透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

要約

このプロトコールは、透過型電子顕微鏡用のレチナールオルガノイドサンプルの最適化された精巧な調製手順を提供します。成熟した網膜オルガノイドのシナプス分析を含むアプリケーションに適しています。

要約

レチナールオルガノイド(RO)は、特定の条件下で人工多能性幹細胞(iPSC)から分化したヒトの網膜の特徴を模倣した三次元培養システムです。ROにおけるSynapseの発生と成熟は、免疫細胞化学的および機能的に研究されています。しかし、シナプス接触超微細構造の直接的な証拠は限られており、特殊なリボンシナプスと従来の化学シナプスの両方が含まれています。透過型電子顕微鏡(TEM)は、高解像度で、ヒトや様々な種における網膜の発達とシナプスの成熟を解明する立派な歴史を特徴としています。これは、ROのシナプス構造を探索するための強力なツールであり、ROの研究分野で広く使用されています。したがって、ナノスケールでのROシナプス接触の構造をよりよく探索し、高品質の顕微鏡的証拠を得るために、RO TEMサンプル調製の簡単で再現性のある方法を開発しました。このホワイトペーパーでは、プロトコル、使用した試薬、およびRO固定調製、固定後、埋め込み、視覚化などの詳細な手順について説明します。

概要

ヒトや哺乳類の重要な視覚感覚器官である網膜は、ニューロン体細胞を収容する3つの核層^{と、従来の}シナプスと特殊なリボンシナプス^2,3を含むシナプス結合1によって形成される2つのフジツ状層を特徴とする明確な積層構造を示しています。リボンシナプスは、小胞のインパルスを段階的に伝達する上で重要な役割を果たします^2,3。視覚プロセスには、さまざまなレベルのニューロンとシナプスにわたる電気光学信号の伝達が含まれ、最終的には視覚野^{に到達します4,5}。

レチナールオルガノイド(RO)は、人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する三次元(3D)培養システムであり、in vitroで網膜組織の生理学的状態を模倣しています^1,6,7。このア....

プロトコル

1. iPS細胞からのROの取得²⁵

注:ROは、以前に報告された手順を変更することにより、iPSCから導き出されました。

1. 細菌性プロテアーゼを用いて~90%のコンフルエンスでiPS細胞を解離します( 材料の表を参照)。コロニーを細かく刻み、セルリフターでこすり落とします。
2. 採取後、細胞のクラスターを0.25 mLの氷冷マトリゲルに再懸濁します。37°Cで20分間インキュベートした後、固化したゲルをDMEM/F12培地(0.5% N2サプリメント、1% B27サプリメント、0.1 mM β-メルカプトエタノール、0.2 mM L-グルタミン代替品、100 U/mLペニシリン、100 mg/mLストレプトマイシン)で散らします。この時間を微分の 0 日目と定義します。
3. 5日間の浮遊培養後、細胞はグループ化して細胞嚢胞を形成します。これらの細胞嚢胞を100mmのシャーレに移し、そこで接着して成長させます。
4. 15日目に、細菌プロテアーゼを使用して接着細胞を解離し、DMEM/F12培地(2%B27サプリメント、0.1 mM非必須アミノ酸)で培養します。
5. 21日目に、培地を....

ディスカッション

この記事では、TEMによってROの従来のシナプス超微細構造とリボンシナプスの超微細構造を観察するための詳細なプロトコルを紹介しました。このプロトコルは、前述の網膜調製方法に基づいており、いくつかの変更が加えられています²⁰。サンプル処理の成功率とTEM顕微鏡写真の品質を向上させるためには、以下のポイントを考慮してください。?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	430167
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
B27 supplement	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Copper grids	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	AZH400HH
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Bacterial protease
DMEM/F12 medium	Gibco	#11320033
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ10592
Epon-812 resin	Electron Microscopy Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Lead citrate	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-glutamine substitute
Matrigel	Corning	356234
Microscope slide	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of PB/PBS
Non-essential amino acids	Sigma	#M7145
Optical microscope	Lab Binocular Biological Microscope	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Oven	Bluepard	BPG9040A
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
Transmission Electron Microscopes	HITACHI	H-7500
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoethanol	Sigma	444203