항생제 내성을 연구하기 위한 모델로 Mycobacterial Biofilm 성장

요약

이 프로토콜은 펠리클 바이오필름을 개발하기 위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 다양한 배양 용량으로 확장 가능하여 다양한 실험 목표에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 방법의 설계는 여러 마이코박테리아 종의 생물막 형성 가능성에 대한 정성적 또는 정량적 평가를 가능하게 합니다.

초록

많은 박테리아는 복잡한 자연 군집에서 번성하며 의사 소통, 협력 및 경쟁과 같은 다세포성의 주요 속성을 나타냅니다. 박테리아 다세포 행동의 가장 흔한 징후는 종종 병원성과 관련된 생물막의 형성입니다. 생물막은 항균제에 대한 피난처를 제공하여 항균 내성의 출현을 촉진합니다. 쉐이크 플라스크 액체 배양에서 박테리아를 배양하는 기존의 관행은 자연에서 박테리아의 적절한 생리적 성장을 나타내지 못하며, 결과적으로 박테리아의 복잡한 역학에 대한 이해를 제한합니다. 특히, biofilms에서 거주하는 박테리아의 변화와 transcriptional 단면도는 바싹 자연적으로 성장하는 세포의 그들과 유사합니다. 이러한 평행법은 기초 및 중개 연구를 위한 이상적인 모델로서 생물막의 중요성을 강조합니다. 이 기사에서는 Mycobacterium smegmatis 를 모델 유기체로 활용하여 펠리클 생물막을 배양하는 기술을 설명하는 데 중점을 둡니다. 이 접근법은 다양한 배양량에 적용할 수 있어 항균 연구와 같은 다양한 실험 목표에 대한 구현을 용이하게 합니다. 또한, 이 방법의 설계는 약간의 조정으로 다양한 마이코박테리아 종의 생물막 형성 능력에 대한 정성적 또는 정량적 평가를 가능하게 합니다.

서문

박테리아는 단세포 개체로 생존할 수 있습니다. 그러나 대부분의 생리학적으로 관련된 조건에서 그들은 군집 모방으로 조직됩니다. 생물막(Biofilm)은 자가 생산 매트릭스(^{self-produced} matrix) 1에 둘러싸인 응집된 세포에 의해 형성된 박테리아의 널리 알려진 군집 조직이다. 이러한 조립은 초기 다세포성의 시그니처를 가지고 있으며 박테리아 시스템에 더 높은 응력 탄력성을 제공합니다. 생물막은 종종 항균제에 관대하며 미생물 감염의 거의 80%를 담당하는 것으로 추정됩니다 ^2,3.

쉐이크 플라스크 및 플레이트 기반 배양은 전통적으로 박테리아 배양을 위한 일반적인 관행이었습니다. 그들의 엄청난 수용성과 성공은 취급 용이성, 재현성 및 확장성에 기인할 수 있습니다. 그러나 생리학적 맥락의 결핍은 이러한 시스템을 사용하여 생성된 지식의 번역 잠재력을 제한한다⁴. 따라서 생물막은 세균 병태생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델 시스템이 되고 있습니다. 생물막은 자연 조건을 밀접하게 반영하는 동적 모델 시스템을 제공하여 연구원이 영양 구배 및 공간 이질성과 같은 생리학적 측면을 복제할 수 있도록 합니다 ^5,6.

악명 높은 Mycobacterium tuberculosis를 포함한 마이코박테리아는 생물막 형성에 능숙하기 때문에 생물막 생활방식은 마이코박테리아 연구에서 특히 적절하다⁷. biofilms 안에서 번성하는 그들의 능력은 감염 도중 주인 조직에 있는 그들의 지속성에 공헌합니다. 이는 마이코세균성 질병을 치료하는 데 있어 만만치 않은 도전이며, 이는 생물막 생활양식과 관련된 고유한 항생제 내성을 감안할 때⁸. 생물막은 또한 복잡한 미생물 군집 내에서 마이코박테리아가 사용하는 고유한 대사 적응 및 영양소 활용 전략을 조사할 수 있기 때문에 마이코박테리아 대사를 연구하기 위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다⁹.

생물막이 마이코박테리아 연구를 위한 더 나은 모델 시스템으로 점점 더 많이 받아들여지고 있지만¹⁰, 특히 서로 다른 실험실에서 수행된 연구 간에 평행선을 그리기 위해 일관되고 재현 가능한 표준 운영 절차가 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 마이코박테리아 종인 M. smegmatis에 대한 생물막 형성 절차를 설명합니다. M. smegmatis 는 비병원성 및 더 빠른 생물막 형성 역학을 감안할 때 마이코박테리아 생물막을 연구하기 위한 보다 접근하기 쉬운 모델입니다. 이 방법은 항마이코박테리아 스크리닝, 대사산물 추출 및 오믹스 연구와 같은 응용 분야에 맞게 수정할 수 있습니다.

프로토콜

연구에 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. Sauton의 미디어 준비

1. 50g의 인산이수소칼륨 1.25g을 조심스럽게 무게를 측정하고 50mL의 탈이온수에 용해시켜 2.5% 인산이수소칼륨 용액 50mL를 준비합니다.
2. 황산마그네슘 2.56g의 무게를 칭량하고 50mL의 탈이온수에 용해시켜 2.5% 황산마그네슘 용액 50mL를 준비합니다.
3. 10g의 구연산철 암모늄 0.5g의 무게를 측정하고 10mL의 탈이온수에 용해시켜 5% 구연산철 암모늄 용액을 준비합니다. 호박색 튜브에 보관하십시오.
4. 포도당 20g의 무게를 측정하고 100mL의 탈이온수에 용해시켜 20% 포도당 용액 100mL를 준비합니다. 튜브에 50mL 멸균 주사기와 0.2μM PVDF 주사기 필터를 사용하여 필터 멸균합니다.
5. 황산아연 0.1g을 조심스럽게 칭량하고 탈이온수 10mL에 용해시켜 멸균 1% 황산아연 용액 10mL를 준비합니다. 라미나 후드에서 10mL 멸균 주사기와 0.2μM PVDF 주사기 필터를 사용하여 필터 멸균합니다.
6. 표 1에 설명된 대로 준비된 성분을 750mL의 탈이온수에 혼합합니다. 용액의 pH를 측정하고 7로 조정합니다. 탈이온수로 부피를 900mL로 구성합니다.
7. 15PSI 및 121°C에서 15-20분 동안 매체를 고압멸균합니다. 식히십시오. 그런 다음 필터 멸균된 1% 황산아연 100μL를 추가합니다. 필터 멸균된 20% 포도당 100mL를 넣고 잘 녹입니다.

2. 필터 멸균 된 5 % Tween-80의 제조

1. 0.5mL의 Tween-80을 탈이온수 9.5mL에 녹입니다.
2. 라미나 후드에서 10mL 멸균 주사기와 0.2μM PVDF 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터 멸균합니다.

3. 초등회 문화 준비

1. 층류 후드에서 혈청학적 피펫을 사용하여 2mL의 오토클레이브 LB 배지를 두 개의 멸균 14mL 시험관에 분주합니다.
2. 마이크로피펫을 사용하여 20μL의 필터 멸균된 5% Tween-80을 시험관에 추가합니다.
3. 접종 루프를 사용하여 극저온 재고를 추가하여 M. smegmatis 를 튜브 중 하나에 접종합니다. 다른 시험관은 미디어 제어 역할을 합니다.
4. 300 rpm 및 37 °C의 shaker 인큐베이터에서 48시간 동안 튜브를 배양합니다.
   알림: 미디어 제어 튜브에 성장이 나타나지 않아야 합니다.

4. 제2문화 준비

1. 층류 후드에서 혈청학적 피펫을 사용하여 2mL의 오토클레이브 LB 배지를 두 개의 멸균 14mL 시험관에 분주합니다.
2. 마이크로피펫을 사용하여 20μL의 필터 멸균된 5% Tween-80을 시험관에 추가합니다.
3. 마이크로피펫을 사용하여 1차 배양액 20μL를 튜브 중 하나에 추가합니다. 다른 튜브는 미디어 컨트롤로 보관하십시오.
4. 300 rpm 및 37 °C의 셰이커 인큐베이터에서 OD₆₀₀ 이 0.6 - 0.8이 될 때까지 배양액을 배양합니다.
   참고: 일반적으로 0.6에서 0.8의 OD₆₀₀ 에 도달하는 데 일반적으로 12-14시간이 걸립니다. 다른 세포 밀도도 사용할 수 있지만 정의된 OD₆₀₀ 값은 비교 연구에 도움이 됩니다.

5. 생물막 설정

1. 층류 후드에서 혈청학적 피펫을 사용하여 2% 포도당이 보충된 Sauton의 배지 6mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다.
2. 마이크로피펫을 사용하여 각 웰에 120μL(즉, 2%)의 2차 접종물을 접종합니다. 백신 접종을 완료하지 않은 것을 미디어 컨트롤로 잘 보관하십시오.
3. 1mL 마이크로피펫으로 위아래로 피펫팅하여 배지와 배양물을 혼합합니다. 뚜껑을 덮고 파라핀 필름으로 접시를 조심스럽게 밀봉합니다.
4. 37°C의 정적 인큐베이터에서 7일 동안 방해받지 않고 플레이트를 배양합니다.

6. 단계별 관찰을 위한 생물막 설정

참고: 전체 생물막 설정은 5단계에서 설명한 것과 동일합니다. 다른 시점에서 생물막을 수확하거나 이미지화하려면 동일한 생물막을 별도의 플레이트에 여러 세트로 설정하는 것이 좋습니다.

1. 3일째와 6일 사이에 생물막을 관찰하려면 동일한 조건으로 4개의 플레이트를 준비하고 이미징을 위해 하루에 하나의 플레이트를 사용합니다.
   참고: 생물막 층은 플레이트 설정 3일째부터 공기-매체 계면에 나타나기 시작합니다.

