Выращивание биопленки микобактерий в качестве модели для изучения устойчивости к противомикробным препаратам

Резюме

В этом протоколе описан надежный метод получения биопленки пленки. Метод может быть масштабирован на различные объемы культур, что позволяет легко использовать его для различных экспериментальных целей. Дизайн метода позволяет качественно или количественно оценить биопленкообразующий потенциал нескольких видов микобактерий.

Аннотация

Многие бактерии процветают в сложных природных сообществах, проявляя ключевые атрибуты многоклеточности, такие как общение, сотрудничество и конкуренция. Наиболее распространенным проявлением бактериального многоклеточного поведения является образование биопленок, часто связанных с патогенностью. Биопленки обеспечивают защиту от противомикробных агентов, способствуя возникновению устойчивости к противомикробным препаратам. Традиционная практика культивирования бактерий в жидких культурах из колб не отражает их надлежащий физиологический рост в природе, что ограничивает наше понимание их сложной динамики. Примечательно, что метаболические и транскрипционные профили бактерий, обитающих в биопленках, очень похожи на профили естественно растущих клеток. Этот параллелизм подчеркивает важность биопленок как идеальной модели для фундаментальных и трансляционных исследований. В данной статье основное внимание уделяется использованию Mycobacterium smegmatis в качестве модельного организма для иллюстрации метода культивирования биопленок пелликулы. Этот подход может быть адаптирован к различным объемам культур, что облегчает его реализацию для различных экспериментальных целей, таких как исследования противомикробных препаратов. Кроме того, дизайн метода позволяет качественно или количественно оценить биопленкообразующие способности различных видов микобактерий с незначительными корректировками.

Введение

Бактерии способны выживать в виде одноклеточных сущностей; Однако в большинстве физиологически значимых состояний они организуются в миметики сообщества. Биопленка — это широко признанная общественная организация бактерий, образованная агрегированными клетками, заключенными в самостоятельно производимую матрицу1^. Такая сборка обладает признаками ранней многоклеточности и обеспечивает более высокую стрессоустойчивость к бактериальным системам. Биопленки часто толерантны к противомикробным препаратам и, по оценкам, являются причиной почти 80% микробных инфекций ^2,3

протокол

Подробная информация обо всех реактивах и оборудовании, использованных для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка среды Sauton

1. Приготовьте 50 мл 2,5% раствора дигидрофосфата калия, тщательно взвесив 1,25 г дигидрофосфата калия и растворив его в 50 мл деионизированной воды.
2. Приготовьте 50 мл 2,5% раствора сульфата магния, взвесив 2,56 г сульфата магния и растворив его в 50 мл деионизированной воды.
3. Приготовьте 10 мл 5% раствора цитрата железа и аммония, весом 0,5 г цитрата железа и аммония и растворив его в 10 мл деионизиров....

Результаты

Биопленочные пленки становятся видимыми невооруженным глазом с третьего дня. Хотя биопленка растет на средах Саутона без 2% глюкозы, при его добавлении наблюдалось улучшение сетчатости. Мы получали 10,48 мг ± 3,13 мг (n = 4) сухой массы биопленки из каждой лунки 24-луночного п?.......

Обсуждение

Многоклеточный образ жизни микробов был описан почти столетие назад; Тем не менее, клинические исследования остаются редкими, в основном из-за отсутствия надежных методов¹⁴. Методы, описанные в работах по биологии биопленки, часто трудно адаптировать. Ожи.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251