制备用于透射电子显微镜的视网膜类器官样品

摘要

该协议为用于透射电子显微镜的视网膜类器官样品提供了优化和详细的制备程序。它适用于涉及成熟视网膜类器官中突触分析的应用。

摘要

视网膜类器官 （ROs） 是一种三维培养系统，模拟在特定条件下从诱导多能干细胞 （iPSC） 分化而来的人类视网膜特征。RO 中的突触发育和成熟已在免疫细胞化学和功能上进行了研究。然而，突触接触超微结构的直接证据是有限的，包含特殊的带状突触和常规的化学突触。透射电子显微镜 （TEM） 的特点是高分辨率和可观的历史，阐明了人类和各种物种的视网膜发育和突触成熟。它是探索 ROs 突触结构的有力工具，广泛应用于 ROs 的研究领域。因此，为了更好地在纳米尺度上探索 RO 突触接触的结构并获得高质量的显微证据，我们开发了一种简单且可重复的 RO TEM 样品制备方法。本文描述了实验步骤、使用的试剂和详细步骤，包括 RO 固定准备、固定后、包埋和可视化。

引言

视网膜是人类和哺乳动物的重要视觉感觉器官，表现出独特的层状结构，其特征是三个核层容纳神经元胞体和两个由突触连接形成的丛状层¹，包括常规突触和特化带状突触 ^2,3。带状突触在以分级方式传递囊泡冲动中起着至关重要的作用 ^2,3。视觉过程涉及电光信号跨不同层次的神经元和突触传输，最终到达视觉皮层 ^4,5。

视网膜类器官 （RO） 代表源自诱导多能干细胞 （iPSC） 的三维 （3D） 培养系统，在体外模拟视网膜组织的生理状态 ^1,6,7。这种方法有望用于研究视网膜疾病⁸ （retina diseases）、药物筛查⁹ （dr....

研究方案

1. 从 iPSC 获得 RO²⁵

注意：RO 是通过修改先前报道的程序从 iPSC 衍生的。

1. 使用细菌蛋白酶以 ~90% 汇合度解离 iPSC（参见 材料表）。将菌落切成块，然后用细胞提升器刮擦。
2. 收集后，将细胞簇重悬于 0.25 mL 冰冷的 Matrigel 中。在 37 °C 下孵育 20 分钟后，用 DMEM/F12 培养基（0.5% N2 补充剂、1% B27 补充剂、0.1 mM β-巯基乙醇、0.2 mM L-谷氨酰胺替代品、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素）分散固化凝胶。将此时间定义为分化的第 0 天。
3. 漂浮培养 5 天后，细胞分组形成细胞包囊。将这些细胞囊肿转移到 100 mm 培养皿中，它们现在将粘附并生长。
4. 第 15 天，使用细菌蛋白酶解离粘附细胞，并在 DMEM/F12 培养基（2% B27 补充剂，0.1 mM 非必需氨基酸）中培养它们。
5. 第 21 天，用 20 mL 含血清培养基（DMEM/F12 培养基、8% FBS、2% B27 补充剂、100 mM 牛磺酸和 2 mM L-谷氨酰胺替代品）更换培养基，并每周....

讨论

在本文中，我们提出了一种通过 TEM 观察 RO 中常规突触超微结构和带状突触超微结构的详细方案。该方案基于先前描述的视网膜制备方法，并进行了一些修改²⁰。为了提高样品处理的成功率和 TEM 显微照片的质量，请考虑以下关键点。首先，重要的是要承认 RO 从 iPSC 发育而来，形成缺乏脉管系统 ^6,26 和神经胶?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	430167
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
B27 supplement	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Copper grids	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	AZH400HH
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Bacterial protease
DMEM/F12 medium	Gibco	#11320033
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ10592
Epon-812 resin	Electron Microscopy Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Lead citrate	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-glutamine substitute
Matrigel	Corning	356234
Microscope slide	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of PB/PBS
Non-essential amino acids	Sigma	#M7145
Optical microscope	Lab Binocular Biological Microscope	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Oven	Bluepard	BPG9040A
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
Transmission Electron Microscopes	HITACHI	H-7500
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoethanol	Sigma	444203