הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

Summary

פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.

Abstract

אורגנואידים ברשתית (ROs) הם מערכת תרבית תלת ממדית המחקה תכונות רשתית אנושיות שהתמיינו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) בתנאים ספציפיים. התפתחות סינפסה והבשלה ב-ROs נחקרו מבחינה אימונוציטוכימית ותפקודית. עם זאת, העדות הישירה לאולטרה-מבנה המגע הסינפטי מוגבלת, ומכילה הן סינפסות סרט מיוחדות והן סינפסות כימיות קונבנציונליות. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) מאופיין ברזולוציה גבוהה והיסטוריה מכובדת המבהירה התפתחות רשתית והבשלת סינפסות בבני אדם ומינים שונים. זהו כלי רב עוצמה לחקור מבנה סינפטי ROs והוא נמצא בשימוש נרחב בתחום המחקר של ROs. לכן, כדי לחקור טוב יותר את המבנה של מגעים סינפטיים RO בקנה מידה ננומטרי ולקבל ראיות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה, פיתחנו שיטה פשוטה וחוזרת להכנת דגימות RO TEM. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול, ריאגנטים שבהם נעשה שימוש ושלבים מפורטים, כולל הכנת קיבוע RO, קיבוע לאחר קיבוע, הטבעה והדמיה.

Introduction

הרשתית, איבר חישה חזותי חיוני בבני אדם וביונקים, מציגה מבנה למינציה מובהק המאופיין בשלוש שכבות גרעיניות המאחסנות סומות נוירונים ושתי שכבות פרספקס שנוצרו על ידי קשרים סינפטיים¹, כולל סינפסות קונבנציונליות וסינפסת הסרט המיוחדת ^2,3. סינפסת הסרט ממלאת תפקיד מכריע בהעברת דחפים שלפוחית באופן מדורג ^2,3. תהליך הראייה כולל העברת אותות אלקטרו-אופטיים על פני רמות שונות של נוירונים וסינפסות, ובסופו של דבר מגיע לקליפת המוח הראייתית ^4,5.

אורגנואידים ברשתית (ROs) מייצגים מערכת תרבית תלת-ממדית (תלת-ממדית) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), המחקים את המצבים הפיזיולוגיים של רקמת הרשתית במבחנה ^1,6,7. גישה זו טומנת בחובה הבטחה לחקר מחלות רשתית⁸, בדיקות סקר תרופתיות⁹, ומשמשת כטיפול פוטנציאלי למצבים ניווניים בלתי הפיכים ברשתית כגון רטיניטיס פיגמנטוזה¹⁰ וגלאוקומה¹¹. כמערכת הולכה אופטית עוצמתית במבחנה, הסינפסה בתוך ROs היא מבנה חיוני המאפשר טרנספורמציה והעברה יעילה של אותות⁵.

ניתן לחלק את התפתחות RO באופן גס לשלושה שלבים על פי תכונותיהם המורפולוגיות ופרופילי הביטוי המולקולרי^{שלהם 6,12}. ROs בשלב 1 (סביב D21-D60) כוללים תאי אב עצביים של הרשתית, תאי גנגליון רשתית רבים (RGCs), וכמה תאים אמקריניים מתפוצצים כוכבים (SACs), המתאימים לתקופה הראשונה של התפתחות עוברית אנושית. בשלב 2 (בסביבות D50-D150), ROs מבטאים כמה מבשרי פוטורצפטור, נוירונים בין-עצביים וגנים הקשורים לסינפטוגנזה, מה שמייצג שלב של מעבר. פוטורצפטורים מפתחים בשלות בשלב 3 ROs (בערך אחרי D100-D150), המתאים לשלב השלישי של התפתחות העובר האנושי ^6,12,13. יש לציין כי בהשוואה ל-ROs בשלב 1 ובשלב 2, ל-ROs בשלב 3 יש מבנה למלרי מובהק שהסינפסות שלו הבשילו¹², כולל נוכחות של סינפסות סרט¹⁴. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה אישר כי סינפסות בוגרות קיימות העברת אותות אור, המציין שהם פונקציונליים¹³. לכן, ROs בשלב 3 נבחרים לעתים קרובות לחקור את המבנה הסינפטי.

