A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.
אורגנואידים ברשתית (ROs) הם מערכת תרבית תלת ממדית המחקה תכונות רשתית אנושיות שהתמיינו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) בתנאים ספציפיים. התפתחות סינפסה והבשלה ב-ROs נחקרו מבחינה אימונוציטוכימית ותפקודית. עם זאת, העדות הישירה לאולטרה-מבנה המגע הסינפטי מוגבלת, ומכילה הן סינפסות סרט מיוחדות והן סינפסות כימיות קונבנציונליות. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) מאופיין ברזולוציה גבוהה והיסטוריה מכובדת המבהירה התפתחות רשתית והבשלת סינפסות בבני אדם ומינים שונים. זהו כלי רב עוצמה לחקור מבנה סינפטי ROs והוא נמצא בשימוש נרחב בתחום המחקר של ROs. לכן, כדי לחקור טוב יותר את המבנה של מגעים סינפטיים RO בקנה מידה ננומטרי ולקבל ראיות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה, פיתחנו שיטה פשוטה וחוזרת להכנת דגימות RO TEM. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול, ריאגנטים שבהם נעשה שימוש ושלבים מפורטים, כולל הכנת קיבוע RO, קיבוע לאחר קיבוע, הטבעה והדמיה.
הרשתית, איבר חישה חזותי חיוני בבני אדם וביונקים, מציגה מבנה למינציה מובהק המאופיין בשלוש שכבות גרעיניות המאחסנות סומות נוירונים ושתי שכבות פרספקס שנוצרו על ידי קשרים סינפטיים1, כולל סינפסות קונבנציונליות וסינפסת הסרט המיוחדת 2,3. סינפסת הסרט ממלאת תפקיד מכריע בהעברת דחפים שלפוחית באופן מדורג 2,3. תהליך הראייה כולל העברת אותות אלקטרו-אופטיים על פני רמות שונות של נוירונים וסינפסות, ובסופו של דבר מגיע לקליפת המוח הראייתית 4,5.
1. קבלת ROs מ- iPSCs25
הערה: ROs נגזרו מ- iPSCs על-ידי שינוי ההליך שדווח בעבר.
הקמת ROs תלת-ממדיים באמצעות התמיינות iPSC מספקת כלי רב עוצמה לחקר מנגנונים של מחלות רשתית וטיפול בתחליפי תאי גזע. למרות שאחרים הדגימו את הקשרים הסינפטיים ב-ROs מבחינה תפקודית ואימונוציטוכימית, עדויות ישירות לסינפסות קונבנציונליות וסרטיות מוגבלות מאוד. כאן אנו מציגים שיטה ל?.......
במאמר זה, הצגנו פרוטוקול מפורט לצפייה באולטרה-מבנה קונבנציונלי וסינפטי של הסרט ב-ROs על ידי TEM. פרוטוקול זה מבוסס על שיטות הכנת הרשתית שתוארו לעיל עם כמה שינויים20. כדי לשפר את שיעור ההצלחה של הטיפול בדגימה ואת האיכות של מיקרוגרפים TEM, שקול את נקודות המפתח הבאות........
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2022YFA1105503), מעבדת המפתח הממלכתית למדעי המוח (SKLN-202103), קרן ג'ג'יאנג למדעי הטבע של סין (Y21H120019), הקרן למדעי הטבע של סין (82070981).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
B27 supplement | Gibco | A3582801 | |
Cell lifter | Santa Cruz | sc-395251 | |
Copper grids | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | AZH400HH | |
DigitalMicrograph Software | Gatan, Inc. | Software | |
Dispase | StemCell Technologies | #07913 | Bacterial protease |
DMEM/F12 medium | Gibco | #11320033 | |
Embedding mold | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ10592 | |
Epon-812 resin | Electron Microscopy Science | #14900 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | #04-0021A | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
hiPSC | Shownin Biotechnology Co. Ltd. | RC01001-A | |
Lead citrate | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ02618 | |
L-GlutaMax | Life Technologies | #35050061 | L-glutamine substitute |
Matrigel | Corning | 356234 | |
Microscope slide | CITOTEST | 80312-3161 | |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of PB/PBS |
NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of PB/PBS |
Non-essential amino acids | Sigma | #M7145 | |
Optical microscope | Lab Binocular Biological Microscope | Xsz-107bnii | |
OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
Oven | Bluepard | BPG9040A | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | #15140-122 | |
Semi/ultrathin microtome | Reichert-Jung | 396649 | |
Taurine | Sigma | #T0625 | |
Toluidine blue | Sangon Biotech | E670105-0100 | |
Transmission Electron Microscopes | HITACHI | H-7500 | |
Uranyl acetate | TED PELLA | CA96049 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | 444203 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved