Crescimento de biofilme micobacteriano como modelo para estudar a resistência antimicrobiana

Resumo

Este protocolo descreve um método robusto para o desenvolvimento de biofilme de película. O método é escalável para diferentes volumes de cultura, permitindo fácil adoção para vários objetivos experimentais. O desenho do método permite a avaliação qualitativa ou quantitativa do potencial de formação de biofilme de várias espécies de micobactérias.

Resumo

Muitas bactérias prosperam em comunidades naturais intrincadas, exibindo atributos-chave de multicelularidade, como comunicação, cooperação e competição. A manifestação mais prevalente do comportamento multicelular bacteriano é a formação de biofilmes, muitas vezes ligados à patogenicidade. Os biofilmes oferecem um refúgio contra agentes antimicrobianos, promovendo o surgimento de resistência antimicrobiana. A prática convencional de cultivar bactérias em culturas líquidas de frascos agitados não representa seu crescimento fisiológico adequado na natureza, consequentemente limitando nossa compreensão de sua intrincada dinâmica. Notavelmente, os perfis metabólicos e transcricionais das bactérias que residem em biofilmes se assemelham aos das células em crescimento natural. Esse paralelismo ressalta a importância dos biofilmes como um modelo ideal para pesquisas fundamentais e translacionais. Este artigo se concentra na utilização de Mycobacterium smegmatis como um organismo modelo para ilustrar uma técnica de cultivo de biofilmes de películas. A abordagem é adaptável a vários volumes de cultura, facilitando sua implementação para diversos objetivos experimentais, como estudos antimicrobianos. Além disso, o desenho do método permite a avaliação qualitativa ou quantitativa das capacidades de formação de biofilme de diferentes espécies de micobactérias com pequenos ajustes.

Introdução

As bactérias são capazes de sobreviver como entidades unicelulares; no entanto, na maioria das condições fisiologicamente relevantes, eles se organizam em miméticos comunitários. O biofilme é uma organização comunitária amplamente reconhecida de bactérias formadas por células agregadas envoltas em uma matriz autoproduzida¹. Tal montagem possui assinaturas de multicelularidade precoce e fornece maior resiliência ao estresse para sistemas bacterianos. Os biofilmes são frequentemente tolerantes aos antimicrobianos e estima-se que sejam responsáveis por quase 80% das infecções microbianas ^2,3.

As culturas em frasco agitado e em placas têm sido tradicionalmente as práticas usuais para cultura bacteriana. Sua enorme aceitabilidade e sucesso podem ser atribuídos à sua facilidade de manuseio, reprodutibilidade e escalabilidade. No entanto, a falta de contexto fisiológico limita o potencial translacional do conhecimento gerado por meio de tais sistemas⁴. Portanto, os biofilmes estão se tornando um sistema modelo atraente para estudar a fisiopatologia bacteriana. Os biofilmes fornecem um sistema de modelo dinâmico, espelhando de perto as condições naturais, permitindo que os pesquisadores repliquem aspectos fisiológicos, como gradientes de nutrientes e heterogeneidade espacial ^5,6.

O estilo de vida do biofilme é particularmente pertinente nos estudos de micobactérias, pois as micobactérias, incluindo o notório Mycobacterium tuberculosis, são formadoras de biofilme^{adeptas 7}. Sua capacidade de prosperar dentro de biofilmes contribui para sua persistência nos tecidos hospedeiros durante as infecções. Representa um desafio formidável no tratamento de doenças micobacterianas, dada a resistência inerente aos antibióticos associada ao estilo de vida do biofilme⁸. Os biofilmes também fornecem um sistema modelo ideal para estudar o metabolismo micobacteriano, pois permitem a investigação das adaptações metabólicas únicas e estratégias de utilização de nutrientes empregadas pelas micobactérias em comunidades microbianas complexas⁹.

Embora o biofilme esteja sendo cada vez mais aceito como um sistema modelo melhor para estudos de micobactérias¹⁰, há necessidade de procedimentos operacionais padrão consistentes e reprodutíveis, especialmente para traçar paralelos entre estudos realizados em diferentes laboratórios. O método descrito aqui descreve os procedimentos de formação de biofilme para uma espécie de micobactéria, M. smegmatis. M. smegmatis é um modelo mais acessível para o estudo de biofilmes micobacterianos, dada a sua não patogenicidade e cinética de formação de biofilme mais rápida. O método pode ser modificado para se adequar a aplicações como triagem antimicobacteriana, extração de metabólitos e estudos ômicos.

