Crescita del biofilm micobatterico come modello per studiare la resistenza antimicrobica

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo robusto per lo sviluppo di biofilm a pellicola. Il metodo è scalabile a diversi volumi di coltura, consentendo una facile adozione per vari obiettivi sperimentali. La progettazione del metodo consente una valutazione qualitativa o quantitativa del potenziale di formazione del biofilm di diverse specie di micobatteri.

Abstract

Molti batteri prosperano in intricate comunità naturali, esibendo attributi chiave della multicellularità come la comunicazione, la cooperazione e la competizione. La manifestazione più diffusa del comportamento multicellulare batterico è la formazione di biofilm, spesso legati alla patogenicità. I biofilm offrono un rifugio contro gli agenti antimicrobici, favorendo l'emergere della resistenza antimicrobica. La pratica convenzionale di coltivare batteri in colture liquide di palloni non riesce a rappresentare la loro corretta crescita fisiologica in natura, limitando di conseguenza la nostra comprensione delle loro intricate dinamiche. In particolare, i profili metabolici e trascrizionali dei batteri che risiedono nei biofilm assomigliano molto a quelli delle cellule in crescita naturale. Questo parallelismo sottolinea l'importanza dei biofilm come modello ideale per la ricerca di base e traslazionale. Questo articolo si concentra sull'utilizzo di Mycobacterium smegmatis come organismo modello per illustrare una tecnica per la coltivazione di biofilm a pellicola. L'approccio è adattabile a vari volumi di coltura, facilitandone l'implementazione per diversi obiettivi sperimentali come gli studi antimicrobici. Inoltre, la progettazione del metodo consente la valutazione qualitativa o quantitativa delle capacità di formazione del biofilm di diverse specie di micobatteri con piccoli aggiustamenti.

Introduzione

I batteri sono in grado di sopravvivere come entità unicellulari; Tuttavia, nella maggior parte delle condizioni fisiologicamente rilevanti, si organizzano in mimetici di comunità. Il biofilm è un'organizzazione comunitaria ampiamente riconosciuta di batteri formati da cellule aggregate racchiuse in una matrice autoprodotta¹. Tale assemblaggio possiede firme di multicellularità precoce e fornisce una maggiore resilienza allo stress ai sistemi batterici. I biofilm sono spesso tolleranti agli antimicrobici e si stima che siano responsabili di quasi l'80% delle infezioni microbiche ^2,3.

Le colture a base di fiasche e piastre sono state tradizionalmente le pratiche abituali per la coltura batterica. La loro enorme accettabilità e successo possono essere attribuiti alla loro facilità di gestione, riproducibilità e scalabilità. Tuttavia, la mancanza di un contesto fisiologico limita il potenziale traduttivo della conoscenza generata utilizzando tali sistemi⁴. Pertanto, i biofilm stanno diventando un sistema modello attraente per studiare la fisiopatologia batterica. I biofilm forniscono un sistema di modelli dinamico, che rispecchia da vicino le condizioni naturali, consentendo ai ricercatori di replicare aspetti fisiologici come i gradienti di nutrienti e l'eterogeneità spaziale ^5,6.

Lo stile di vita del biofilm è particolarmente pertinente negli studi sui micobatteri, poiché i micobatteri, incluso il famigerato Mycobacterium tuberculosis, sono abili formatori di biofilm⁷. La loro capacità di prosperare all'interno dei biofilm contribuisce alla loro persistenza nei tessuti dell'ospite durante le infezioni. Rappresenta una sfida formidabile nel trattamento delle malattie micobatteriche, data l'intrinseca resistenza agli antibiotici associata agli stili di vita del biofilm⁸. I biofilm forniscono anche un sistema modello ideale per studiare il metabolismo micobatterico, in quanto consentono di studiare gli adattamenti metabolici unici e le strategie di utilizzo dei nutrienti impiegate dai micobatteri all'interno di comunità microbiche complesse⁹.

Mentre il biofilm è sempre più accettato come un sistema modello migliore per gli studi sui micobatteri¹⁰, c'è bisogno di procedure operative standard coerenti e riproducibili, soprattutto per tracciare parallelismi tra gli studi condotti in diversi laboratori. Il metodo qui descritto descrive le procedure di formazione del biofilm per una specie micobatterica, M. smegmatis. M. smegmatis è un modello più accessibile per lo studio dei biofilm micobatterici, data la sua non patogenicità e la cinetica di formazione del biofilm più rapida. Il metodo può essere modificato per adattarsi ad applicazioni come lo screening antimicobatterico, l'estrazione di metaboliti e gli studi omici.

Protocollo

I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. La preparazione dei media di Sauton

1. Preparare 50 mL di soluzione di diidrogeno fosfato di potassio al 2,5% pesando attentamente 1,25 g di diidrogeno fosfato di potassio e sciogliendolo in 50 mL di acqua deionizzata.
2. Preparare 50 ml di soluzione di solfato di magnesio al 2,5% pesando 2,56 g di solfato di magnesio e sciogliendoli in 50 ml di acqua deionizzata.
3. Preparare 10 mL di soluzione di citrato di ammonio ferrico al 5% pesando 0,5 g di citrato di ammonio ferrico e sciogliendolo in 10 mL di acqua deionizzata. Conservalo in un tubo d'ambra.
4. Preparare 100 mL di soluzione di glucosio al 20% pesando 20 g di glucosio e sciogliendoli in 100 mL di acqua deionizzata. Filtrare-sterilizzare utilizzando una siringa sterile da 50 mL e un filtro per siringa in PVDF da 0,2 μM in una provetta.
5. Preparare 10 mL di soluzione sterile di solfato di zinco all'1% pesando attentamente 0,1 g di solfato di zinco e sciogliendolo in 10 mL di acqua deionizzata. Sterilizzare con filtro utilizzando una siringa sterile da 10 ml e un filtro per siringa in PVDF da 0,2 μM nella cappa laminare.
6. Miscelare i componenti preparati in 750 mL di acqua deionizzata come descritto nella Tabella 1. Misurare il pH della soluzione e regolarlo a 7. Portare il volume a 900 ml con acqua deionizzata.
7. Autoclavare il fluido a 15 PSI e 121 °C per 15-20 minuti. Lasciate raffreddare. Quindi, aggiungere 100 μl di solfato di zinco all'1% sterilizzato con filtro. Aggiungere 100 ml di glucosio al 20% sterilizzato con filtro e scioglierlo bene.

2. Preparazione di filtro sterilizzato al 5% Tween-80

1. Sciogliere 0,5 mL di Tween-80 in 9,5 mL di acqua deionizzata.
2. Sterilizzare la soluzione con filtro utilizzando una siringa sterile da 10 ml e un filtro per siringa in PVDF da 0,2 μM nella cappa laminare.

3. Preparazione della coltura primaria

1. Nella cappa laminare, utilizzare una pipetta sierologica per erogare 2 mL di terreno LB autoclavato in due provette sterili da 14 mL.
2. Aggiungere 20 μl di Tween-80 al 5% sterilizzato con filtro alle provette utilizzando una micropipetta.
3. Inoculare M. smegmatis in una delle provette aggiungendo il suo crio-stock utilizzando un ciclo di inoculazione. L'altra provetta funge da controllo del fluido.
4. Incubare le provette per 48 ore in un incubatore con agitatore a 300 giri/min e 37 °C.
   NOTA: Il tubo di controllo del supporto non deve mostrare alcuna crescita.

4. Preparazione della coltura secondaria

1. Nella cappa laminare, utilizzare una pipetta sierologica per erogare 2 mL di terreno LB autoclavato in due provette sterili da 14 mL.
2. Aggiungere 20 μl di Tween-80 al 5% sterilizzato con filtro alle provette utilizzando una micropipetta.
3. Aggiungere 20 μl della coltura primaria a una delle provette utilizzando una micropipetta. Tenete l'altro tubo come controllo multimediale.
4. Incubare le colture in un incubatore shaker a 300 giri/min e 37 °C fino a raggiungere un OD₆₀₀ compreso tra 0,6 e 0,8.
   NOTA: In genere sono necessarie dalle 12 alle 14 ore per raggiungere un OD₆₀₀ compreso tra 0,6 e 0,8. Possono essere utilizzate anche altre densità cellulari, ma un valore OD₆₀₀ definito aiuta con gli studi comparativi.

5. Impostazione del biofilm

1. Nella cappa laminare, erogare 6 mL di terreno di Sauton integrato con glucosio al 2% in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti utilizzando una pipetta sierologica.
2. Inoculare i rispettivi pozzetti con 120 μl (cioè il 2%) di inoculo secondario utilizzando una micropipetta. Tenerne uno non inoculato bene come un controllo dei media.
3. Miscelare il terreno e la coltura pipettando su e giù con una micropipetta da 1 ml. Coprire il coperchio e sigillare accuratamente il piatto con pellicola di paraffina.
4. Incubare la piastra indisturbata in un'incubatrice statica a 37 °C per 7 giorni.

6. Impostazione di biofilm per osservazioni specifiche dello stadio

NOTA: La configurazione generale del biofilm è la stessa descritta al punto 5. Per raccogliere o visualizzare il biofilm in momenti diversi, si suggerisce di impostare lo stesso biofilm in più set su piastre separate.

1. Per osservare i biofilm tra il giorno 3 e il giorno 6, preparare quattro piastre con condizioni identiche e utilizzare una piastra al giorno per l'imaging.
   NOTA: Lo strato di biofilm inizia ad apparire sull'interfaccia aria-mezzo a partire dal terzo giorno di configurazione della piastra.

7. Stima dello sviluppo del biofilm

1. Stima visiva
   1. Visualizzare le lastre utilizzando un sistema di documentazione su gel con illuminazione a luce bianca epi (Figura 1).
      NOTA: L'imaging fornisce una stima qualitativa e quantitativa lorda del biofilm formato. In alternativa è possibile utilizzare qualsiasi fotocamera di buona qualità.
2. Stima del peso a secco
   1. Eseguire la misurazione del peso secco per una quantificazione più precisa.
   2. Per misurare il peso secco, inizia pesando una carta assorbente.
      NOTA: La carta da filtro può essere utilizzata anche al posto della carta assorbente.
   3. Estrarre il biofilm dalla piastra a 6 pozzetti e trasferirlo sulla carta utilizzando una spatola.
   4. Raccogli con cura la maggior parte del biofilm dalla coltura, facendo attenzione a non trasferire quantità eccessive di terreno sulla carta.
   5. Posizionare il biofilm sulla carta assorbente.
   6. Metterlo in un incubatore a 50 °C per 0,5-1 h fino a quando il biofilm non si asciuga completamente.
   7. Misurare il peso combinato della carta e del biofilm.
      NOTA: Peso a secco del biofilm = (Peso del biofilm + carta) - (Peso della carta)

8. Saggio di tolleranza agli antibiotici nei biofilm

1. Stimare la MIC90 della rifampicina nella coltura planctonica di M. smegmatis seguendo il protocollo descritto da Irith Wiegand et al. utilizzando il terreno di Sauton¹¹. Aggiungere l'antibiotico quando le colture raggiungono un OD₆₀₀ di 0,2.
2. Impostare le piastre per la crescita del biofilm come descritto nella fase 5 del protocollo.
3. Il quarto giorno di incubazione, aggiungere rifampicina alle colture alla concentrazione di MIC90 (64 μg/mL) dai lati del pozzetto utilizzando una micropipetta nella cappa laminare.
   NOTA: Fallo con attenzione senza disturbare troppo il biofilm. Lasciare uno dei pozzetti con biofilm non trattato.
4. Agitare lentamente le piastre per mescolare gli antibiotici.
5. Copri i lati delle piastre con pellicola di paraffina e tienile nell'incubatrice per un'ulteriore crescita.
6. Dopo 24 h, rimuovere le piastre dalla cappa laminare e aggiungere Tween-80 ad una concentrazione finale dello 0,2% in tutti i pozzetti contenenti biofilm.
7. Ancora una volta, coprire le piastre con pellicola di paraffina e mantenerle a 4 °C e 100 giri/min per 12 h.
8. Estrarre le piastre in una cappa laminare e omogeneizzare i componenti con una micropipetta da 1 mL.
9. Lavare i componenti con il terreno di Sauton utilizzando il protocollo descritto in Anand et ^al.12.
10. Infine, risospendere le cellule in 6 mL di terreno di Sauton e diluirle alle concentrazioni finali di ^10-4, ^10-5, ^10-6 e ^10-7.
11. Distribuire 100 μl di ciascuna diluizione su piastre LB-agar utilizzando perle di vetro autoclavate.
12. Sigillare tutte le piastre con pellicola di paraffina e conservarle in un'incubatrice a 37 °C.
13. Dopo 3 giorni di incubazione, contare le colonie su ogni piastra. Considera solo le piastre con un numero di colonie compreso tra 30 e 300.
14. Calcolare CFU/mL e la relativa diminuzione di CFU/mL utilizzando le formule fornite¹³.
    NOTA: CFU/mL = (N. di colonie × fattore di diluizione) / (Volume placcato (in mL))
    Diminuzione relativa di CFU/mL = ((CFU/mL in Non Trattato - CFU/mL in Trattato)) / ((CFU/mL in Non Trattato)) × 100

Risultati

Le pellicole di biofilm diventano visibili ad occhio nudo a partire dal terzo giorno. Sebbene il biofilm cresca sui terreni di Sauton senza il 2% di glucosio, è stato osservato un miglioramento nella reticolazione quando è stato aggiunto. Abbiamo ottenuto 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) di peso secco del biofilm da ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 1,5 mL di terreno di Sauton (integrato con glucosio al 2%) coltivato per quattro giorni. Nella Figura 2

Discussione

Lo stile di vita multicellulare dei microbi è stato descritto quasi un secolo fa; Tuttavia, gli studi clinici rimangono scarsi, principalmente a causa della mancanza di metodi robusti¹⁴. I metodi descritti nei lavori sulla biologia del biofilm sono spesso difficili da adattare. In questo caso, la metodologia dettagliata, aiutata da dimostrazioni di passaggi critici, dovrebbe migliorare la riproducibilità dei protocolli.

Il metodo di p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251