distinguere la struttura laminata delle RO a basso ingrandimento.
    2. Individua lo strato nucleare esterno (ONL), che mostra una struttura nucleare con una densità elettronica più profonda. Successivamente, navigare fino al terminale del fotorecettore dove si accumulano numerose vescicole. Cerca i terminali a barra con un singolo nastro sinaptico e i terminali a cono con più nastri sinaptici.
    3. Passa allo strato plessiforme interno (IPL) e cerca una struttura simile con un piccolo nastro.
  4. Cattura l'immagine microscopica.
    1. Fare clic su Start e inserire la potenza di ingrandimento corrispondente.
    2. Salva le immagini.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

La creazione di RO 3D attraverso la differenziazione delle iPSC fornisce un potente strumento per lo studio dei meccanismi delle malattie retiniche e la terapia sostitutiva con cellule staminali. Sebbene altri abbiano dimostrato le connessioni sinaptiche nelle RO funzionalmente e immunocitochimicamente, l'evidenza diretta di sinapsi convenzionali e a nastro è molto limitata. Qui presentiamo un metodo per studiare l'ultrastruttura di due tipi di sinapsi nelle RO mediante TEM. Dopo 180 gi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

In questo articolo, abbiamo presentato un protocollo dettagliato per l'osservazione dell'ultrastruttura sinaptica convenzionale e a nastro nelle RO mediante TEM. Questo protocollo si basa sui metodi di preparazione della retina precedentemente descritti con alcune modifiche20. Per migliorare il tasso di successo del trattamento dei campioni e la qualità delle micrografie TEM, considerare i seguenti punti chiave. In primo luogo, è importante riconoscere che le RO...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Key Research and Development Program of China (2022YFA1105503), dello State Key Laboratory of Neuroscience (SKLN-202103) e della Zhejiang Natural Science Foundation of China (Y21H120019), della Natural Science Foundation of China (82070981).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Petri dishCorning430167
AcetoneElectron Microscopy Science10000
B27 supplementGibcoA3582801
Cell lifterSanta Cruzsc-395251
Copper gridsBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.AZH400HH
DigitalMicrograph SoftwareGatan, Inc.Software
DispaseStemCell Technologies#07913Bacterial protease
DMEM/F12 mediumGibco#11320033
Embedding moldBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ10592
Epon-812 resinElectron Microscopy Science#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)Biological Industries#04-0021A
GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
hiPSCShownin Biotechnology Co. Ltd.RC01001-A
Lead citrateBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ02618
L-GlutaMaxLife Technologies#35050061L-glutamine substitute
MatrigelCorning356234
Microscope slideCITOTEST80312-3161
N2 supplementGibco17502048
Na2HPO4· 12H2OSigma71650A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2OSigma71507A component of PB/PBS
Non-essential amino acidsSigma#M7145
Optical microscopeLab Binocular Biological MicroscopeXsz-107bnii
OsO4TED PELLA4008-160501
OvenBluepardBPG9040A
ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
Penicillin-StreptomycinGibco#15140-122
Semi/ultrathin microtomeReichert-Jung396649
TaurineSigma#T0625
Toluidine blueSangon BiotechE670105-0100
Transmission Electron MicroscopesHITACHIH-7500
Uranyl acetateTED PELLACA96049
β-mercaptoethanolSigma444203

Riferimenti

  1. Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489(2021).
  2. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  3. Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. Ribbon synapses of the retina. Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).
  4. Webvision: The organization of the retina and visual. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. , University of Utah Health Sciences Center, Webvision. Salt Lake City (UT). (1995).
  5. Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2. Elife. 7, e30388(2018).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), dev189746 (2020).
  8. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).
  9. Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. Human-on-chip for therapy development and fundamental science. Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).
  10. Chahine Karam, F., et al. Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability. J Pers Med. 12 (3), 502(2022).
  11. Lo, J., et al. Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies. Mol Aspects Med. 94, 101219(2023).
  12. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  13. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), e1634 1623-1640 (2020).
  14. Cora, V., et al. A cleared view on retinal organoids. Cells. 8 (5), 391(2019).
  15. Żak, A. M. Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives. Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).
  16. Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. The anatomy of the foveola reinvestigated. PeerJ. 6, e4482(2018).
  17. Syrbe, S., et al. Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study. Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).
  18. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  19. Liu, X., et al. Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish. Front Cell Dev Biol. 11, 1169941(2023).
  20. Yang, Q., et al. Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  21. Zhang, J., et al. Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background. Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).
  22. De Robertis, E., Franchi, C. M. Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones. J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).
  23. Frey, T. G., Mannella, C. A. The internal structure of mitochondria. Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).
  24. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  25. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Front Cell Dev Biol. 8, 128(2020).
  26. Afanasyeva, T. aV., et al. A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications. Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Parole chiave Organoide retinicocellule staminali pluripotenti indottemicroscopia elettronica a trasmissionestruttura sinapticapreparazione del campionefissazioneinclusioneultrastruttura

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati