Выращивание биопленки микобактерий в качестве модели для изучения устойчивости к противомикробным препаратам

Резюме

В этом протоколе описан надежный метод получения биопленки пленки. Метод может быть масштабирован на различные объемы культур, что позволяет легко использовать его для различных экспериментальных целей. Дизайн метода позволяет качественно или количественно оценить биопленкообразующий потенциал нескольких видов микобактерий.

Аннотация

Многие бактерии процветают в сложных природных сообществах, проявляя ключевые атрибуты многоклеточности, такие как общение, сотрудничество и конкуренция. Наиболее распространенным проявлением бактериального многоклеточного поведения является образование биопленок, часто связанных с патогенностью. Биопленки обеспечивают защиту от противомикробных агентов, способствуя возникновению устойчивости к противомикробным препаратам. Традиционная практика культивирования бактерий в жидких культурах из колб не отражает их надлежащий физиологический рост в природе, что ограничивает наше понимание их сложной динамики. Примечательно, что метаболические и транскрипционные профили бактерий, обитающих в биопленках, очень похожи на профили естественно растущих клеток. Этот параллелизм подчеркивает важность биопленок как идеальной модели для фундаментальных и трансляционных исследований. В данной статье основное внимание уделяется использованию Mycobacterium smegmatis в качестве модельного организма для иллюстрации метода культивирования биопленок пелликулы. Этот подход может быть адаптирован к различным объемам культур, что облегчает его реализацию для различных экспериментальных целей, таких как исследования противомикробных препаратов. Кроме того, дизайн метода позволяет качественно или количественно оценить биопленкообразующие способности различных видов микобактерий с незначительными корректировками.

Введение

Бактерии способны выживать в виде одноклеточных сущностей; Однако в большинстве физиологически значимых состояний они организуются в миметики сообщества. Биопленка — это широко признанная общественная организация бактерий, образованная агрегированными клетками, заключенными в самостоятельно производимую матрицу1^. Такая сборка обладает признаками ранней многоклеточности и обеспечивает более высокую стрессоустойчивость к бактериальным системам. Биопленки часто толерантны к противомикробным препаратам и, по оценкам, являются причиной почти 80% микробных инфекций ^2,3.

Встряхивание колб и планшетные культуры традиционно являются обычной практикой для бактериального культивирования. Их огромную приемлемость и успех можно объяснить простотой в обращении, воспроизводимостью и масштабируемостью. Однако отсутствие физиологического контекста ограничивает трансляционный потенциал знаний, полученных с помощью таких систем⁴. Таким образом, биопленки становятся привлекательной модельной системой для изучения бактериальной патофизиологии. Биопленки представляют собой динамическую модельную систему, точно отражающую природные условия, что позволяет исследователям воспроизводить физиологические аспекты, такие как градиенты питательных веществ и пространственная неоднородность ^5,6.

Биопленочный образ жизни особенно актуален в исследованиях микобактерий, поскольку микобактерии, в том числе печально известная Mycobacterium tuberculosis, являются адептами биопленкообразующих^7. Их способность процветать в биопленках способствует их стойкости в тканях хозяина во время инфекций. Это представляет собой огромную проблему в лечении микобактериальных заболеваний, учитывая присущую антибиотикам устойчивость, связанную с биопленочным образом жизни⁸. Биопленки также представляют собой идеальную модельную систему для изучения метаболизма микобактерий, поскольку они позволяют исследовать уникальные метаболические адаптации и стратегии использования питательных веществ, используемые микобактериями в сложных^{микробных} сообществах.

В то время как биопленка все чаще принимается в качестве лучшей модельной системы для исследований микобактерий10, существует потребность в последовательных и воспроизводимых стандартных операционных процедурах, особенно для проведения параллелей между исследованиями, проводимыми в различных лабораториях. Описанный здесь метод описывает процедуры формирования биопленки для вида микобактерий M. smegmatis. M. smegmatis является более доступной моделью для изучения биопленок микобактерий, учитывая ее непатогенность и более быструю кинетику образования биопленки. Метод может быть модифицирован в соответствии с такими приложениями, как скрининг антимикобактерий, экстракция метаболитов и омиксные исследования.