אימונוהיסטוכימיה מיושמת באופן נרחב לחקר הביטוי של חלבונים מולקולריים שונים. עם זאת, המגבלה של המיקרוסקופ האופטי טמונה ביכולתו לצפות רק במספר מוגבל של תאים ומולקולות ספציפיים בו זמנית, וכתוצאה מכך חוסר ניתוח מקיף של היחסים בין תאים לסביבתם. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) מאופיין ברזולוציה גבוהה, עם רזולוציה מוגבלת של 0.1-0.2 ננומטר, עולה על מיקרוסקופ האור על ידי ~ 10-20 פעמים¹⁵. הוא מפצה על הפגמים של מיקרוסקופיה אופטית ומשמש להבהרת התפתחות הרשתית והבשלת סינפסות בבני אדם^16,17 ומינים שונים^18,19,20,21. TEM מאפשר הבחנה ישירה בין רכיבים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים^18,20, ואף מאפשר תצפית מקיפה על מבנים תת-תאיים כגון סרטים ^2,3, שלפוחיות²² ומיטוכונדריה²³. לכן, TEM הוא כלי חיוני לזיהוי סוגי סינפסות וחקירת מבנה העל של מגעים סינפטיים ב- ROs בקנה מידה ננומטרי.

חשוב לציין כי להכנת הדגימה חשיבות רבה לרכישת מיקרוגרפים אלקטרונים איכותיים. למרות שמחקרים מסוימים ביצעו EM על ROs 12,13,24, ההליכים המפורטים אינם ברורים. מכיוון שאיכות תמונת מיקרוסקופ האלקטרונים תלויה במידה רבה בהשפעה של קיבוע RO וחדירת מגיב, יש לקחת בחשבון גורמים חשובים שונים במהלך ההכנה. כתוצאה מכך, כדי לחקור טוב יותר מגעים סינפטיים ב-ROs, אנו מציגים שיטה עם יכולת שחזור טובה שמראה את נקודות הפעולה של קיבוע RO, הטבעה וזיהוי של אתרי תצפית.

Protocol

1. קבלת ROs מ- iPSCs²⁵

הערה: ROs נגזרו מ- iPSCs על-ידי שינוי ההליך שדווח בעבר.

1. נתק iPSCs במפגש ~90% באמצעות פרוטאז חיידקי (ראה טבלת חומרים). קוצצים את המושבות לחתיכות ומגרדים אותן עם מרים תאים.
2. לאחר האיסוף, להשעות מחדש את אשכולות התאים ב 0.25 מ"ל של Matrigel קר כקרח. לאחר 20 דקות דגירה ב-37°C, פזרו את הג'ל המוצק עם מדיום DMEM/F12 (תוסף N2 0.5%, תוסף B27 1%, 0.1 mM β-מרקפטואתנול, 0.2 mM L-תחליף גלוטמין, 100 U/mL פניצילין ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין). הגדירו זמן זה כיום 0 של בידול.
3. לאחר 5 ימים של תרבית צפה, תאים מתקבצים ליצירת ציסטות תאים. העבירו את ציסטות התאים הללו לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ, שם הן יידבקו ויגדלו.
4. ביום ה-15, השתמשו בפרוטאז חיידקי כדי לנתק את התאים הדבקים ולגדל אותם בתרבית במדיום DMEM/F12 (תוסף B27 2%, 0.1 מילימול חומצות אמינו לא חיוניות).
5. ביום ה-21, יש להחליף את המדיום ב-20 מ"ל מדיום המכיל סרום (DMEM/F12 בינוני, 8% FBS, 2% תוסף B27, 100 מ"מ טאורין ו-2 מ"מ L-תחליף גלוטמין), ולהחליף את המדיום מדי שבוע.

2. קיבוע קדמי של ROs

1. העבר בעדינות את אחד מ- ROs בתרבית (~D180, גודל של כ -1 ~ 2 מ"מ קוטר אופטימלי) מצלחת פטרי לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל עם פיפטה וסמן את המידע הרלוונטי על ROs.
   הערה: חתכו את ROs לשניים או חתכו את הרקמה בעלת המבנה הגרוע עם סכין גילוח מתחת למיקרוסקופ בצלחת המכילה קיבוע אם ROs גדולים מדי.
2. הסר את המדיום תרבית מ 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge עם פיפטה. הוסף 1.5 מ"ל של 2% paraformaldehyde-2% glutaraldehyde fixative מדולל ב 0.1 M פוספט buffer (PB), pH 7.4, ולתקן בטמפרטורת החדר (RT) במשך 4 שעות. אחסנו את צינורות המיקרוצנטריפוגות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
   הערה: ניתן להשהות שלב זה למשך שבוע אחד, אך מומלץ להפעיל מחדש מוקדם ככל האפשר. אם ROs נשארים למשך זמן רב יותר, זה עלול לגרום לאוטוליזה של תאים המוביל להרס של מבנה העל של ROs. בשל השבריריות של ROs, הימנע סיבוב, תנודה, היפוך, או פעולות קשות.

