Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión

Resumen

Este protocolo proporciona un procedimiento de preparación optimizado y elaborado para muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión. Es adecuado para aplicaciones que involucran el análisis de sinapsis en organoides retinianos maduros.

Resumen

Los organoides de la retina (RO) son un sistema de cultivo tridimensional que imita las características de la retina humana y que se han diferenciado de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en condiciones específicas. El desarrollo y la maduración de las sinapsis en las RO se han estudiado inmunocitoquímica y funcionalmente. Sin embargo, la evidencia directa de la ultraestructura de contacto sináptico es limitada, ya que contiene tanto sinapsis de cinta especiales como sinapsis químicas convencionales. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se caracteriza por una alta resolución y una historia respetable que dilucida el desarrollo de la retina y la maduración de las sinapsis en humanos y diversas especies. Es una herramienta poderosa para explorar la estructura sináptica en las RO y es ampliamente utilizada en el campo de investigación de las RO. Por lo tanto, para explorar mejor la estructura de los contactos sinápticos de RO a nanoescala y obtener evidencia microscópica de alta calidad, desarrollamos un método simple y repetible de preparación de muestras de RO TEM. Este documento describe el protocolo, los reactivos utilizados y los pasos detallados, incluida la preparación de la fijación de ósmosis inversa, la posfijación, la inclusión y la visualización.

Introducción

La retina, un órgano sensorial visual vital en humanos y mamíferos, exhibe una estructura laminada distinta caracterizada por tres capas nucleares que albergan somas neuronales y dos capas plexiformes formadas por conexiones sinápticas¹, incluidas las sinapsis convencionales y la sinapsis de cinta especializada ^2,3. La sinapsis en cinta desempeña un papel crucial en la transmisión de los impulsos vesicular de forma gradual ^2,3. El proceso de visión implica la transmisión de señales electroóptica....

Protocolo

1. Obtención de RO de iPSCs²⁵

NOTA: Las RO se derivaron de las iPSC modificando el procedimiento informado anteriormente.

1. Disocie las iPSC en una confluencia de ~90% utilizando una proteasa bacteriana (consulte la tabla de materiales). Pica las colonias en pedazos y ráspalas con un elevador de celdas.
2. Después de la recolección, vuelva a suspender los grupos de células en 0,25 ml de Matrigel helado. Después de 20 minutos de incubación a 37 °C, disperse el gel solidificado con el medio DMEM/F12 (0,5% de suplemento d....

Discusión

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para observar la ultraestructura sináptica convencional y de cinta en RO mediante TEM. Este protocolo se basa en los métodos de preparación de la retina descritos anteriormente con algunas modificaciones²⁰. Para mejorar la tasa de éxito del tratamiento de muestras y la calidad de las micrografías TEM, tenga en cuenta los siguientes puntos clave. En primer lugar, es importante reconocer que las RO se desarr.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	430167
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
B27 supplement	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Copper grids	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	AZH400HH
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Bacterial protease
DMEM/F12 medium	Gibco	#11320033
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ10592
Epon-812 resin	Electron Microscopy Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Lead citrate	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-glutamine substitute
Matrigel	Corning	356234
Microscope slide	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of PB/PBS
Non-essential amino acids	Sigma	#M7145
Optical microscope	Lab Binocular Biological Microscope	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Oven	Bluepard	BPG9040A
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
Transmission Electron Microscopes	HITACHI	H-7500
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoethanol	Sigma	444203