Protocolo

Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de mídia de Sauton

1. Prepare 50 mL de solução de di-hidrogenofosfato de potássio a 2,5% pesando cuidadosamente 1,25 g de di-hidrogenofosfato de potássio e dissolvendo-o em 50 mL de água deionizada.
2. Prepare 50 mL de solução de sulfato de magnésio a 2,5% pesando 2,56 g de sulfato de magnésio e dissolvendo-o em 50 mL de água deionizada.
3. Prepare 10 mL de solução de citrato de amônio férrico a 5% pesando 0,5 g de citrato de amônio férrico e dissolvendo-o em 10 mL de água deionizada. Guarde-o em um tubo âmbar.
4. Prepare 100 mL de solução de glicose a 20% pesando 20 g de glicose e dissolvendo-a em 100 mL de água deionizada. Filtre-esterilize usando uma seringa estéril de 50 mL e um filtro de seringa de PVDF de 0,2 μM em um tubo.
5. Prepare 10 mL de solução estéril de sulfato de zinco a 1% pesando cuidadosamente 0,1 g de sulfato de zinco e dissolvendo-o em 10 mL de água deionizada. Filtre-esterilize usando uma seringa estéril de 10 mL e um filtro de seringa de PVDF de 0,2 μM na capa laminar.
6. Misture os componentes preparados em 750 mL de água deionizada conforme descrito na Tabela 1. Meça o pH da solução e ajuste-o para 7. Completar o volume para 900 mL com água deionizada.
7. Autoclave a mídia a 15 PSI e 121 °C por 15-20 min. Deixe esfriar. Em seguida, adicione 100 μL de sulfato de zinco a 1% esterilizado por filtro. Adicione 100 mL de glicose a 20% esterilizada por filtro e dissolva bem.

2. Preparação de Tween-80 5% esterilizado por filtro

1. Dissolva 0,5 mL de Tween-80 em 9,5 mL de água deionizada.
2. Filtre a solução esterilizada usando uma seringa estéril de 10 mL e um filtro de seringa de PVDF de 0,2 μM na capela laminar.

3. Preparando a cultura primária

1. Na coifa laminar, use uma pipeta sorológica para dispensar 2 mL de meio LB autoclavado em dois tubos de ensaio estéreis de 14 mL.
2. Adicione 20 μL de Tween-80 a 5% esterilizado por filtro aos tubos de ensaio usando uma micropipeta.
3. Inocular M. smegmatis num dos tubos , adicionando o seu estoque criogênico utilizando uma alça de inoculação. O outro tubo de ensaio serve como um controle de mídia.
4. Incubar os tubos durante 48 h numa incubadora agitadora a 300 rpm e 37 °C.
   NOTA: O tubo de controle de mídia não deve mostrar nenhum crescimento.

4. Preparando a cultura secundária

1. Na coifa laminar, use uma pipeta sorológica para dispensar 2 mL de meio LB autoclavado em dois tubos de ensaio estéreis de 14 mL.
2. Adicione 20 μL de Tween-80 a 5% esterilizado por filtro aos tubos de ensaio usando uma micropipeta.
3. Adicione 20 μL da cultura primária a um dos tubos usando uma micropipeta. Mantenha o outro tubo como um controle de mídia.
4. Incubar as culturas em uma incubadora agitadora a 300 rpm e 37 °C até atingirem um OD₆₀₀ de 0,6 a 0,8.
   NOTA: Geralmente, leva de 12 a 14 horas para atingir um OD₆₀₀ de 0,6 a 0,8. Outras densidades celulares também podem ser usadas, mas um valor OD₆₀₀ definido ajuda em estudos comparativos.

5. Configurando o biofilme

1. Na coifa laminar, dispense 6 mL de meio de Sauton suplementado com glicose a 2% em cada poço de uma placa de 6 poços usando uma pipeta sorológica.
2. Inocular os respectivos alvéolos com 120 μL (ou seja, 2%) do inóculo secundário utilizando uma micropipeta. Mantenha um poço não inoculado como controle de meio.
3. Misture o meio e a cultura pipetando para cima e para baixo com uma micropipeta de 1 mL. Cubra a tampa e sele cuidadosamente a placa com filme de parafina.
4. Incubar a placa sem perturbação numa incubadora estática a 37 °C durante 7 dias.

6. Configurando biofilmes para observações específicas do estágio

NOTA: A configuração geral do biofilme é a mesma descrita na etapa 5. Para colher ou visualizar biofilme em diferentes momentos, sugere-se que o mesmo biofilme seja configurado em vários conjuntos em placas separadas.

