Cultivo de biopelículas micobacterianas como modelo para estudiar la resistencia a los antimicrobianos

Resumen

Este protocolo describe un método robusto para desarrollar biofilm de película. El método es escalable a diferentes volúmenes de cultivo, lo que permite una fácil adopción para diversos objetivos experimentales. El diseño del método permite evaluar cualitativa o cuantitativamente el potencial formador de biopelículas de varias especies de micobacterias.

Resumen

Muchas bacterias prosperan en comunidades naturales intrincadas, exhibiendo atributos clave de multicelularidad como la comunicación, la cooperación y la competencia. La manifestación más prevalente del comportamiento multicelular bacteriano es la formación de biopelículas, a menudo relacionadas con la patogenicidad. Las biopelículas ofrecen un refugio contra los agentes antimicrobianos, fomentando la aparición de resistencia a los antimicrobianos. La práctica convencional de cultivar bacterias en cultivos líquidos de matraces de agitación no representa su crecimiento fisiológico adecuado en la naturaleza, lo que limita nuestra comprensión de su intrincada dinámica. En particular, los perfiles metabólicos y transcripcionales de las bacterias que residen en las biopelículas se parecen mucho a los de las células que crecen de forma natural. Este paralelismo subraya la importancia de las biopelículas como un modelo ideal para la investigación fundacional y traslacional. Este artículo se centra en la utilización de Mycobacterium smegmatis como organismo modelo para ilustrar una técnica de cultivo de biopelículas películos. El enfoque es adaptable a diversos volúmenes de cultivo, lo que facilita su implementación para diversos objetivos experimentales como los estudios antimicrobianos. Además, el diseño del método permite la evaluación cualitativa o cuantitativa de las capacidades formadoras de biopelículas de diferentes especies micobacterianas con pequeños ajustes.

Introducción

Las bacterias son capaces de sobrevivir como entidades unicelulares; Sin embargo, en la mayoría de las condiciones fisiológicamente relevantes, se organizan en miméticos comunitarios. El biofilm es una organización comunitaria de bacterias ampliamente reconocida formada por células agregadas encerradas en una matriz autoproducida¹. Dicho ensamblaje posee firmas de multicelularidad temprana y proporciona una mayor resistencia al estrés de los sistemas bacterianos. Las biopelículas suelen ser tolerantes a los antimicrobianos y se estima que son responsables de casi el 80% de las infecciones microbianas ^2,3.

Los cultivos en matraz y en placa han sido tradicionalmente las prácticas habituales para el cultivo bacteriano. Su enorme aceptabilidad y éxito se pueden atribuir a su facilidad de manejo, reproducibilidad y escalabilidad. Sin embargo, la falta de contexto fisiológico limita el potencial traslacional del conocimiento generado utilizando dichos sistemas⁴. Por lo tanto, las biopelículas se están convirtiendo en un sistema modelo atractivo para estudiar la fisiopatología bacteriana. Las biopelículas proporcionan un sistema modelo dinámico, que refleja de cerca las condiciones naturales, lo que permite a los investigadores replicar aspectos fisiológicos como los gradientes de nutrientes y la heterogeneidad espacial ^5,6.

El estilo de vida de la biopelícula es particularmente pertinente en los estudios de micobacterias, ya que las micobacterias, incluida la notoria Mycobacterium tuberculosis, son hábiles formadoras de biopelículas⁷. Su capacidad para prosperar dentro de las biopelículas contribuye a su persistencia en los tejidos del huésped durante las infecciones. Plantea un desafío formidable en el tratamiento de enfermedades micobacterianas, dada la resistencia inherente a los antibióticos asociada con los estilos de vida de las biopelículas⁸. Las biopelículas también proporcionan un sistema modelo ideal para estudiar el metabolismo de las micobacterias, ya que permiten la investigación de las adaptaciones metabólicas únicas y las estrategias de utilización de nutrientes empleadas por las micobacterias dentro de comunidades microbianas complejas⁹.

Si bien el biofilm está siendo cada vez más aceptado como un mejor sistema modelo para los estudios de micobacterias¹⁰, existe la necesidad de procedimientos operativos estándar consistentes y reproducibles, especialmente para establecer paralelismos entre los estudios realizados en diferentes laboratorios. El método descrito aquí describe los procedimientos de formación de biopelículas para una especie micobacteriana, M. smegmatis. M. smegmatis es un modelo más accesible para el estudio de biopelículas micobacterianas, dada su no patogenicidad y su cinética de formación de biopelículas más rápida. El método puede modificarse para adaptarse a aplicaciones como el cribado de antimicobacterias, la extracción de metabolitos y los estudios ómicos.