протокол

Подробная информация обо всех реактивах и оборудовании, использованных для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка среды Sauton

1. Приготовьте 50 мл 2,5% раствора дигидрофосфата калия, тщательно взвесив 1,25 г дигидрофосфата калия и растворив его в 50 мл деионизированной воды.
2. Приготовьте 50 мл 2,5% раствора сульфата магния, взвесив 2,56 г сульфата магния и растворив его в 50 мл деионизированной воды.
3. Приготовьте 10 мл 5% раствора цитрата железа и аммония, весом 0,5 г цитрата железа и аммония и растворив его в 10 мл деионизированной воды. Храните его в янтарной тубе.
4. Приготовьте 100 мл 20% раствора глюкозы, взвесив 20 г глюкозы и растворив ее в 100 мл деионизированной воды. Фильтр-стерилизация осуществляется с помощью стерильного шприца объемом 50 мл и шприцевого фильтра 0,2 мкМ PVDF в пробирке.
5. Приготовьте 10 мл стерильного 1% раствора сульфата цинка, тщательно взвесив 0,1 г сульфата цинка и растворив его в 10 мл деионизированной воды. Фильтр-стерилизация осуществляется с помощью стерильного шприца объемом 10 мл и шприцевого фильтра PVDF объемом 0,2 мкМ в ламинарном колпаке.
6. Подготовленные компоненты смешать с 750 мл деионизированной воды, как описано в таблице 1. Измерьте pH раствора и отрегулируйте его до 7. Восполните объем до 900 мл деионизированной водой.
7. Автоклавируйте среду при 15 PSI и 121 °C в течение 15-20 минут. Дайте ему остыть. Затем добавьте 100 μл стерилизованного фильтром 1% сульфата цинка. Добавьте 100 мл стерилизованной фильтром 20% глюкозы и хорошо растворите ее.

2. Приготовление фильтрованного стерилизованного 5% твина-80

1. Растворите 0,5 мл Tween-80 в 9,5 мл деионизированной воды.
2. Стерилизуют раствор с помощью стерильного шприца объемом 10 мл и шприцевого фильтра 0,2 мкМ PVDF в ламинарном колпаке.

3. Подготовка первичной культуры

1. В ламинарном колпаке с помощью серологической пипетки можно распределить 2 мл автоклавированной среды LB в две стерильные пробирки объемом 14 мл.
2. Добавьте 20 мкл стерилизованного фильтром 5% Tween-80 в пробирки с помощью микропипетки.
3. Инокулируйте M. smegmatis в одну из пробирок, добавив его криоматериал с помощью петли инокуляции. Другая пробирка служит в качестве контроля среды.
4. Инкубируйте пробирки в течение 48 ч в вибростенде при 300 об/мин и 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На трубке управления средой не должно быть видно роста.

4. Подготовка вторичной культуры

1. В ламинарном колпаке с помощью серологической пипетки можно распределить 2 мл автоклавированной среды LB в две стерильные пробирки объемом 14 мл.
2. Добавьте 20 мкл стерилизованного фильтром 5% Tween-80 в пробирки с помощью микропипетки.
3. Добавьте 20 мкл первичной культуры в одну из пробирок с помощью микропипетки. Держите другую трубку в качестве средства контроля среды.
4. Инкубируйте культуры в шейкерном инкубаторе при 300 об/мин и 37 °C до тех пор, пока они не достигнут наружного диаметра₆₀₀ от 0,6 до 0,8.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно требуется от 12 до 14 часов, чтобы достичь внешнего диаметра₆₀₀ от 0,6 до 0,8. Можно использовать и другие плотности ячеек, но определенное значение OD₆₀₀ помогает в сравнительных исследованиях.

5. Установка биопленки

1. В ламинарном колпаке дозируйте 6 мл среды Саутона с добавлением 2% глюкозы в каждую лунку 6-луночного планшета с помощью серологической пипетки.
2. В соответствующие лунки ввели 120 мкл (т.е. 2%) вторичного инокулюма с помощью микропипетки. Держите один из них непривитым в качестве средства контроля среды.
3. Смешайте среду и культуру, пипетируя вверх и вниз микропипеткой объемом 1 мл. Накрываем крышкой и тщательно заклеиваем тарелку парафиновой пленкой.
4. Непрерывно инкубируйте планшет в статическом инкубаторе при температуре 37 °C в течение 7 дней.

6. Настройка биопленок для стадийно-специфичных наблюдений

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая структура биопленки такая же, как описана на шаге 5. Для сбора или изображения биопленки в разные моменты времени предлагается, чтобы одна и та же биопленка была установлена в нескольких наборах на отдельных планшетах.

