Crescita del biofilm micobatterico come modello per studiare la resistenza antimicrobica

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo robusto per lo sviluppo di biofilm a pellicola. Il metodo è scalabile a diversi volumi di coltura, consentendo una facile adozione per vari obiettivi sperimentali. La progettazione del metodo consente una valutazione qualitativa o quantitativa del potenziale di formazione del biofilm di diverse specie di micobatteri.

Abstract

Molti batteri prosperano in intricate comunità naturali, esibendo attributi chiave della multicellularità come la comunicazione, la cooperazione e la competizione. La manifestazione più diffusa del comportamento multicellulare batterico è la formazione di biofilm, spesso legati alla patogenicità. I biofilm offrono un rifugio contro gli agenti antimicrobici, favorendo l'emergere della resistenza antimicrobica. La pratica convenzionale di coltivare batteri in colture liquide di palloni non riesce a rappresentare la loro corretta crescita fisiologica in natura, limitando di conseguenza la nostra comprensione delle loro intricate dinamiche. In particolare, i profili metabolici e trascrizionali dei batteri che risiedono nei biofilm assomigliano molto a quelli delle cellule in crescita naturale. Questo parallelismo sottolinea l'importanza dei biofilm come modello ideale per la ricerca di base e traslazionale. Questo articolo si concentra sull'utilizzo di Mycobacterium smegmatis come organismo modello per illustrare una tecnica per la coltivazione di biofilm a pellicola. L'approccio è adattabile a vari volumi di coltura, facilitandone l'implementazione per diversi obiettivi sperimentali come gli studi antimicrobici. Inoltre, la progettazione del metodo consente la valutazione qualitativa o quantitativa delle capacità di formazione del biofilm di diverse specie di micobatteri con piccoli aggiustamenti.

Introduzione

I batteri sono in grado di sopravvivere come entità unicellulari; Tuttavia, nella maggior parte delle condizioni fisiologicamente rilevanti, si organizzano in mimetici di comunità. Il biofilm è un'organizzazione comunitaria ampiamente riconosciuta di batteri formati da cellule aggregate racchiuse in una matrice autoprodotta¹. Tale assemblaggio possiede firme di multicellularità precoce e fornisce una maggiore resilienza allo stress ai sistemi batterici. I biofilm sono spesso tolleranti agli antimicrobici e si stima che siano responsabili di quasi l'80% delle infezioni microbiche ^2,3....

Protocollo

I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. La preparazione dei media di Sauton

1. Preparare 50 mL di soluzione di diidrogeno fosfato di potassio al 2,5% pesando attentamente 1,25 g di diidrogeno fosfato di potassio e sciogliendolo in 50 mL di acqua deionizzata.
2. Preparare 50 ml di soluzione di solfato di magnesio al 2,5% pesando 2,56 g di solfato di magnesio e sciogliendoli in 50 ml di acqua deionizzata.
3. Preparare 10 mL di soluzione di citrato di ammonio ferrico al 5% pesa....

Discussione

Lo stile di vita multicellulare dei microbi è stato descritto quasi un secolo fa; Tuttavia, gli studi clinici rimangono scarsi, principalmente a causa della mancanza di metodi robusti¹⁴. I metodi descritti nei lavori sulla biologia del biofilm sono spesso difficili da adattare. In questo caso, la metodologia dettagliata, aiutata da dimostrazioni di passaggi critici, dovrebbe migliorare la riproducibilità dei protocolli.

Il metodo di p.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251