抗菌薬耐性研究のモデルとしてのマイコバクテリアバイオフィルムの増殖

要約

このプロトコルは、ペリクルバイオフィルムを開発するための堅牢な方法を説明しています。この分析法は、さまざまな培養量に拡張可能であり、さまざまな実験目的に容易に採用できます。この分析法の設計により、いくつかのマイコバクテリア種のバイオフィルム形成能を定性的または定量的に評価することができます。

要約

多くの細菌は、複雑な自然群集で繁殖し、コミュニケーション、協力、競争など、多細胞性の主要な属性を示しています。細菌の多細胞性挙動の最も一般的な症状は、バイオフィルムの形成であり、多くの場合、病原性に関連しています。バイオフィルムは、抗菌剤に対する避難所を提供し、抗菌薬耐性の出現を促進します。振とうフラスコの液体培養物で細菌を培養する従来の慣行は、自然界での細菌の適切な生理学的成長を表現できず、その結果、その複雑なダイナミクスの理解が制限されます。特に、バイオフィルムに存在する細菌の代謝プロファイルと転写プロファイルは、自然に成長する細胞のプロファイルと非常によく似ています。この並列性は、基礎研究とトランスレーショナル研究の理想的なモデルとしてのバイオフィルムの重要性を強調しています。この記事では、 Mycobacterium smegmatis をモデル生物として利用し、ペリクルバイオフィルムを培養する技術を説明することに焦点を当てています。このアプローチは、さまざまな培養量に適応可能であり、抗菌研究などの多様な実験目的への実装を容易にします。さらに、このメソッドの設計により、わずかな調整でさまざまなマイコバクテリア種のバイオフィルム形成能力を定性的または定量的に評価できます。

概要

バクテリアは単細胞の実体として生き残ることができます。しかし、ほとんどの生理学的に関連する条件では、彼らはコミュニティの模倣物に組織化されます。バイオフィルムは、自己生成マトリックス¹に包まれた凝集細胞によって形成される細菌のコミュニティ組織として広く認識されています。このようなアセンブリは、初期の多細胞性の特徴を持ち、細菌系により高いストレス耐性を提供します。バイオフィルムは抗菌薬に耐性があることが多く、微生物感染の約80%に関与していると推定され^{ています2,3}。

シェイクフラスコとプレートベースの培養は、伝統的に細菌培養の通常の方法でした。その大きな受容性と成功は、取り扱いの容易さ、再現性、およびスケーラビリティに起因する可能性があります。しかし、生理学的文脈の欠如は、そのようなシステムを使用して生成された知識の翻訳の可能性を制限します⁴。したがって、バイオフィルムは細菌の病態生理学を研究するための魅力的なモデルシステムになりつつあります。バイオフィルムは、自然条件を密接に反映した動的モデルシステムを提供し、研究者が栄養勾配や空間的不均一性などの生理学的側面を再現することを可能にします

プロトコル

本試験に使用されたすべての試薬および機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. Sautonの培地調製

1. 1.25 gのリン酸二水素カリウムを慎重に秤量し、50 mLの脱イオン水に溶解して、50 mLの2.5%リン酸二水素カリウム溶液を調製します。
2. 2.56 gの硫酸マグネシウムを秤量し、50 mLの脱イオン水に溶解して、2.5%硫酸マグネシウム溶液50 mLを調製します。.
3. 0.5 gのクエン酸第二鉄アンモニウムを秤量し、10 mLの脱イオン水に溶解して、10 mLの5%クエン酸第二鉄アンモニウム溶液を調製します。琥珀色のチューブに保管してください。
4. 20gのブドウ糖を秤量し、100mLの脱イオン水に溶解して、20%ブドウ糖溶液100mLを調製します。チューブ内の50 mL滅菌シリンジと0.2 μM PVDFシリンジフィルターを使用してフィルター滅菌します。
5. 0.1 gの硫酸亜鉛を慎重に秤量し、10 mLの脱イオン水に溶解して、滅菌1%硫酸亜鉛溶液10 mLを調製します。10 mLの滅菌シリンジと0.2 μM PVDFシリンジフィルターを層流フードで使用してフィルター滅菌します。
6. 調製した成分を750 mLの脱イオン水....

結果

バイオフィルムペリクルは、3日目以降に肉眼で見えるようになります。バイオフィルムは2%グルコースなしでSautonの培地で成長しますが、添加すると網状化の改善が観察されました。我々は、1.5mLのSauton培地(2%グルコースを添加)を4日間培養した24ウェルプレートの各ウェルから、10.48mg±3.13mg(n = 4)のバイオフィルム乾燥重量を得た。 図2では、バ.......

ディスカッション

微生物の多細胞生活様式は、ほぼ1世紀前に報告されました。しかし、臨床研究は依然としてまばらであり、その主な原因は堅牢な方法の欠如です¹⁴。バイオフィルム生物学の研究で説明されている方法は、多くの場合、適応が困難です。ここでは、重要なステップのデモンストレーションに支えられた詳細な方法論により、プロトコルの再現性が向.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251