7. 생물막 발달 추정

1. 시각적 추정치
   1. epi-white light illumination이 있는 gel documentation system을 사용하여 플레이트를 이미지화합니다(그림 1).
      참고: 이미징은 형성된 생물막의 총 정성적 및 정량적 추정치를 제공합니다. 좋은 품질의 카메라를 대안으로 사용할 수 있습니다.
2. 건조 중량 추정치
   1. 보다 정확한 정량화를 위해 건조 중량 측정을 수행합니다.
   2. 건조 중량을 측정하려면 먼저 압지의 무게를 측정하십시오.
      알림: 압지 대신 여과지를 사용할 수도 있습니다.
   3. 6웰 플레이트에서 생물막을 추출하고 주걱을 사용하여 종이에 옮깁니다.
   4. 배양물에서 대부분의 생물막을 조심스럽게 수집하고 과도한 양의 매체를 종이에 옮기지 않도록 주의합니다.
   5. 압지에 생물막을 놓습니다.
   6. 생물막이 완전히 건조될 때까지 50°C의 인큐베이터에 0.5-1시간 동안 넣습니다.
   7. 종이와 생물막의 결합된 무게를 측정합니다.
      참고 : 생물막의 건조 중량 = (생물막 + 종이의 무게)-(종이의 무게)

8. 생물막의 항생제 내성 분석

1. Sauton의 매체¹¹을 사용하여 Irith Wiegand et al.이 설명한 프로토콜에 따라 M. smegmatis 플랑크톤 배양에서 리팜피신의 MIC90을 추정합니다. 배양액이 OD₆₀₀ 0.2에 도달하면 항생제를 추가합니다.
2. 프로토콜의 5단계에 설명된 대로 생물막 성장을 위한 플레이트를 설정합니다.
3. 배양 4일째 되는 날에 층류 후드의 마이크로피펫을 사용하여 웰 측면에서 MIC90 농도(64μg/mL)로 배양액에 리팜피신을 추가합니다.
   알림: 생물막을 너무 많이 방해하지 않도록 주의해서 이 작업을 수행하십시오. 생물막이 있는 우물 중 하나를 처리하지 않고 그대로 두십시오.
4. 항생제를 섞기 위해 플레이트를 천천히 휘젓습니다.
5. 플레이트의 측면을 파라핀 필름으로 덮고 추가 성장을 위해 인큐베이터에 보관합니다.
6. 24시간 후, 층류 후드에서 플레이트를 제거하고 생물막이 포함된 모든 웰에서 최종 농도 0.2%까지 Tween-80을 추가합니다.
7. 다시 한 번, 플레이트를 파라핀 필름으로 덮고 4시간 동안 100°C 및 12rpm으로 유지합니다.
8. 플레이트를 층류 후드에서 꺼내고 1mL 마이크로피펫으로 성분을 균질화합니다.
9. Anand et ^al.12에 설명된 프로토콜을 사용하여 Sauton의 매체로 성분을 세척합니다.
10. 마지막으로 6mL Sauton의 배지에 세포를 재현탁시키고 ^10-4, ^10-5, ^10-6 및 ^10-7의 최종 농도로 희석합니다.
11. 오토클레이브 유리 비드를 사용하여 LB-한천 플레이트에 각 희석액을 100μL씩 펴 바릅니다.
12. 파라핀 필름을 사용하여 모든 플레이트를 밀봉하고 37°C의 인큐베이터에 보관합니다.
13. 배양 3일 후 각 플레이트의 콜로니를 세십시오. 콜로니 수가 30에서 300 사이인 판만 고려하십시오.
14. 제공된 공식을 사용하여 CFU/mL와 CFU/mL의 상대적 감소를 계산합니다¹³.
    참고: CFU/mL = (콜로니 수 × 희석 계수) / (도금 부피(mL))
    CFU/mL의 상대적 감소 = ((미처리의 CFU/mL - 처리의 CFU/mL)) / ((미처리의 CFU/mL)) × 100

결과

생물막 펠리클은 3일째부터 육안으로 볼 수 있습니다. 생물막은 2% 포도당 없이 Sauton의 매체에서 자라지만, 첨가되었을 때 망상에서 개선이 관찰되었습니다. 우리는 4일 동안 성장한 1.5mL의 Sauton's 배지(2% 포도당 보충)와 함께 24웰 플레이트의 각 웰에서 10.48mg ± 3.13mg(n = 4)의 생물막 건조 중량을 얻었습니다. 그림 2에서 생물막 발달은 3일째부터 6일째?...

토론

미생물의 다세포 생활 방식은 거의 100년 전에 설명되었습니다. 그러나 임상연구는 여전히 드물게 진행되고 있는데, 이는 대부분 강력한 방법의 부족으로 인한 것이다¹⁴. 생물막 생물학에 대한 연구에서 설명된 방법은 종종 적용하기 어렵습니다. 여기에서 중요한 단계의 시연을 통한 상세한 방법론이 프로토콜의 재현성을 향상시킬 것으로 예상됩니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251