A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.

Abstract

אורגנואידים ברשתית (ROs) הם מערכת תרבית תלת ממדית המחקה תכונות רשתית אנושיות שהתמיינו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) בתנאים ספציפיים. התפתחות סינפסה והבשלה ב-ROs נחקרו מבחינה אימונוציטוכימית ותפקודית. עם זאת, העדות הישירה לאולטרה-מבנה המגע הסינפטי מוגבלת, ומכילה הן סינפסות סרט מיוחדות והן סינפסות כימיות קונבנציונליות. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) מאופיין ברזולוציה גבוהה והיסטוריה מכובדת המבהירה התפתחות רשתית והבשלת סינפסות בבני אדם ומינים שונים. זהו כלי רב עוצמה לחקור מבנה סינפטי ROs והוא נמצא בשימוש נרחב בתחום המחקר של ROs. לכן, כדי לחקור טוב יותר את המבנה של מגעים סינפטיים RO בקנה מידה ננומטרי ולקבל ראיות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה, פיתחנו שיטה פשוטה וחוזרת להכנת דגימות RO TEM. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול, ריאגנטים שבהם נעשה שימוש ושלבים מפורטים, כולל הכנת קיבוע RO, קיבוע לאחר קיבוע, הטבעה והדמיה.

Introduction

הרשתית, איבר חישה חזותי חיוני בבני אדם וביונקים, מציגה מבנה למינציה מובהק המאופיין בשלוש שכבות גרעיניות המאחסנות סומות נוירונים ושתי שכבות פרספקס שנוצרו על ידי קשרים סינפטיים1, כולל סינפסות קונבנציונליות וסינפסת הסרט המיוחדת 2,3. סינפסת הסרט ממלאת תפקיד מכריע בהעברת דחפים שלפוחית באופן מדורג 2,3. תהליך הראייה כולל העברת אותות אלקטרו-אופטיים על פני רמות שונות של נוירונים וסינפסות, ובסופו של דבר מגיע לקליפת המוח הראייתית 4,5.

Protocol

1. קבלת ROs מ- iPSCs25

הערה: ROs נגזרו מ- iPSCs על-ידי שינוי ההליך שדווח בעבר.

  1. נתק iPSCs במפגש ~90% באמצעות פרוטאז חיידקי (ראה טבלת חומרים). קוצצים את המושבות לחתיכות ומגרדים אותן עם מרים תאים.
  2. לאחר האיסוף, להשעות מחדש את אשכולות התאים ב 0.25 מ"ל של Matrigel קר כקרח. לאחר 20 דקות דגירה ב-37°C, פזרו את הג'ל המוצק עם מדיום DMEM/F12 (תוסף N2 0.5%, תוסף B27 1%, 0.1 mM β-מרקפטואתנול, 0.2 mM L-תחליף גלוטמין, 100 U/mL פניצילין ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין). הגדירו זמן זה כיום 0 של בידול.
  3. לאחר 5 ימים של תרבית צפה, ....

תוצאות

הקמת ROs תלת-ממדיים באמצעות התמיינות iPSC מספקת כלי רב עוצמה לחקר מנגנונים של מחלות רשתית וטיפול בתחליפי תאי גזע. למרות שאחרים הדגימו את הקשרים הסינפטיים ב-ROs מבחינה תפקודית ואימונוציטוכימית, עדויות ישירות לסינפסות קונבנציונליות וסרטיות מוגבלות מאוד. כאן אנו מציגים שיטה ל?.......

Discussion

במאמר זה, הצגנו פרוטוקול מפורט לצפייה באולטרה-מבנה קונבנציונלי וסינפטי של הסרט ב-ROs על ידי TEM. פרוטוקול זה מבוסס על שיטות הכנת הרשתית שתוארו לעיל עם כמה שינויים20. כדי לשפר את שיעור ההצלחה של הטיפול בדגימה ואת האיכות של מיקרוגרפים TEM, שקול את נקודות המפתח הבאות........

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2022YFA1105503), מעבדת המפתח הממלכתית למדעי המוח (SKLN-202103), קרן ג'ג'יאנג למדעי הטבע של סין (Y21H120019), הקרן למדעי הטבע של סין (82070981).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Petri dishCorning430167
AcetoneElectron Microscopy Science10000
B27 supplementGibcoA3582801
Cell lifterSanta Cruzsc-395251
Copper gridsBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.AZH400HH
DigitalMicrograph SoftwareGatan, Inc.Software
DispaseStemCell Technologies#07913Bacterial protease
DMEM/F12 mediumGibco#11320033
Embedding moldBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ10592
Epon-812 resinElectron Microscopy Science#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)Biological Industries#04-0021A
GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
hiPSCShownin Biotechnology Co. Ltd.RC01001-A
Lead citrateBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ02618
L-GlutaMaxLife Technologies#35050061L-glutamine substitute
MatrigelCorning356234
Microscope slideCITOTEST80312-3161
N2 supplementGibco17502048
Na2HPO4· 12H2OSigma71650A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2OSigma71507A component of PB/PBS
Non-essential amino acidsSigma#M7145
Optical microscopeLab Binocular Biological MicroscopeXsz-107bnii
OsO4TED PELLA4008-160501
OvenBluepardBPG9040A
ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
Penicillin-StreptomycinGibco#15140-122
Semi/ultrathin microtomeReichert-Jung396649
TaurineSigma#T0625
Toluidine blueSangon BiotechE670105-0100
Transmission Electron MicroscopesHITACHIH-7500
Uranyl acetateTED PELLACA96049
β-mercaptoethanolSigma444203

References

  1. Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489 (2021).
  2. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved