Cultivo de biopelículas micobacterianas como modelo para estudiar la resistencia a los antimicrobianos

Resumen

Este protocolo describe un método robusto para desarrollar biofilm de película. El método es escalable a diferentes volúmenes de cultivo, lo que permite una fácil adopción para diversos objetivos experimentales. El diseño del método permite evaluar cualitativa o cuantitativamente el potencial formador de biopelículas de varias especies de micobacterias.

Resumen

Muchas bacterias prosperan en comunidades naturales intrincadas, exhibiendo atributos clave de multicelularidad como la comunicación, la cooperación y la competencia. La manifestación más prevalente del comportamiento multicelular bacteriano es la formación de biopelículas, a menudo relacionadas con la patogenicidad. Las biopelículas ofrecen un refugio contra los agentes antimicrobianos, fomentando la aparición de resistencia a los antimicrobianos. La práctica convencional de cultivar bacterias en cultivos líquidos de matraces de agitación no representa su crecimiento fisiológico adecuado en la naturaleza, lo que limita nuestra comprensión de su intrincada dinámica. En particular, los perfiles metabólicos y transcripcionales de las bacterias que residen en las biopelículas se parecen mucho a los de las células que crecen de forma natural. Este paralelismo subraya la importancia de las biopelículas como un modelo ideal para la investigación fundacional y traslacional. Este artículo se centra en la utilización de Mycobacterium smegmatis como organismo modelo para ilustrar una técnica de cultivo de biopelículas películos. El enfoque es adaptable a diversos volúmenes de cultivo, lo que facilita su implementación para diversos objetivos experimentales como los estudios antimicrobianos. Además, el diseño del método permite la evaluación cualitativa o cuantitativa de las capacidades formadoras de biopelículas de diferentes especies micobacterianas con pequeños ajustes.

Introducción

Las bacterias son capaces de sobrevivir como entidades unicelulares; Sin embargo, en la mayoría de las condiciones fisiológicamente relevantes, se organizan en miméticos comunitarios. El biofilm es una organización comunitaria de bacterias ampliamente reconocida formada por células agregadas encerradas en una matriz autoproducida¹. Dicho ensamblaje posee firmas de multicelularidad temprana y proporciona una mayor resistencia al estrés de los sistemas bacterianos. Las biopelículas suelen ser tolerantes a los antimicrobianos y se estima que son responsables de casi el 80% de las infecciones

Protocolo

Los detalles de todos los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. La preparación mediática de Sauton

1. Prepare 50 mL de solución de fosfato de dihidrógeno potásico al 2,5% pesando cuidadosamente 1,25 g de fosfato de dihidrógeno potásico y disolviéndolo en 50 mL de agua desionizada.
2. Preparar 50 mL de solución de sulfato de magnesio al 2,5% pesando 2,56 g de sulfato de magnesio y disolviéndolo en 50 mL de agua desionizada.
3. Preparar 10 mL de solución de citrato de amonio férrico al 5% pesando 0,5 g de....

Discusión

El estilo de vida multicelular de los microbios fue descrito hace casi un siglo; Sin embargo, los estudios clínicos siguen siendo escasos, principalmente debido a la falta de métodos robustos¹⁴. Los métodos descritos en los trabajos sobre biología de biopelículas son a menudo difíciles de adaptar. En este caso, se espera que la metodología detallada, con la ayuda de demostraciones de pasos críticos, mejore la reproducibilidad de los protocolos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251