3. לאחר קיבוע ROs

1. יש להסיר את קיבוע ה-2% פרפורמאלדהיד-2% גלוטראלדהיד ולשטוף עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט 0.01M (PBS) ב-pH 7.4 למשך 3 x 10 דקות. השהה בעדינות את ROs בצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל במהלך תהליך הכביסה לשטיפה מלאה. עבור כל יום נוסף של קיבוע, להגדיל את מספר הכביסה על ידי שניים כדי להסיר את שאריות קיבוע ככל האפשר.
2. הסר את כל PBS שנותרו באמצעות פיפטה והחלף אותה ב~ 150 μL של 1% חומצה אוסמית (OsO4) עד שבלוקי הרקמה שקועים. הניחו את צינורות המיקרוצנטריפוגות בקופסה חשוכה כדי להגן עליהם מפני אור וחדרו ל-RT למשך שעה אחת.
   הערה: OsO4 הוא מחמצן חזק ויש לטפל בו במכסה אדים.

4. כתמים והתייבשות

הערה: יש להפעיל את מסיר הלחות כדי לייבש את הסביבה משלב זה.

1. יש להסיר את OsO4 באמצעות פיפטה, לשטוף עם 0.01 M PBS (pH 7.4) 3 x 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף 3 x 10 דקות עם מים נטולי יונים.
   הערה: כדי להבטיח שטיפה מלאה של ROs, אנו ממליצים להשעות את ROs. שאפו את OsO4 לבקבוק פינוי ייעודי.
2. הסר את שטיפת המים האחרונה שעברה דה-יוניזציה והחלף ב~ 150 μL לכל צינור (להבטיח חדירה מלאה של בלוקי רקמות) של אורניום אצטט וכתם למשך 1-2 שעות ב- RT. הגן על צינורות המיקרוצנטריפוגות מפני אור.
3. הסר את האורניום אצטט והחלף אותו עם 1 מ"ל של 50% אצטון במכסה האדים, מתייבש במשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמשו ב-70%, 80%, 90%, 100% ו-100% אצטון להתייבשות הדרגתית של ROs ברצף. כל התייבשות נמשכת 10 דקות.
   הערה: השאירו מעט נוזלים כדי להשרות את ROs עבור כל החלפה כדי למנוע חשיפה לאוויר וללחות. בנוסף, לפעול במהירות בהקדם האפשרי כי אצטון הוא נדיף. שאפו אורניום אצטט לבקבוק סילוק ייעודי.

5. הסתננות

1. השליכו את האצטון והוסיפו ~150 μL של התערובת המורכבת מאצטון ושרף Epon-812 ביחס של 1:1. מכניסים לתנור בטמפרטורה של 18 מעלות למשך שעה.
2. הסר את התערובת לעיל והחלף אותה בתערובת המורכבת מאצטון ושרף אפון-812 ביחס של 1:4. הכניסו לתנור של 37°C למשך הלילה.
3. העבירו את ROs לתוך צינורות חדשים המכילים ~ 500 μL של שרף אפוקסי טהור בזהירות ומניחים אותם בתנור 45 ° C למשך 1 שעה.

6. הטבעה

1. הכן את 30-50 מ"ל של שרף אפוקסי טהור בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל על ידי ערבוב ערכת מגיב על פי הוראות היצרן מראש. סובבו את שרף האפוקסי הטהור באיטיות למשך 30 דקות כדי להפחית את בועות האוויר שמכניס המיקסר. לאחר מכן, השאירו אותו בתנור 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הוסיפו 2/3 נפח של שרף אפוקסי טהור לחריץ של תבנית ההטבעה.
2. השתמש קיסם כדי לבחור ROs לתוך תבנית הטבעה מצויד שרף אפוקסי טהור.
3. ממלאים את החריץ בשרף אפוקסי טהור עד שהוא בולט מעט או בולט.
4. התאם את מיקום ROs בשני הקצוות של תבנית ההטבעה להטמעה כיוונית. מניחים את תבנית ההטבעה בתנור 45 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות ולאחר מכן מכניסים לתנור 65 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות.

