Antimikrobiyal Direnci İncelemek İçin Bir Model Olarak Mikobakteriyel Biyofilm Yetiştirme

Özet

Bu protokol, pelikül biyofilmi geliştirmek için sağlam bir yöntemi tanımlar. Yöntem, farklı kültür hacimlerine ölçeklenebilir ve çeşitli deneysel hedefler için kolay benimseme sağlar. Yöntemin tasarımı, çeşitli mikobakteri türlerinin biyofilm oluşturma potansiyelinin kalitatif veya kantitatif olarak değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Birçok bakteri, karmaşık doğal topluluklarda gelişir ve iletişim, işbirliği ve rekabet gibi çok hücreliliğin temel özelliklerini sergiler. Bakteriyel çok hücreli davranışın en yaygın tezahürü, genellikle patojenite ile bağlantılı olan biyofilmlerin oluşumudur. Biyofilmler, antimikrobiyal ajanlara karşı bir sığınak sunarak antimikrobiyal direncin ortaya çıkmasını teşvik eder. Çalkalama şişesi sıvı kültürlerinde bakteri yetiştirmenin geleneksel uygulaması, doğadaki uygun fizyolojik büyümelerini temsil etmekte başarısız olur ve sonuç olarak karmaşık dinamiklerini anlamamızı sınırlar. Özellikle, biyofilmlerde bulunan bakterilerin metabolik ve transkripsiyonel profilleri, doğal olarak büyüyen hücrelerinkine çok benzer. Bu paralellik, biyofilmlerin temel ve translasyonel araştırmalar için ideal bir model olarak önemini vurgulamaktadır. Bu makale, pelikül biyofilmlerinin yetiştirilmesi için bir tekniği göstermek için Mycobacterium smegmatis'in bir model organizma olarak kullanılmasına odaklanmaktadır. Yaklaşım, çeşitli kültür hacimlerine uyarlanabilir ve antimikrobiyal çalışmalar gibi çeşitli deneysel hedefler için uygulanmasını kolaylaştırır. Ayrıca, yöntemin tasarımı, farklı mikobakteri türlerinin biyofilm oluşturma yeteneklerinin küçük ayarlamalarla kalitatif veya kantitatif olarak değerlendirilmesini sağlar.

Giriş

Bakteriler tek hücreli varlıklar olarak hayatta kalabilirler; Bununla birlikte, fizyolojik olarak ilgili koşulların çoğunda, topluluk taklitçilerine dönüşürler. Biyofilm, kendi kendine üretilen bir matris¹ içinde kaplanmış kümelenmiş hücreler tarafından oluşturulan, yaygın olarak tanınan bir bakteri topluluğu organizasyonudur. Bu tür bir montaj, erken çok hücrelilik imzalarına sahiptir ve bakteri sistemlerine daha yüksek stres direnci sağlar. Biyofilmler genellikle antimikrobiyallere toleranslıdır ve mikrobiyal enfeksiyonların neredeyse %80'inden sorumlu olduğu tahmin edilmektedir ^2,3.

Çalkalama şişesi ve plaka bazlı kültürler geleneksel olarak bakteri kültürü için olağan uygulamalar olmuştur. Muazzam kabul edilebilirlikleri ve başarıları, kullanım kolaylığına, tekrarlanabilirliğine ve ölçeklenebilirliğine bağlanabilir. Bununla birlikte, fizyolojik bağlam eksikliği, bu tür sistemler kullanılarak üretilen bilginin çeviri potansiyelini sınırlar⁴. Bu nedenle, biyofilmler bakteri patofizyolojisini incelemek için çekici bir model sistem haline gelmektedir. Biyofilmler, doğal koşulları yakından yansıtan dinamik bir model sistemi sağlar ve araştırmacıların besin gradyanları ve mekansal heterojenlik gibi fizyolojik yönleri çoğaltmasına olanak tanır ^5,6.