1. Для наблюдения биопленок в период с 3 по 6 день подготовьте четыре планшета с идентичными условиями и используйте одну пластину в день для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слой биопленки начинает появляться на границе воздух-среда, начиная с третьего дня после установки планшета.

7. Оценка развития биопленки

1. Визуальная оценка
   1. Визуализируйте пластины с помощью гелевой системы документирования с эпи-белым светом (рис. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация дает общую качественную и количественную оценку образовавшейся биопленки. В качестве альтернативы можно использовать любую камеру хорошего качества.
2. Оценка сухой массы
   1. Выполнение измерения сухого веса для более точного количественного определения.
   2. Чтобы измерить сухой вес, начните с взвешивания промокательной бумаги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо промокательной бумаги также можно использовать фильтровальную бумагу.
   3. Извлеките биопленку из 6-луночного планшета и перенесите ее на бумагу с помощью шпателя.
   4. Тщательно соберите большую часть биопленки с культуры, стараясь не перенести чрезмерное количество среды на бумагу.
   5. Поместите биопленку на промокательную бумагу.
   6. Поместите его в инкубатор при температуре 50 °C на 0,5-1 ч до полного высыхания биопленки.
   7. Измерьте общий вес бумаги и биопленки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сухая масса биопленки=(Масса биопленки + бумага)-(Масса бумаги)

8. Определение толерантности к антибиотикам в биопленках

1. Оцените MIC90 рифампицина в планктонной культуре M. smegmatis в соответствии с протоколом, описанным Irith Wiegand et al., с использованием среды Sauton¹¹. Добавляйте антибиотик, когда культуры достигнут наружного диаметра₆₀₀ 0,2.
2. Настройте планшеты для роста биопленки, как описано в шаге 5 протокола.
3. На четвертый день инкубации добавляют рифампицин в культуры в концентрации MIC90 (64 мкг/мл) с боков лунки с помощью микропипетки в ламинарном колпаке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Делайте это осторожно, не слишком повреждая биопленку. Оставьте одну из лунок с биопленкой необработанной.
4. Медленно перемешивайте пластины, чтобы смешать антибиотики.
5. Застелите боковые стороны пластин парафиновой пленкой и держите их в инкубаторе для дальнейшего выращивания.
6. Через 24 ч снимите пластины с ламинарного колпака и добавьте Твин-80 до конечной концентрации 0,2% во все лунки, содержащие биопленку.
7. Еще раз накройте пластины парафиновой пленкой и держите их при температуре 4 °C и 100 об/мин в течение 12 часов.
8. Выньте планшеты в ламинарный колпак и гомогенизируйте компоненты с помощью микропипетки объемом 1 мл.
9. Промойте компоненты средой Sauton в соответствии с протоколом, описанным в Anand et ^al.12.
10. Наконец, ресуспендируйте клетки в среде Саутона объемом 6 мл и разбавьте до конечных концентраций ^10-4, ^10-5, ^10-6 и ^10-7.
11. Распределите по 100 мкл каждого разбавления на пластины LB-агара с помощью автоклавных стеклянных шариков.
12. Запечатайте все пластины с помощью парафиновой пленки и держите их в инкубаторе при температуре 37 °C.
13. Через 3 дня инкубации подсчитайте колонии на каждой пластине. Учитывайте только тарелки с числом колоний от 30 до 300.
14. Рассчитайте КОЕ/мл и относительное уменьшение КОЕ/мл по приведенным формулам¹³.
    ПРИМЕЧАНИЕ: КОЕ/мл = (Число колоний × коэффициентом разбавления) / (Объем покрытия (в мл))
    Относительное уменьшение КОЕ/мл = ((КОЕ/мл в необработанных - КОЕ/мл в обработанных)) / ((КОЕ/мл в необработанных)) × 100

Результаты

Биопленочные пленки становятся видимыми невооруженным глазом с третьего дня. Хотя биопленка растет на средах Саутона без 2% глюкозы, при его добавлении наблюдалось улучшение сетчатости. Мы получали 10,48 мг ± 3,13 мг (n = 4) сухой массы биопленки из каждой лунки 24-луночного п?...

Обсуждение

Многоклеточный образ жизни микробов был описан почти столетие назад; Тем не менее, клинические исследования остаются редкими, в основном из-за отсутствия надежных методов¹⁴. Методы, описанные в работах по биологии биопленки, часто трудно адаптировать. Ожи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251