7. מיקום חצי דק

1. חולחים את שרף האפוקסי העודף סביב הרקמה מקצות ארבעת הצדדים הארוכים יותר של גוש ההטבעה ליצירת פנים טרפזיות. התקן את בלוק ההטבעה במעמד ההרכבה לדוגמה והברג את הבורג באמצעות מברג L. לאחר מכן, התקן סכיני זכוכית על מעמד הסכין והדק את האגוז באופן ידני.
2. חותכים את עודפי השרף עד לחשיפת האזור הרצוי.
3. ממלאים את שוקת סכין הזכוכית במים. חותכים פרוסות דקות למחצה לעובי של 1 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום דק למחצה ומניחים אותן על מגלשת מיקרוסקופ עם מחט.
4. הוסיפו 50 μL של 1% toluidine blue לצביעת פרוסות דקות למחצה ודגרו במשך דקה אחת ב-95°C על פלטת החימום. יש לשטוף במים מזוקקים במשך 2 דקות. השתמש במיקרוסקופ אופטי רגיל פי 20 כדי לבחון את מבנה המקטעים.

8. חתך דק במיוחד

1. התקן את בלוקי ההטבעה וסכיני הזכוכית כמתואר בשלב 7.1. התאימו את המרחק בין הסכין לבלוק הרקמות, את רמת הנוזל של הכיור ואת מהירות החיתוך. חותכים את החלקים הדקים במיוחד בעובי של ~70-100 ננומטר עם מיקרוטום דק במיוחד וגורפים את הפרוסות על רשת הנחושת (200 רשת) עם הסרט התומך.
2. יש לצבוע חלקים דקים במיוחד עם 3% עופרת ציטראט למשך 15 דקות כדי לשפר את הניגודיות בהליך צביעה כפול.

9. ROs הדמיה על ידי TEM

1. הפעל את התוכנה (ראה טבלת חומרים).
2. לחץ על כפתור מצב הזיכרון וסמן כל קטע דק במיוחד באופן גס.
3. חפש מבנים סינפטיים.
   1. להבחין במבנה הלמינציה של ROs בהגדלה נמוכה.
   2. אתר את השכבה הגרעינית החיצונית (ONL), המראה מבנה גרעיני עם צפיפות אלקטרונים עמוקה יותר. לאחר מכן, לנווט אל המסוף של photoreceptor שבו שלפוחיות רבות מצטברות. חפש את הדקי המוטות עם סרט סינפטי יחיד ואת מסופי החרוט עם סרטים סינפטיים מרובים.
   3. עבור לשכבת הפרספקס הפנימית (IPL) וחפש מבנה דומה עם סרט קטן.
4. צלם את התמונה המיקרוסקופית.
   1. לחץ על התחל והזן את עוצמת ההגדלה המתאימה.
   2. שמור את התמונות.

תוצאות

הקמת ROs תלת-ממדיים באמצעות התמיינות iPSC מספקת כלי רב עוצמה לחקר מנגנונים של מחלות רשתית וטיפול בתחליפי תאי גזע. למרות שאחרים הדגימו את הקשרים הסינפטיים ב-ROs מבחינה תפקודית ואימונוציטוכימית, עדויות ישירות לסינפסות קונבנציונליות וסרטיות מוגבלות מאוד. כאן אנו מציגים שיטה ל?...

Discussion

במאמר זה, הצגנו פרוטוקול מפורט לצפייה באולטרה-מבנה קונבנציונלי וסינפטי של הסרט ב-ROs על ידי TEM. פרוטוקול זה מבוסס על שיטות הכנת הרשתית שתוארו לעיל עם כמה שינויים²⁰. כדי לשפר את שיעור ההצלחה של הטיפול בדגימה ואת האיכות של מיקרוגרפים TEM, שקול את נקודות המפתח הבאות....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	430167
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
B27 supplement	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Copper grids	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	AZH400HH
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Bacterial protease
DMEM/F12 medium	Gibco	#11320033
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ10592
Epon-812 resin	Electron Microscopy Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Lead citrate	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-glutamine substitute
Matrigel	Corning	356234
Microscope slide	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of PB/PBS
Non-essential amino acids	Sigma	#M7145
Optical microscope	Lab Binocular Biological Microscope	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Oven	Bluepard	BPG9040A
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
Transmission Electron Microscopes	HITACHI	H-7500
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoethanol	Sigma	444203