Biyofilm yaşam tarzı, kötü şöhretli Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere mikobakteriler usta biyofilm oluşturucular olduğundan, mikobakteriyel çalışmalarda özellikle önemlidir⁷. Biyofilmler içinde gelişme yetenekleri, enfeksiyonlar sırasında konakçı dokularda kalıcılıklarına katkıda bulunur. Biyofilm yaşam tarzlarıyla ilişkili doğal antibiyotik direnci göz önüne alındığında, mikobakteriyel hastalıkların tedavisinde zorlu bir zorluk teşkil etmektedir⁸. Biyofilmler ayrıca, karmaşık mikrobiyal topluluklar içinde mikobakteriler tarafından kullanılan benzersiz metabolik adaptasyonların ve besin kullanım stratejilerinin araştırılmasına izin verdikleri için mikobakteriyel metabolizmayı incelemek için ideal bir model sistem sağlarlar⁹.

Biyofilm, mikobakteriyel çalışmalar^için daha iyi bir model sistem olarak giderek daha fazla kabul edilirken10, özellikle farklı laboratuvarlarda yürütülen çalışmalar arasında paralellikler çizmek için tutarlı ve tekrarlanabilir standart işletim prosedürlerine ihtiyaç vardır. Burada özetlenen yöntem, bir mikobakteriyel tür olan M. smegmatis için biyofilm oluşturma prosedürlerini açıklar. M. smegmatis , patojenite olmaması ve daha hızlı biyofilm oluşum kinetiği göz önüne alındığında, mikobakteriyel biyofilmleri incelemek için daha erişilebilir bir modeldir. Yöntem, antimikobakteriyel tarama, metabolit ekstraksiyonu ve omik çalışmaları gibi uygulamalara uyacak şekilde değiştirilebilir.

Protokol

Çalışma için kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Sauton'un medya hazırlığı

1. 1.25 g potasyum dihidrojen fosfatı dikkatlice tartarak ve 50 mL deiyonize su içinde çözerek 50 mL %2.5 potasyum dihidrojen fosfat çözeltisi hazırlayın.
2. 2.56 g magnezyum sülfatı tartarak ve 50 mL deiyonize suda çözerek 50 mL% 2.5 magnezyum sülfat çözeltisi hazırlayın.
3. 0.5 g ferrik amonyum sitrat tartarak ve 10 mL deiyonize su içinde çözerek 10 mL% 5 ferrik amonyum sitrat çözeltisi hazırlayın. Amber bir tüpte saklayın.
4. 20 g glikozu tartarak ve 100 mL deiyonize suda çözerek 100 mL% 20 glikoz çözeltisi hazırlayın. Bir tüpte 50 mL steril şırınga ve 0,2 μM PVDF şırınga filtresi kullanarak filtre sterilize edin.
5. 0.1 g çinko sülfatı dikkatlice tartarak ve 10 mL deiyonize su içinde çözerek 10 mL steril% 1 çinko sülfat çözeltisi hazırlayın. Laminer başlıkta 10 mL steril şırınga ve 0,2 μM PVDF şırınga filtresi kullanarak filtre ile sterilize edin.
6. Hazırlanan bileşenleri Tablo 1'de anlatıldığı gibi 750 mL deiyonize su ile karıştırın. Çözeltinin pH'ını ölçün ve 7'ye ayarlayın. Deiyonize su ile hacmi 900 mL'ye kadar tamamlayın.
7. Ortamı 15 PSI ve 121 °C'de 15-20 dakika otoklavlayın. Soğumaya bırakın. Ardından, 100 μL filtreyle sterilize edilmiş %1 çinko sülfat ekleyin. 100 mL filtreyle sterilize edilmiş% 20 glikoz ekleyin ve iyice çözün.

2. Filtre ile sterilize edilmiş% 5 Tween-80'in hazırlanması

1. 0.5 mL Tween-80'i 9.5 mL deiyonize suda çözün.
2. Laminer başlıkta 10 mL steril şırınga ve 0.2 μM PVDF şırınga filtresi kullanarak çözeltiyi filtreyle sterilize edin.