Protocolo

Los detalles de todos los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. La preparación mediática de Sauton

1. Prepare 50 mL de solución de fosfato de dihidrógeno potásico al 2,5% pesando cuidadosamente 1,25 g de fosfato de dihidrógeno potásico y disolviéndolo en 50 mL de agua desionizada.
2. Preparar 50 mL de solución de sulfato de magnesio al 2,5% pesando 2,56 g de sulfato de magnesio y disolviéndolo en 50 mL de agua desionizada.
3. Preparar 10 mL de solución de citrato de amonio férrico al 5% pesando 0,5 g de citrato de amonio férrico y disolviéndolo en 10 mL de agua desionizada. Guárdalo en un tubo de color ámbar.
4. Preparar 100 mL de solución de glucosa al 20% pesando 20 g de glucosa y disolviéndola en 100 mL de agua desionizada. Filtrar-esterilizar utilizando una jeringa estéril de 50 mL y un filtro de jeringa de PVDF de 0,2 μM en un tubo.
5. Prepare 10 mL de solución estéril de sulfato de zinc al 1% pesando cuidadosamente 0,1 g de sulfato de zinc y disolviéndolo en 10 mL de agua desionizada. Filtrar-esterilizar utilizando una jeringa estéril de 10 mL y un filtro de jeringa de PVDF de 0,2 μM en la capucha laminar.
6. Mezcle los componentes preparados en 750 mL de agua desionizada como se describe en la Tabla 1. Mida el pH de la solución y ajústelo a 7. Compensar el volumen a 900 mL con agua desionizada.
7. Autoclave el medio a 15 PSI y 121 °C durante 15-20 min. Deja que se enfríe. A continuación, añada 100 μL de sulfato de zinc al 1% esterilizado con filtro. Añadir 100 mL de glucosa al 20% esterilizada con filtro y disolver bien.

2. Preparación de Tween-80 esterilizado por filtro al 5%

1. Disuelva 0,5 mL de Tween-80 en 9,5 mL de agua desionizada.
2. Filtre-esterilice la solución utilizando una jeringa estéril de 10 ml y un filtro de jeringa de PVDF de 0,2 μM en la funda laminar.

3. Preparación de la cultura primaria

1. En la campana laminar, utilice una pipeta serológica para dispensar 2 mL de medios LB esterilizados en autoclave en dos tubos de ensayo estériles de 14 mL.
2. Añada 20 μL de Tween-80 al 5% esterilizado por filtro a los tubos de ensayo con una micropipeta.
3. Inocular M. smegmatis en uno de los tubos añadiendo su crioculada mediante un asa de inoculación. El otro tubo de ensayo sirve como control de medios.
4. Incubar los tubos durante 48 h en una incubadora agitadora a 300 rpm y 37 °C.
   NOTA: El tubo de control de medios no debe mostrar ningún crecimiento.

4. Preparación de la cultura secundaria

1. En la campana laminar, utilice una pipeta serológica para dispensar 2 mL de medios LB esterilizados en autoclave en dos tubos de ensayo estériles de 14 mL.
2. Añada 20 μL de Tween-80 al 5% esterilizado por filtro a los tubos de ensayo con una micropipeta.
3. Añada 20 μL del cultivo primario a uno de los tubos con una micropipeta. Mantenga el otro tubo como control de medios.
4. Incubar los cultivos en una incubadora agitadora a 300 rpm y 37 °C hasta que alcancen un diámetro exterior de₆₀₀ de 0,6 a 0,8.
   NOTA: Por lo general, se tarda de 12 a 14 horas en alcanzar un OD₆₀₀ de 0,6 a 0,8. También se pueden utilizar otras densidades de celdas, pero un valor definido de OD₆₀₀ ayuda con los estudios comparativos.

5. Configuración de la biopelícula

1. En la campana laminar, dispense 6 ml de los medios de Sauton suplementados con glucosa al 2% en cada pocillo de una placa de 6 pocillos utilizando una pipeta serológica.
2. Inocular los pocillos respectivos con 120 μL (es decir, 2%) del inóculo secundario utilizando una micropipeta. Mantenga uno sin inocular bien como un control de medios.
3. Mezcle el medio y el cultivo pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta de 1 ml. Cubra la tapa y selle cuidadosamente la placa con una película de parafina.
4. Incubar la placa sin perturbaciones en una incubadora estática a 37 °C durante 7 días.

6. Configuración de biopelículas para observaciones específicas de la etapa

NOTA: La configuración general de la biopelícula es la misma que se describe en el paso 5. Para cosechar o obtener imágenes de la biopelícula en diferentes momentos, se sugiere que la misma biopelícula se configure en varios conjuntos en placas separadas.

