生长分枝杆菌生物膜作为研究抗菌素耐药性的模型

摘要

该协议描述了一种用于显影薄膜生物膜的稳健方法。该方法可扩展到不同的培养体积，可轻松用于各种实验目标。该方法的设计能够对几种分枝杆菌物种的生物膜形成潜力进行定性或定量评估。

摘要

许多细菌在错综复杂的自然群落中茁壮成长，表现出多细胞性的关键属性，例如交流、合作和竞争。细菌多细胞行为最普遍的表现是生物膜的形成，这通常与致病性有关。生物膜提供了对抗抗菌剂的避风港，促进了抗菌素耐药性的出现。在摇瓶液体培养物中培养细菌的传统做法无法代表它们在自然界中的适当生理生长，从而限制了我们对它们错综复杂的动力学的理解。值得注意的是，驻留在生物膜中的细菌的代谢和转录谱与自然生长的细胞非常相似。这种平行性强调了生物膜作为基础和转化研究理想模型的重要性。本文重点介绍利用 耻垢分枝杆菌 作为模式生物来说明一种培养表膜生物膜的技术。该方法适用于各种培养物体积，有助于其在不同的实验目标（如抗菌研究）中的实施。此外，该方法的设计能够对不同分枝杆菌物种的生物膜形成能力进行定性或定量评估，只需稍作调整即可。

引言

细菌能够作为单细胞实体生存;然而，在大多数生理相关条件下，它们组织成群落模拟物。生物膜是一种广泛认可的细菌群落组织，由包裹在自身产生的基质中的聚集细胞形成¹。这种组装具有早期多细胞性的特征，并对细菌系统提供更高的压力恢复力。生物膜通常对抗菌剂具有耐受性，据估计，生物膜几乎是造成 80% 的微生物感染的原因 ^2,3。

传统上，摇瓶和平板培养是细菌培养的常用方法。它们的巨大可接受性和成功可归因于它们的易处理性、可重复性和可扩展性。然而，缺乏生理学背景限制了使用此类系统生成的知识的转化潜力⁴。因此，生物膜正在成为研究细菌病理生理学的有吸引力的模型系统。生物膜提供了一个动态模型系统，与自然条件密切相关，使研究人员能够复制营养梯度和空间异质性等生理方面 ^5,6。

生物膜生活方式与分枝杆菌研究特别相关，因为分枝杆菌，包括臭名昭著的 结核分枝杆菌，是熟练的生物膜形成者⁷。它们在生物膜中茁壮成长的能力有助于它们在感染期间在宿主组织中的持久性。鉴于与生物膜生活方式相关的固有抗生素耐药性，它在治疗分枝杆菌疾病方面构成了巨大的挑战⁸。生物膜还为研究分枝杆菌代谢提供了一个理想的模型系统，因为它们允许研究分枝杆菌在复杂微生物群落中采用的独特代谢适应和营养利用策略⁹。

虽然生物膜越来越被接受为分枝杆菌研究的更好模型系统¹⁰，但需要一致且可重复的标准操作程序，尤其是为了在不同实验室进行的研究之间进行比较。此处概述的方法描述了分枝杆菌物种 M. smegmatis 的生物膜形成程序。 M. smegmatis 是研究分枝杆菌生物膜的更容易获得的模型，因为它具有非致病性和更快的生物膜形成动力学。该方法可进行修改，以适应抗分枝杆菌筛选、代谢物提取和组学研究等应用。

研究方案

材料 表中列出了用于研究的所有试剂和设备的详细信息。

1. Sauton 的培养基制备

1. 仔细称取 1.25 g 磷酸二氢钾并将其溶解在 50 mL 去离子水中，制备 50 mL 2.5% 磷酸二氢钾溶液。
2. 称取 2.56 g 硫酸镁并将其溶解在 50 mL 去离子水中，制备 50 mL 2.5% 硫酸镁溶液。
3. 称取 0.5 g 柠檬酸铁铵并将其溶解在 10 mL 去离子水中，制备 10 mL 5% 柠檬酸铁铵溶液。将其存放在琥珀色管中。
4. 称取 20 g 葡萄糖并将其溶解在 100 mL 去离子水中，制备 100 mL 20% 葡萄糖溶液。使用管中的 50 mL 无菌注射器和 0.2 μM PVDF 注射器过滤器进行过滤灭菌。
5. 仔细称取 0.1 g 硫酸锌并将其溶解在 10 mL 去离子水中，制备 10 mL 无菌 1% 硫酸锌溶液。在层流罩中使用 10 mL 无菌注射器和 0.2 μM PVDF 注射器过滤器进行过滤灭菌。
6. 如 表 1 所述，将制备的组分与 750 mL 去离子水混合。测量溶液的 pH 值并将其调节至 7。用去离子水补足至 900 mL。
7. 将培养基在 15 PSI 和 121 °C 下高压灭菌 15-20 分钟。让它冷却下来。然后，加入 100 μL 过滤灭菌的 1% 硫酸锌。加入 100 mL 过滤灭菌的 20% 葡萄糖并充分溶解。

2. 过滤灭菌 5% Tween-80 的制备

1. 将 0.5 mL Tween-80 溶于 9.5 mL 去离子水中。
2. 在层流罩中使用 10 mL 无菌注射器和 0.2 μM PVDF 注射器过滤器对溶液进行过滤灭菌。

3. 制备原代培养物

1. 在层流罩中，使用血清移液管将 2 mL 高压灭菌的 LB 培养基分配到两个无菌 14 mL 试管中。
2. 使用微量移液管向试管中加入 20 μL 过滤灭菌的 5% Tween-80。
3. 通过使用接种环添加其冷冻原液，将 M. smegmatis 接种到其中一个试管中。另一个试管用作介质对照。
4. 将试管在摇床培养箱中以 300 rpm 和 37 °C 孵育 48 小时。
   注意:培养基对照管不应出现任何生长。

4. 制备次级培养物

1. 在层流罩中，使用血清移液管将 2 mL 高压灭菌的 LB 培养基分配到两个无菌 14 mL 试管中。
2. 使用微量移液管向试管中加入 20 μL 过滤灭菌的 5% Tween-80。
3. 使用微量移液器将 20 μL 原代培养物添加到其中一个试管中。保留另一根管子作为介质对照。
4. 将培养物在摇床培养箱中以 300 rpm 和 37 °C 孵育，直到它们达到 0.6 至 0.8 的 OD₆₀₀ 。
   注意:通常需要 12 到 14 小时才能达到 0.6 至 0.8 的 OD₆₀₀ 。也可以使用其他细胞密度，但定义的 OD₆₀₀ 值有助于比较研究。

5. 设置生物膜

1. 在层流罩中，使用血清移液管将 6 mL 补充有 2% 葡萄糖的 Sauton 培养基分配到 6 孔板的每个孔中。
2. 使用微量移液管用 120 μL（即 2%）的二级接种物接种相应的孔。保持一个未接种的孔作为培养基对照。
3. 通过使用 1 mL 微量移液器上下移液来混合培养基和培养物。盖上盖子，用石蜡膜小心密封板。
4. 将板在 37 °C 的静态培养箱中不受干扰地孵育 7 天。

6. 为特定阶段的观察设置生物膜

注意:整体生物膜设置与步骤 5 中描述的相同。为了在不同时间点收获或成像生物膜，建议在单独的板上将相同的生物膜分成多组设置。

1. 为了在第 3 天和第 6 天之间观察生物膜，请准备四个具有相同条件的板，每天使用一个板进行成像。
   注意:从板设置的第三天开始，生物膜层开始出现在空气-介质界面上。

