تزايد الأغشية الحيوية المتفطرة كنموذج لدراسة مقاومة مضادات الميكروبات

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة قوية لتطوير الأغشية الحيوية الحبيبية. هذه الطريقة قابلة للتطوير لأحجام الثقافة المختلفة ، مما يسمح بسهولة اعتمادها لأهداف تجريبية مختلفة. يتيح تصميم الطريقة التقييم النوعي أو الكمي لإمكانية تكوين الأغشية الحيوية للعديد من الأنواع المتفطرة.

Abstract

تزدهر العديد من البكتيريا في المجتمعات الطبيعية المعقدة ، وتظهر السمات الرئيسية لتعدد الخلايا مثل التواصل والتعاون والمنافسة. أكثر مظاهر السلوك البكتيري متعدد الخلايا انتشارا هو تكوين الأغشية الحيوية ، وغالبا ما ترتبط بالإمراضية. توفر الأغشية الحيوية ملاذا ضد العوامل المضادة للميكروبات ، مما يعزز ظهور مقاومة مضادات الميكروبات. تفشل الممارسة التقليدية لزراعة البكتيريا في الثقافات السائلة للقارورة المهتزة في تمثيل نموها الفسيولوجي المناسب في الطبيعة ، مما يحد من فهمنا لديناميكياتها المعقدة. والجدير بالذكر أن الملامح الأيضية والنسخ للبكتيريا الموجودة في الأغشية الحيوية تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في الخلايا التي تنمو بشكل طبيعي. يؤكد هذا التوازي على أهمية الأغشية الحيوية كنموذج مثالي للبحوث التأسيسية والانتقالية. تركز هذه المقالة على استخدام المتفطرة smegmatis ككائن نموذجي لتوضيح تقنية لزراعة الأغشية الحيوية الحبيبية. هذا النهج قابل للتكيف مع أحجام الاستزراع المختلفة ، مما يسهل تنفيذه لأهداف تجريبية متنوعة مثل دراسات مضادات الميكروبات. علاوة على ذلك ، يتيح تصميم الطريقة التقييم النوعي أو الكمي لقدرات تكوين الأغشية الحيوية لمختلف أنواع المتفطرات مع تعديلات طفيفة.

Introduction

البكتيريا قادرة على البقاء على قيد الحياة ككيانات وحيدة الخلية. ومع ذلك ، في معظم الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، فإنها تنظم في محاكاة المجتمع. الأغشية الحيوية هي منظمة مجتمعية معترف بها على نطاق واسع للبكتيريا التي تشكلها الخلايا المجمعة المغلفة في مصفوفة منتجة^{ذاتيا 1}. يمتلك هذا التجميع توقيعات متعددة الخلايا المبكرة ويوفر مرونة أعلى للإجهاد للأنظمة البكتيرية. غالبا ما تكون الأغشية الحيوية متحملة لمضادات الميكروبات ويقدر أنها مسؤولة عن ما يقرب من 80٪ من العدوى الميكروبية ^2,3.

كانت القارورة المهتزة والثقافات القائمة على الألواح تقليديا هي الممارسات المعتادة للزراعة البكتيرية. يمكن أن يعزى قبولها ونجاحها الهائل إلى سهولة التعامل معها وقابليتها للتكرار وقابلية التوسع. ومع ذلك ، فإن عدم وجود سياق فسيولوجي يحد من الإمكانات الانتقالية للمعرفة المتولدة باستخدام هذه الأنظمة⁴. لذلك ، أصبحت الأغشية الحيوية نظاما نموذجيا جذابا لدراسة الفيزيولوجيا المرضية البكتيرية. توفر الأغشية الحيوية نظاما نموذجيا ديناميكيا ، يعكس عن كثب الظروف الطبيعية ، مما يسمح للباحثين بتكرار الجوانب الفسيولوجية مثل تدرجات المغذيات وعدم التجانس المكاني ^5,6.

يعتبر نمط حياة الأغشية الحيوية وثيق الصلة بشكل خاص بدراسات المتفطرات ، حيث أن المتفطرات ، بما في ذلك المتفطرة السلية سيئة السمعة ، هي صانعات الأغشية الحيوية^{البارعة 7}. تساهم قدرتها على الازدهار داخل الأغشية الحيوية في ثباتها في الأنسجة المضيفة أثناء العدوى. إنه يشكل تحديا هائلا في علاج الأمراض الفطرية ، بالنظر إلى مقاومة المضادات الحيوية المتأصلة المرتبطة بأنماط حياة الأغشية الحيوية⁸. توفر الأغشية الحيوية أيضا نظاما نموذجيا مثاليا لدراسة التمثيل الغذائي المتفطرات ، لأنها تسمح بالتحقيق في التكيفات الأيضية الفريدة واستراتيجيات استخدام المغذيات التي تستخدمها المتفطرات داخل المجتمعات الميكروبية^{المعقدة 9}.

في حين يتم قبول الأغشية الحيوية بشكل متزايد كنظام نموذجي أفضل لدراسات^{المتفطرات 10} ، هناك حاجة إلى إجراءات تشغيل قياسية متسقة وقابلة للتكرار ، خاصة لرسم أوجه التشابه بين الدراسات التي أجريت في مختبرات مختلفة. تصف الطريقة الموضحة هنا إجراءات تكوين الأغشية الحيوية لنوع المتفطرات ، M. smegmatis. M. smegmatis هو نموذج يسهل الوصول إليه لدراسة الأغشية الحيوية المتفطرة ، نظرا لعدم إمراضيتها وحركية تكوين الأغشية الحيوية الأسرع. يمكن تعديل الطريقة لتناسب تطبيقات مثل فحص مضادات الفطريات واستخراج الأيض ودراسات أوميكس.

Protocol

يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. إعداد وسائل الإعلام في Sauton

1. تحضير 50 مل من محلول فوسفات هيدروجين البوتاسيوم 2.5٪ عن طريق وزن 1.25 جم من فوسفات هيدروجين البوتاسيوم بعناية وإذابته في 50 مل من الماء منزوع الأيونات.
2. تحضير 50 مل من محلول كبريتات المغنيسيوم 2.5٪ بوزن 2.56 جم من كبريتات المغنيسيوم وإذابته في 50 مل من الماء منزوع الأيونات.
3. تحضير 10 مل من محلول سترات الأمونيوم الحديديك 5٪ عن طريق وزن 0.5 غرام من سترات الأمونيوم الحديديك وإذابته في 10 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بتخزينه في أنبوب كهرماني.
4. تحضير 100 مل من محلول الجلوكوز 20 ٪ عن طريق وزن 20 غرام من الجلوكوز وإذابته في 100 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بتعقيم المرشح باستخدام حقنة معقمة سعة 50 مل ومرشح حقنة PVDF سعة 0.2 ميكرومتر في أنبوب.
5. قم بإعداد 10 مل من محلول كبريتات الزنك المعقم 1٪ عن طريق وزن 0.1 جم من كبريتات الزنك بعناية وإذابته في 10 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بتعقيم المرشح باستخدام حقنة معقمة سعة 10 مل وفلتر حقنة PVDF سعة 0.2 ميكرومتر في غطاء المحرك الرقائقي.
6. امزج المكونات المحضرة في 750 مل من الماء منزوع الأيونات كما هو موضح في الجدول 1. قم بقياس الرقم الهيدروجيني للمحلول واضبطه على 7. اجعل الحجم يصل إلى 900 مل بالماء منزوع الأيونات.
7. الأوتوكلاف وسائل الإعلام في 15 رطل لكل بوصة مربعة و 121 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة. دعها تبرد. ثم أضف 100 ميكرولتر من كبريتات الزنك المعقمة بالفلتر بنسبة 1٪. أضف 100 مل من الجلوكوز المعقم بالفلتر بنسبة 20٪ وقم بإذابته جيدا.

2. إعداد مرشح معقم 5٪ توين -80

1. قم بإذابة 0.5 مل من Tween-80 في 9.5 مل من الماء منزوع الأيونات.
2. قم بتعقيم المحلول باستخدام حقنة معقمة سعة 10 مل ومرشح حقنة PVDF سعة 0.2 ميكرومتر في غطاء المحرك الرقائقي.

3. إعداد الثقافة الأولية

1. في غطاء المحرك الصفحي ، استخدم ماصة مصلية لتوزيع 2 مل من وسائط LB المعقمة في أنبوبي اختبار معقمين سعة 14 مل.
2. أضف 20 ميكرولتر من 5٪ Tween-80 المعقم بالفلتر إلى أنابيب الاختبار باستخدام ماصة دقيقة.
3. قم بتلقيح M. smegmatis في أحد الأنابيب عن طريق إضافة مخزون التبريد باستخدام حلقة التلقيح. يعمل أنبوب الاختبار الآخر كعنصر تحكم في الوسائط.
4. احتضان الأنابيب لمدة 48 ساعة في حاضنة شاكر عند 300 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: يجب ألا يظهر أنبوب التحكم في الوسائط أي نمو.

4. إعداد الثقافة الثانوية

1. في غطاء المحرك الصفحي ، استخدم ماصة مصلية لتوزيع 2 مل من وسائط LB المعقمة في أنبوبي اختبار معقمين سعة 14 مل.
2. أضف 20 ميكرولتر من 5٪ Tween-80 المعقم بالفلتر إلى أنابيب الاختبار باستخدام ماصة دقيقة.
3. أضف 20 ميكرولتر من المزرعة الأولية إلى أحد الأنابيب باستخدام ماصة دقيقة. احتفظ بالأنبوب الآخر كعنصر تحكم في الوسائط.
4. احتضان الثقافات في حاضنة شاكر عند 300 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية حتى تصل إلى_{OD 600} من 0.6 إلى 0.8.
   ملاحظة: يستغرق الأمر عموما من 12 إلى 14 ساعة للوصول إلى_{OD 600} من 0.6 إلى 0.8. يمكن أيضا استخدام كثافات خلايا أخرى ، لكن قيمة OD₆₀₀ المحددة تساعد في الدراسات المقارنة.

5. إعداد الأغشية الحيوية

1. في غطاء المحرك الصفحي ، قم بتوزيع 6 مل من وسائط Sauton المكملة بجلوكوز 2٪ في كل بئر من صفيحة ذات 6 آبار باستخدام ماصة مصلية.
2. تلقيح الآبار المعنية ب 120 ميكرولتر (أي 2٪) من اللقاح الثانوي باستخدام ماصة ميكروية. احتفظ بواحد غير ملقح جيدا كعنصر تحكم في الوسائط.
3. امزج بين الوسائط والثقافة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة صغيرة سعة 1 مل. غطي الغطاء وأغلق اللوحة بعناية بفيلم البارافين.
4. احتضان اللوحة دون عائق في حاضنة ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.

6. إعداد الأغشية الحيوية للرصدات الخاصة بالمرحلة

ملاحظة: الإعداد العام للغشاء الحيوي هو نفسه كما هو موضح في الخطوة 5. ولحصاد الأغشية الحيوية الرقيقة أو تصويرها في أوقات مختلفة، يقترح وضع نفس الأغشية الحيوية في مجموعات متعددة على ألواح منفصلة.

1. لمراقبة الأغشية الحيوية بين اليوم 3 واليوم 6 ، قم بإعداد أربع لوحات بظروف متطابقة واستخدم صفيحة واحدة يوميا للتصوير.
   ملاحظة: تبدأ طبقة الأغشية الحيوية في الظهور على السطح البيني للهواء المتوسط بدءا من اليوم الثالث من إعداد اللوحة.

7. تقدير تطور الأغشية الحيوية

1. تقدير مرئي
   1. صور اللوحات باستخدام نظام توثيق هلام مع إضاءة الضوء الأبيض epi (الشكل 1).
      ملاحظة: يعطي التصوير تقديرا نوعيا وكميا إجماليا للغشاء الحيوي المتكون. يمكن استخدام أي كاميرا ذات نوعية جيدة كبديل.
2. تقدير الوزن الجاف
   1. قم بإجراء قياس الوزن الجاف للحصول على تقدير كمي أكثر دقة.
   2. لقياس الوزن الجاف ، ابدأ بوزن ورقة النشاف.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام ورق الترشيح بدلا من الورق النشاف.
   3. استخرج الغشاء الحيوي من اللوحة المكونة من 6 آبار وانقله إلى الورق باستخدام ملعقة.
   4. اجمع بعناية معظم الأغشية الحيوية من المزرعة ، مع الحرص على عدم نقل كميات زائدة من الوسائط إلى الورق.
   5. ضع الغشاء الحيوي على ورق النشاف.
   6. ضعه في حاضنة على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 0.5-1 ساعة حتى يجف الغشاء الحيوي تماما.
   7. قم بقياس الوزن المشترك للورق والأغشية الحيوية.
      ملاحظة: الوزن الجاف للغشاء الحيوي = (وزن الأغشية الحيوية + الورق) - (وزن الورق)

8. مقايسة تحمل المضادات الحيوية في الأغشية الحيوية

1. تقدير MIC90 من ريفامبيسين في ثقافة العوالق M. smegmatis باتباع البروتوكول الذي وصفه Irith Wiegand et al. باستخدام وسائط Sauton¹¹. أضف المضاد الحيوي عندما تصل الثقافات إلى_{OD 600} من 0.2.
2. قم بإعداد الألواح لنمو الأغشية الحيوية كما هو موضح في الخطوة 5 من البروتوكول.
3. في اليوم الرابع من الحضانة ، أضف ريفامبيسين إلى المزارع بتركيز MIC90 (64 ميكروغرام / مل) من جوانب البئر باستخدام ماصة دقيقة في غطاء الصفحي.
   ملاحظة: افعل ذلك بعناية دون إزعاج الغشاء الحيوي الرقيق كثيرا. اترك أحد الآبار مع الأغشية الحيوية دون معالجة.
4. قم بتدوير الألواح ببطء لخلط المضادات الحيوية.
5. قم بتغطية جوانب الألواح بفيلم البارافين واحتفظ بها في الحاضنة لمزيد من النمو.
6. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الألواح من غطاء المحرك الصفحي وأضف Tween-80 إلى تركيز نهائي بنسبة 0.2٪ في جميع الآبار التي تحتوي على غشاء حيوي.
7. مرة أخرى ، قم بتغطية الألواح بغشاء البارافين واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية و 100 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة.
8. أخرج الألواح في غطاء رقائقي وقم بتجانس المكونات باستخدام ماصة صغيرة سعة 1 مل.
9. اغسل المكونات بوسائط Sauton باستخدام البروتوكول الموضح في Anand et ^al.12.
10. أخيرا ، أعد تعليق الخلايا في وسائط Sauton سعة 6 مل وقم بتخفيفها إلى التركيزات النهائية من ^10-4 و ^10-5 و ^10-6 و ^10-7.
11. انشر 100 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح LB-agar باستخدام حبات زجاجية معقمة.
12. أغلق جميع الألواح باستخدام فيلم البارافين واحتفظ بها في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
13. بعد 3 أيام من الحضانة ، عد المستعمرات على كل طبق. ضع في اعتبارك فقط اللوحات التي يتراوح عدد مستعمراتها بين 30 و 300.
14. احسب CFU / mL والانخفاض النسبي في CFU / mL باستخدام الصيغ المتوفرة¹³.
    ملاحظة: CFU / mL = (عدد المستعمرات × عامل التخفيف) / (الحجم مطلي (بالمل))
    انخفاض نسبي في CFU / مل = ((CFU / مل في غير المعالج - CFU / مل في المعالج)) / ((CFU / مل في غير المعالج)) × 100

النتائج

تصبح كريات الأغشية الحيوية مرئية للعين المجردة من اليوم الثالث فصاعدا. على الرغم من أن الأغشية الحيوية تنمو على وسائط Sauton بدون جلوكوز بنسبة 2٪ ، فقد لوحظ تحسن في الشبكة عند إضافتها. حصلنا على 10.48 مجم ± 3.13 مجم (ن = 4) من الوزن الجاف للغشاء الحيوي من كل بئر من صفيحة 24 بئرا مع 1.5 م...

Discussion

تم وصف نمط الحياة متعدد الخلايا للميكروبات منذ ما يقرب من قرن من الزمان. ومع ذلك ، لا تزال الدراسات السريرية قليلة ، ويرجع ذلك في الغالب إلى عدم وجود طرق قوية¹⁴. غالبا ما يكون من الصعب تكييف الطرق الموصوفة في الأعمال المتعلقة ببيولوجيا الأغشية الحيوية. وهنا، م...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251