Preparazione di campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione

Riepilogo

Questo protocollo fornisce una procedura di preparazione ottimizzata ed elaborata per campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione. È adatto per applicazioni che prevedono l'analisi delle sinapsi in organoidi retinici maturi.

Abstract

Gli organoidi retinici (RO) sono un sistema di coltura tridimensionale che imita le caratteristiche della retina umana che si sono differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) in condizioni specifiche. Lo sviluppo e la maturazione delle sinapsi nelle RO sono stati studiati immunocitochimicamente e funzionalmente. Tuttavia, l'evidenza diretta dell'ultrastruttura sinaptica di contatto è limitata, contenendo sia sinapsi speciali a nastro che sinapsi chimiche convenzionali. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è caratterizzata da un'alta risoluzione e da una storia rispettabile che chiarisce lo sviluppo retinico e la maturazione delle sinapsi nell'uomo e in varie specie. È un potente strumento per esplorare la struttura sinaptica nelle RO ed è ampiamente utilizzato nel campo della ricerca sulle RO. Pertanto, per esplorare meglio la struttura dei contatti sinaptici RO su scala nanometrica e ottenere prove microscopiche di alta qualità, abbiamo sviluppato un metodo semplice e ripetibile di preparazione del campione RO TEM. Questo documento descrive il protocollo, i reagenti utilizzati e i passaggi dettagliati, tra cui la preparazione della fissazione RO, la post-fissazione, l'incorporamento e la visualizzazione.

Introduzione

La retina, un organo sensoriale visivo vitale nell'uomo e nei mammiferi, mostra una struttura laminata distinta caratterizzata da tre strati nucleari che ospitano somi neuronali e due strati plessiformi formati da connessioni sinaptiche¹, comprese le sinapsi convenzionali e la sinapsi a nastro specializzata ^2,3. La sinapsi a nastro svolge un ruolo cruciale nella trasmissione degli impulsi delle vescicole in modo graduale ^2,3. Il processo visivo coinvolge la trasmissione del segnale elettro-ottic....

Protocollo

1. Ottenimento di RO da iPSC²⁵

NOTA: Le RO sono state derivate dalle iPSC modificando la procedura precedentemente riportata.

1. Dissociare le iPSC a ~90% di confluenza utilizzando una proteasi batterica (vedi Tabella dei materiali). Taglia le colonie a pezzi e raschia con un sollevatore di cellule.
2. Dopo la raccolta, risospendere i gruppi di cellule in 0,25 mL di Matrigel ghiacciato. Dopo 20 minuti di incubazione a 37 °C, spargere il gel solidificato con il terreno DMEM/F12 (integratore di N2 allo 0,5%, integratore d....

Discussione

In questo articolo, abbiamo presentato un protocollo dettagliato per l'osservazione dell'ultrastruttura sinaptica convenzionale e a nastro nelle RO mediante TEM. Questo protocollo si basa sui metodi di preparazione della retina precedentemente descritti con alcune modifiche²⁰. Per migliorare il tasso di successo del trattamento dei campioni e la qualità delle micrografie TEM, considerare i seguenti punti chiave. In primo luogo, è importante riconoscere che le RO.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	430167
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
B27 supplement	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Copper grids	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	AZH400HH
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Bacterial protease
DMEM/F12 medium	Gibco	#11320033
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ10592
Epon-812 resin	Electron Microscopy Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Lead citrate	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-glutamine substitute
Matrigel	Corning	356234
Microscope slide	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of PB/PBS
Non-essential amino acids	Sigma	#M7145
Optical microscope	Lab Binocular Biological Microscope	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Oven	Bluepard	BPG9040A
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
Transmission Electron Microscopes	HITACHI	H-7500
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoethanol	Sigma	444203