3. Birincil kültürün hazırlanması

1. Laminer başlıkta, 2 mL otoklavlanmış LB ortamını iki steril 14 mL test tüpüne dağıtmak için serolojik bir pipet kullanın.
2. Bir mikropipet kullanarak test tüplerine 20 μL filtreyle sterilize edilmiş %5 Tween-80 ekleyin.
3. M. smegmatis'i bir aşılama döngüsü kullanarak kriyo-stoğunu ekleyerek tüplerden birine aşılayın. Diğer test tüpü bir medya kontrolü görevi görür.
4. Tüpleri 300 rpm ve 37 °C'de bir çalkalayıcı inkübatörde 48 saat inkübe edin.
   NOT: Medya kontrol tüpü herhangi bir büyüme göstermemelidir.

4. İkincil kültürün hazırlanması

1. Laminer başlıkta, 2 mL otoklavlanmış LB ortamını iki steril 14 mL test tüpüne dağıtmak için serolojik bir pipet kullanın.
2. Bir mikropipet kullanarak test tüplerine 20 μL filtreyle sterilize edilmiş %5 Tween-80 ekleyin.
3. Bir mikropipet kullanarak tüplerden birine 20 μL birincil kültür ekleyin. Diğer tüpü medya kontrolü olarak tutun.
4. Kültürleri bir çalkalayıcı inkübatörde 300 rpm ve 37 ° C'de, 0.6 ila 0.8 arasında bir OD_600'e ulaşana kadar inkübe edin.
   NOT: 0,6 ila 0,8 arasında bir OD_600'e ulaşmak genellikle 12 ila 14 saat sürer. Diğer hücre yoğunlukları da kullanılabilir, ancak tanımlanmış bir OD₆₀₀ değeri karşılaştırmalı çalışmalara yardımcı olur.

5. Biyofilmin kurulması

1. Laminer başlıkta, serolojik bir pipet kullanarak 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna% 2 glikoz takviye edilmiş 6 mL Soton'un ortamını dağıtın.
2. İlgili kuyucukları 120 μL (yani %2) ile bir mikropipet kullanarak ikincil aşılayın . Bir medya kontrolü olarak aşılanmamış bir tane bulundurun.
3. 1 mL'lik bir mikropipet ile yukarı ve aşağı pipetleyerek ortamı ve kültürü karıştırın. Kapağı kapatın ve plakayı parafin film ile dikkatlice kapatın.
4. Plakayı 7 gün boyunca statik bir inkübatörde 37 ° C'de rahatsız edilmeden inkübe edin.

6. Aşamaya özgü gözlemler için biyofilmlerin kurulması

NOT: Genel biyofilm kurulumu, adım 5'te açıklananla aynıdır. Biyofilmi zaman içinde farklı noktalarda hasat etmek veya görüntülemek için, aynı biyofilmin ayrı plakalar üzerinde birden fazla set halinde kurulması önerilir.

1. 3. gün ile 6. gün arasındaki biyofilmleri gözlemlemek için, aynı koşullara sahip dört plaka hazırlayın ve görüntüleme için günde bir plaka kullanın.
   NOT: Biyofilm tabakası, plaka kurulumunun üçüncü gününden itibaren hava-ortam arayüzünde görünmeye başlar.

7. Biyofilm gelişiminin tahmin edilmesi

1. Görsel tahmin
   1. Epi-beyaz ışık aydınlatmalı bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak plakaları görüntüleyin (Şekil 1).
      NOT: Görüntüleme, oluşan biyofilmin brüt kalitatif ve kantitatif bir tahminini verir. Alternatif olarak herhangi bir kaliteli kamera kullanılabilir.
2. Kuru ağırlık tahmini
   1. Daha hassas miktar tayini için kuru ağırlık ölçümü yapın.
   2. Kuru ağırlığı ölçmek için, bir kurutma kağıdı tartarak başlayın.
      NOT: Kurutma kağıdı yerine filtre kağıdı da kullanılabilir.
   3. Biyofilmi 6 oyuklu plakadan çıkarın ve bir spatula kullanarak kağıda aktarın.
   4. Kültürdeki biyofilmin çoğunu dikkatlice toplayın ve aşırı miktarda medyayı kağıda aktarmamaya dikkat edin.
   5. Biyofilmi kurutma kağıdına yerleştirin.
   6. Biyofilm tamamen kuruyana kadar 50 ° C'de 0,5-1 saat inkübatöre koyun.
   7. Kağıt ve biyofilmin toplam ağırlığını ölçün.
      NOT: Biyofilmin Kuru Ağırlığı = (Biyofilm + kağıdın ağırlığı) - (Kağıdın ağırlığı)