1. Para observar biofilmes entre o dia 3 e o dia 6, prepare quatro placas com condições idênticas e use uma placa por dia para obter imagens.
   NOTA: A camada de biofilme começa a aparecer na interface ar-meio a partir do terceiro dia de configuração da placa.

7. Estimando o desenvolvimento do biofilme

1. Estimativa visual
   1. Visualize as placas usando um sistema de documentação de gel com iluminação de luz epi-branca (Figura 1).
      NOTA: A imagem fornece uma estimativa qualitativa e quantitativa bruta do biofilme formado. Qualquer câmera de boa qualidade pode ser usada como alternativa.
2. Estimativa do peso seco
   1. Realize a medição do peso seco para uma quantificação mais precisa.
   2. Para medir o peso seco, comece pesando um mata-borrão.
      NOTA: O papel de filtro também pode ser usado em vez de papel mata-borrão.
   3. Extraia o biofilme da placa de 6 poços e transfira-o para o papel usando uma espátula.
   4. Colete cuidadosamente a maior parte do biofilme da cultura, tomando cuidado para não transferir quantidades excessivas da mídia para o papel.
   5. Coloque o biofilme no papel mata-borrão.
   6. Coloque-o em uma incubadora a 50 °C por 0,5-1 h até que o biofilme seque completamente.
   7. Meça o peso combinado do papel e do biofilme.
      NOTA: Peso seco do biofilme = (Peso do biofilme + papel) - (Peso do papel)

8. Ensaio de tolerância a antibióticos em biofilmes

1. Estimar a CIM90 da rifampicina em cultura planctônica de M. smegmatis seguindo o protocolo descrito por Irith Wiegand et al. usando a mídia de Sauton¹¹. Adicionar o antibiótico quando as culturas atingirem uma DO₆₀₀ de 0,2.
2. Configure as placas para o crescimento do biofilme conforme descrito na etapa 5 do protocolo.
3. No quarto dia de incubação, adicionar rifampicina às culturas na concentração MIC90 (64 μg/mL) dos lados do poço usando uma micropipeta na capela laminar.
   NOTA: Faça isso com cuidado, sem perturbar muito o biofilme. Deixe um dos alvéolos com biofilme sem tratamento.
4. Gire lentamente as placas para misturar os antibióticos.
5. Cubra as laterais das placas com filme de parafina e mantenha-as na incubadora para maior crescimento.
6. Após 24 h, remover as placas da capela laminar e adicionar Tween-80 a uma concentração final de 0,2% em todos os poços contendo biofilme.
7. Cubra novamente as placas com filme de parafina e mantenha-as a 4 °C e 100 rpm por 12 h.
8. Retirar as placas em uma capela laminar e homogeneizar os constituintes com uma micropipeta de 1 mL.
9. Lavar os constituintes com meio de Sauton utilizando o protocolo descrito em Anand et ^al.12.
10. Finalmente, ressuspenda as células em 6 mL de meio de Sauton e dilua até as concentrações finais de ^10-4, ^10-5, ^10-6 e ^10-7.
11. Espalhe 100 μL de cada diluição em placas de ágar LB usando esferas de vidro autoclavadas.
12. Selar todas as placas com película de parafina e mantê-las numa incubadora a 37 °C.
13. Após 3 dias de incubação, conte as colônias em cada placa. Considere apenas as placas com uma contagem de colônias entre 30 e 300.
14. Calcule UFC/mL e a diminuição relativa de UFC/mL usando as fórmulas fornecidas¹³.
    NOTA: UFC/ml = (Nº de colónias × Factor de diluição) / (Volume em placas (em ml))
    Diminuição relativa de UFC/mL = ((UFC/mL em Não Tratado - UFC/mL em Tratados)) / ((UFC/mL em Não Tratados)) × 100

Resultados

As películas de biofilme tornam-se visíveis a olho nu a partir do terceiro dia. Embora o biofilme cresça no meio de Sauton sem glicose a 2%, foi observada uma melhora na reticulação quando adicionado. Obtivemos 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) de peso seco de biofilme de cada poço de uma placa de 24 poços com 1,5 mL de meio de Sauton (suplementado com 2% de glicose) cultivado por quatro dias. Na Figura 2, o desenvolvimento do biofilme foi visível do dia 3...

Discussão

O estilo de vida multicelular dos micróbios foi descrito há quase um século; no entanto, os estudos clínicos permanecem escassos, principalmente devido à falta de métodos robustos¹⁴. Os métodos descritos em trabalhos sobre biologia de biofilme são muitas vezes difíceis de adaptar. Aqui, espera-se que a metodologia detalhada, auxiliada por demonstrações de etapas críticas, melhore a reprodutibilidade dos protocolos.

O método...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251