הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

Summary

פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.

Abstract

אורגנואידים ברשתית (ROs) הם מערכת תרבית תלת ממדית המחקה תכונות רשתית אנושיות שהתמיינו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) בתנאים ספציפיים. התפתחות סינפסה והבשלה ב-ROs נחקרו מבחינה אימונוציטוכימית ותפקודית. עם זאת, העדות הישירה לאולטרה-מבנה המגע הסינפטי מוגבלת, ומכילה הן סינפסות סרט מיוחדות והן סינפסות כימיות קונבנציונליות. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) מאופיין ברזולוציה גבוהה והיסטוריה מכובדת המבהירה התפתחות רשתית והבשלת סינפסות בבני אדם ומינים שונים. זהו כלי רב עוצמה לחקור מבנה סינפטי ROs והוא נמצא בשימוש נרחב בתחום המחקר של ROs. לכן, כדי לחקור טוב יותר את המבנה של מגעים סינפטיים RO בקנה מידה ננומטרי ולקבל ראיות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה, פיתחנו שיטה פשוטה וחוזרת להכנת דגימות RO TEM. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול, ריאגנטים שבהם נעשה שימוש ושלבים מפורטים, כולל הכנת קיבוע RO, קיבוע לאחר קיבוע, הטבעה והדמיה.

Introduction

הרשתית, איבר חישה חזותי חיוני בבני אדם וביונקים, מציגה מבנה למינציה מובהק המאופיין בשלוש שכבות גרעיניות המאחסנות סומות נוירונים ושתי שכבות פרספקס שנוצרו על ידי קשרים סינפטיים¹, כולל סינפסות קונבנציונליות וסינפסת הסרט המיוחדת ^2,3. סינפסת הסרט ממלאת תפקיד מכריע בהעברת דחפים שלפוחית באופן מדורג ^2,3. תהליך הראייה כולל העברת אותות אלקטרו-אופטיים על פני רמות שונות של נוירונים וסינפסות, ובסופו של דבר מגיע לקליפת המוח הראייתית ^4,5.

Protocol

1. קבלת ROs מ- iPSCs²⁵

הערה: ROs נגזרו מ- iPSCs על-ידי שינוי ההליך שדווח בעבר.

1. נתק iPSCs במפגש ~90% באמצעות פרוטאז חיידקי (ראה טבלת חומרים). קוצצים את המושבות לחתיכות ומגרדים אותן עם מרים תאים.
2. לאחר האיסוף, להשעות מחדש את אשכולות התאים ב 0.25 מ"ל של Matrigel קר כקרח. לאחר 20 דקות דגירה ב-37°C, פזרו את הג'ל המוצק עם מדיום DMEM/F12 (תוסף N2 0.5%, תוסף B27 1%, 0.1 mM β-מרקפטואתנול, 0.2 mM L-תחליף גלוטמין, 100 U/mL פניצילין ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין). הגדירו זמן זה כיום 0 של בידול.
3. לאחר 5 ימים של תרבית צפה, ....

תוצאות

הקמת ROs תלת-ממדיים באמצעות התמיינות iPSC מספקת כלי רב עוצמה לחקר מנגנונים של מחלות רשתית וטיפול בתחליפי תאי גזע. למרות שאחרים הדגימו את הקשרים הסינפטיים ב-ROs מבחינה תפקודית ואימונוציטוכימית, עדויות ישירות לסינפסות קונבנציונליות וסרטיות מוגבלות מאוד. כאן אנו מציגים שיטה ל?.......

Discussion

במאמר זה, הצגנו פרוטוקול מפורט לצפייה באולטרה-מבנה קונבנציונלי וסינפטי של הסרט ב-ROs על ידי TEM. פרוטוקול זה מבוסס על שיטות הכנת הרשתית שתוארו לעיל עם כמה שינויים²⁰. כדי לשפר את שיעור ההצלחה של הטיפול בדגימה ואת האיכות של מיקרוגרפים TEM, שקול את נקודות המפתח הבאות........

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	430167
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
B27 supplement	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Copper grids	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	AZH400HH
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Bacterial protease
DMEM/F12 medium	Gibco	#11320033
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ10592
Epon-812 resin	Electron Microscopy Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Lead citrate	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-glutamine substitute
Matrigel	Corning	356234
Microscope slide	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of PB/PBS
Non-essential amino acids	Sigma	#M7145
Optical microscope	Lab Binocular Biological Microscope	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Oven	Bluepard	BPG9040A
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
Transmission Electron Microscopes	HITACHI	H-7500
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoethanol	Sigma	444203