7. 估计生物膜的发育

1. 视觉估计
   1. 使用具有落射白光照明的凝胶记录系统对板进行成像（图 1）。
      注意:成像给出了形成的生物膜的总体定性和定量估计。任何高质量的相机都可以用作替代品。
2. 干重估计
   1. 进行干重测量，实现更精确的定量。
   2. 要测量干重，请先称量吸墨纸。
      注意:也可以使用滤纸代替吸墨纸。
   3. 从 6 孔板中提取生物膜，并使用刮刀将其转移到纸上。
   4. 小心地从培养物中收集大部分生物膜，注意不要将过量的培养基转移到纸上。
   5. 将生物膜放在吸墨纸上。
   6. 将其置于 50 °C 的培养箱中 0.5-1 小时，直到生物膜完全干燥。
   7. 测量纸张和生物膜的总重量。
      注:生物膜干重=（生物膜重量 + 纸张）-（纸张重量）

8. 生物膜中的抗生素耐受性测定

1. 按照 Irith Wiegand 等人描述的方案，使用 Sauton 的培养基¹¹ 估计耻垢分枝杆菌浮游培养物中利福平的 MIC90。当培养物达到 OD₆₀₀ 为 0.2 时添加抗生素。
2. 按照方案步骤 5 中的说明设置用于生物膜生长的板。
3. 在孵育的第 4 天，使用层流罩中的微量移液管从孔侧面将利福平以 MIC90 浓度 （64 μg/mL） 添加到培养物中。
   注意:小心执行此操作，不要过多干扰生物膜。留下其中一个未处理生物膜的孔。
4. 缓慢旋转板以混合抗生素。
5. 用石蜡膜覆盖板的侧面，并将它们保存在培养箱中以进一步生长。
6. 24 小时后，从层流罩中取出板，并在所有含有生物膜的孔中加入 Tween-80 至终浓度为 0.2%。
7. 再次用石蜡膜覆盖板，并在 4 °C 和 100 rpm 下保持 12 小时。
8. 在层流罩中取出板，用 1 mL 微量移液器对成分进行均质化。
9. 使用 Anand 等人 ¹² 中描述的方案用 Sauton 培养基洗涤成分。
10. 最后，将细胞重悬于 6 mL Sauton 培养基中，并稀释至终浓度 ^10-4、^10-5、^10-6 和 ^10-7。
11. 使用高压灭菌的玻璃珠将 100 μL 的每种稀释液涂抹在 LB 琼脂平板上。
12. 使用石蜡膜密封所有板，并将它们保存在 37 °C 的培养箱中。
13. 孵育 3 天后，对每个平板上的菌落进行计数。仅考虑菌落计数在 30 到 300 之间的平板。
14. 使用提供的公式计算 CFU/mL 和 CFU/mL 的相对减少量¹³.
    注:CFU/mL =（菌落数×稀释因子）/（铺板体积（mL））
    CFU/mL 的相对减少 = （（未处理的 CFU/mL - 处理的 CFU/mL）） / （（未处理的 CFU/mL）） × 100

结果

从第 3 天开始，生物膜薄膜变得肉眼可见。尽管生物膜在不含 2% 葡萄糖的 Sauton 培养基上生长，但添加后观察到网状结构有所改善。我们从 24 孔板的每个孔中获得 10.48 mg ± 3.13 mg （n = 4） 的生物膜干重，其中 1.5 mL Sauton 培养基（补充有 2% 葡萄糖）生长了 4 天。 在图 2 中，从第 3 天到第 6 天可以看到生物膜的形成。它在第 3 天开始形成带有轻微网状...

讨论

微生物的多细胞生活方式在近一个世纪前就被描述过;然而，临床研究仍然很少，主要是由于缺乏稳健的方法¹⁴。生物膜生物学著作中描述的方法通常难以适应。在这里，详细的方法在关键步骤演示的辅助下，有望提高方案的可重复性。

本文中描述的生物膜生产方法是可扩展的，需要按比例增加培养基体积和接种量。代谢物提取等应?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251