Vorbereitung von retinalen Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet ein optimiertes und aufwändiges Präparationsverfahren für retinale Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie. Es eignet sich für Anwendungen, die die Analyse von Synapsen in reifen retinalen Organoiden beinhalten.

Zusammenfassung

Retinale Organoide (ROs) sind ein dreidimensionales Kultursystem, das menschliche Netzhautmerkmale nachahmt, die sich unter bestimmten Bedingungen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unterschieden haben. Die Entwicklung und Reifung von Synapsen in ROs wurde immunzytochemisch und funktionell untersucht. Der direkte Nachweis der synaptischen Kontaktultrastruktur ist jedoch begrenzt, da sie sowohl spezielle Bandsynapsen als auch konventionelle chemische Synapsen enthält. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeichnet sich durch eine hohe Auflösung und eine respektable Geschichte aus, die die Entwicklung der Netzhaut und die Synapsenreifung beim Menschen und bei verschiedenen Spezies aufklärt. Es ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erforschung der synaptischen Struktur in ROs und wird häufig im Forschungsbereich der ROs eingesetzt. Um die Struktur der synaptischen RO-Kontakte auf der Nanoskala besser zu untersuchen und qualitativ hochwertige mikroskopische Beweise zu erhalten, haben wir daher eine einfache und wiederholbare Methode zur Vorbereitung von RO-TEM-Proben entwickelt. In diesem Dokument werden das Protokoll, die verwendeten Reagenzien und die detaillierten Schritte beschrieben, einschließlich der Vorbereitung der RO-Fixierung, der Nachfixierung, der Einbettung und der Visualisierung.

Einleitung

Die Netzhaut, ein lebenswichtiges visuelles Sinnesorgan bei Menschen und Säugetieren, weist eine ausgeprägte laminierte Struktur auf, die durch drei Kernschichten gekennzeichnet ist, in denen Neuronensomas untergebracht sind, und zwei plexiforme Schichten, die durch synaptische Verbindungen^{gebildet werden 1}, einschließlich konventioneller Synapsen und der spezialisierten Bandsynapse ^2,3. Die Bandsynapse spielt eine entscheidende Rolle bei der abgestuften Übertragung von Vesikelimpulsen ^2,3. Der ....

Protokoll

1. Gewinnung von ROs aus iPSCs²⁵

HINWEIS: ROs wurden von iPSCs abgeleitet, indem das zuvor beschriebene Verfahren modifiziert wurde.

1. Dissoziieren Sie iPSCs bei ~90% Konfluenz mit einer bakteriellen Protease (siehe Materialtabelle). Zerkleinern Sie die Kolonien in Stücke und kratzen Sie sie mit einem Zellheber ab.
2. Nach der Entnahme resuspendieren Sie die Zellcluster in 0,25 ml eiskaltem Matrigel. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei 37 °C bestreuen Sie das erstarrte Gel mit dem DMEM/F12-Medium (0,5 % N2-Supplemen....

Diskussion

In diesem Artikel haben wir ein detailliertes Protokoll zur Beobachtung der konventionellen und bandsynaptischen Ultrastruktur in ROs mittels TEM vorgestellt. Dieses Protokoll basiert auf den zuvor beschriebenen Methoden zur Netzhautpräparation mit einigen Modifikationen²⁰. Um die Erfolgsrate der Probenbehandlung und die Qualität von TEM-Schliffbildern zu verbessern, sollten die folgenden wichtigen Punkte berücksichtigt werden. Zunächst ist es wichtig anzuerke.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	430167
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
B27 supplement	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Copper grids	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	AZH400HH
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Bacterial protease
DMEM/F12 medium	Gibco	#11320033
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ10592
Epon-812 resin	Electron Microscopy Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Lead citrate	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-glutamine substitute
Matrigel	Corning	356234
Microscope slide	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of PB/PBS
Non-essential amino acids	Sigma	#M7145
Optical microscope	Lab Binocular Biological Microscope	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Oven	Bluepard	BPG9040A
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
Transmission Electron Microscopes	HITACHI	H-7500
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoethanol	Sigma	444203