1. Para observar las biopelículas entre el día 3 y el día 6, prepare cuatro placas con condiciones idénticas y use una placa por día para la toma de imágenes.
   NOTA: La capa de biopelícula comienza a aparecer en la interfaz aire-medio a partir del tercer día de configuración de la placa.

7. Estimación del desarrollo de la biopelícula

1. Estimación visual
   1. Visualice las placas utilizando un sistema de documentación en gel con iluminación de luz epiblanca (Figura 1).
      NOTA: Las imágenes proporcionan una estimación cualitativa y cuantitativa bruta de la biopelícula formada. Cualquier cámara de buena calidad se puede utilizar como alternativa.
2. Estimación del peso seco
   1. Realice mediciones de peso seco para una cuantificación más precisa.
   2. Para medir el peso seco, comience pesando un papel secante.
      NOTA: También se puede usar papel de filtro en lugar de papel secante.
   3. Extraiga la biopelícula de la placa de 6 pocillos y transfiérala al papel con una espátula.
   4. Recoja cuidadosamente la mayor parte de la biopelícula del cultivo, teniendo cuidado de no transferir cantidades excesivas del medio al papel.
   5. Coloque el biofilm sobre el papel secante.
   6. Colóquelo en una incubadora a 50 °C durante 0,5-1 h hasta que el biofilm se seque por completo.
   7. Mida el peso combinado del papel y la biopelícula.
      NOTA: Peso seco de la biopelícula = (Peso de la biopelícula + papel) - (Peso del papel)

8. Ensayo de tolerancia a antibióticos en biofilms

1. Estimar la MIC90 de rifampicina en cultivo planctónico de M. smegmatis siguiendo el protocolo descrito por Irith Wiegand et al. utilizando los medios de Sauton¹¹. Añadir el antibiótico cuando los cultivos alcancen una DO₆₀₀ de 0,2.
2. Configure las placas para el crecimiento de la biopelícula como se describe en el paso 5 del protocolo.
3. Al cuarto día de incubación, agregue rifampicina a los cultivos a la concentración MIC90 (64 μg/mL) desde los lados del pocillo usando una micropipeta en la campana laminar.
   NOTA: Haga esto con cuidado sin alterar demasiado la biopelícula. Deje uno de los pozos con biopelícula sin tratar.
4. Agite lentamente los platos para mezclar los antibióticos.
5. Cubra los lados de las placas con una película de parafina y manténgalas en la incubadora para un mayor crecimiento.
6. Pasadas 24 h, retirar las placas de la campana laminar y añadir Tween-80 hasta una concentración final del 0,2% en todos los pocillos que contengan biofilm.
7. Una vez más, cubra las placas con una película de parafina y manténgalas a 4 °C y 100 rpm durante 12 h.
8. Extraiga las placas en una campana laminar y homogeneice los componentes con una micropipeta de 1 mL.
9. Lave los componentes con los medios de Sauton utilizando el protocolo descrito en Anand et ^al.12.
10. Finalmente, vuelva a suspender las células en el medio de Sauton de 6 ml y diluya hasta concentraciones finales de ^10-4, ^10-5, ^10-6 y ^10-7.
11. Extienda 100 μL de cada dilución en placas de agar LB utilizando perlas de vidrio esterilizadas en autoclave.
12. Selle todas las placas con una película de parafina y manténgalas en una incubadora a 37 °C.
13. Después de 3 días de incubación, cuente las colonias en cada plato. Solo considere las placas con un recuento de colonias entre 30 y 300.
14. Calcule UFC/mL y la disminución relativa de UFC/mL utilizando las fórmulas proporcionadas¹³.
    NOTA: UFC/mL = (Nº de colonias × factor de dilución) / (Volumen plateado (en mL))
    Disminución relativa de UFC/mL = ((UFC/mL en No Tratados - UFC/mL en Tratados)) / ((UFC/mL en No Tratados)) × 100

Resultados

Las películas de biofilm se hacen visibles a simple vista a partir del tercer día. Aunque la biopelícula crece en los medios de Sauton sin un 2% de glucosa, se observó una mejora en la reticulación cuando se añadió. Obtuvimos 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) de peso seco de biofilm de cada pocillo de una placa de 24 pocillos con 1,5 mL de medio de Sauton (suplementado con glucosa al 2%) cultivado durante cuatro días. En la Figura 2, el desarrollo de la bi...

Discusión

El estilo de vida multicelular de los microbios fue descrito hace casi un siglo; Sin embargo, los estudios clínicos siguen siendo escasos, principalmente debido a la falta de métodos robustos¹⁴. Los métodos descritos en los trabajos sobre biología de biopelículas son a menudo difíciles de adaptar. En este caso, se espera que la metodología detallada, con la ayuda de demostraciones de pasos críticos, mejore la reproducibilidad de los protocolos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251