8. Biyofilmlerde antibiyotik tolerans deneyi

1. Irith Wiegand ve ark. tarafından Sauton'un ortamını^{kullanarak 11}. Kültürler 0.2 OD_600'e ulaştığında antibiyotiği ekleyin.
2. Protokolün 5. adımında açıklandığı gibi biyofilm büyümesi için plakaları ayarlayın.
3. İnkübasyonun dördüncü gününde, laminer başlıkta bir mikropipet kullanarak kuyu kenarlarından MIC90 konsantrasyonunda (64 μg / mL) kültürlere rifampisin ekleyin.
   NOT: Biyofilmi çok fazla rahatsız etmeden bunu dikkatli bir şekilde yapın. Biyofilm içeren kuyucuklardan birini tedavi edilmeden bırakın.
4. Antibiyotikleri karıştırmak için plakaları yavaşça döndürün.
5. Plakaların kenarlarını parafin film ile kaplayın ve daha fazla büyüme için inkübatörde tutun.
6. 24 saat sonra, plakaları laminer başlıktan çıkarın ve biyofilm içeren tüm oyuklarda% 0.2'lik bir nihai konsantrasyona kadar Tween-80 ekleyin.
7. Plakaları bir kez daha parafin film ile örtün ve 12 saat boyunca 4 °C ve 100 rpm'de tutun.
8. Plakaları laminer bir başlıkta çıkarın ve bileşenleri 1 mL'lik bir mikropipet ile homojenize edin.
9. Anand ve ^ark.12'de açıklanan protokolü kullanarak bileşenleri Sauton'un ortamıyla yıkayın.
10. Son olarak, hücreleri 6 mL Sotron'un ortamında yeniden süspanse edin ve ^{10-4, 10-5}, ^10-6 ve ^10-7'lik nihai konsantrasyonlara seyreltin.
11. Otoklavlanmış cam boncuklar kullanarak LB-agar plakalarına her seyreltmeden 100 μL yayın.
12. Tüm plakaları parafin film kullanarak kapatın ve 37 °C'de bir inkübatörde tutun.
13. 3 günlük kuluçka döneminden sonra, her plakadaki kolonileri sayın. Sadece koloni sayısı 30 ile 300 arasında olan plakaları düşünün.
14. Sağlanan formülleri kullanarak CFU/mL'yi ve CFU/mL'deki nispi düşüşü hesaplayın¹³.
    NOT: CFU/mL = (Koloni sayısı × Seyreltme faktörü) / (Kaplama hacmi (mL cinsinden))
    CFU / mL'de nispi azalma = ((Tedavi Edilmeyen CFU / mL - Tedavi Edilen CFU / mL)) / ((Tedavi Edilmeyen CFU / mL)) × 100

Sonuçlar

Biyofilm pelikülleri üçüncü günden itibaren çıplak gözle görülebilir hale gelir. Biyofilm, Soton'un ortamında% 2 glikoz olmadan büyümesine rağmen, eklendiğinde retikülasyonda bir iyileşme gözlendi. Dört gün boyunca büyütülen 1.5 mL Soton'un ortamı (% 2 glikoz ile desteklenmiş) ile 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğundan 10.48 mg ± 3.13 mg (n = 4) biyofilm kuru ağırlığı elde ettik. Şekil 2'de, biyofilm gelişimi 3. günden ...

Tartışmalar

Mikropların çok hücreli yaşam tarzı neredeyse bir asır önce tanımlandı; Bununla birlikte, çoğunlukla sağlam yöntemlerin olmaması nedeniyle klinik çalışmalar seyrek kalmaktadır¹⁴. Biyofilm biyolojisi ile ilgili çalışmalarda açıklanan yöntemlerin uyarlanması genellikle zordur. Burada, kritik adımların gösterilmesiyle desteklenen ayrıntılı metodolojinin, protokollerin tekrarlanabilirliğini iyileştirmesi beklenmektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251