Wachsender mykobakterieller Biofilm als Modell zur Untersuchung von Antibiotikaresistenzen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Entwicklung eines Pellikel-Biofilms. Die Methode ist auf verschiedene Kulturvolumina skalierbar und ermöglicht eine einfache Anwendung für verschiedene experimentelle Ziele. Das Methodendesign ermöglicht eine qualitative oder quantitative Bewertung des biofilmbildenden Potenzials mehrerer Mykobakterienarten.

Zusammenfassung

Viele Bakterien gedeihen in komplizierten natürlichen Gemeinschaften und weisen Schlüsselattribute der Vielzelligkeit wie Kommunikation, Kooperation und Wettbewerb auf. Die häufigste Manifestation des bakteriellen mehrzelligen Verhaltens ist die Bildung von Biofilmen, die oft mit Pathogenität verbunden sind. Biofilme bieten einen Zufluchtsort gegen antimikrobielle Wirkstoffe und begünstigen die Entstehung von Antibiotikaresistenzen. Die konventionelle Praxis der Kultivierung von Bakterien in Schüttelkolben-Flüssigkulturen repräsentiert nicht ihr richtiges physiologisches Wachstum in der Natur, was unser Verständnis ihrer komplizierten Dynamik einschränkt. Bemerkenswert ist, dass die metabolischen und transkriptionellen Profile von Bakterien, die sich in Biofilmen befinden, denen natürlich wachsender Zellen sehr ähnlich sind. Diese Parallelität unterstreicht die Bedeutung von Biofilmen als ideales Modell für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung von Mycobacterium smegmatis als Modellorganismus, um eine Technik zur Kultivierung von Pellikel-Biofilmen zu veranschaulichen. Der Ansatz ist an verschiedene Kulturvolumina anpassbar, was seine Implementierung für verschiedene experimentelle Ziele, wie z. B. antimikrobielle Studien, erleichtert. Darüber hinaus ermöglicht das Methodendesign die qualitative oder quantitative Bewertung der Biofilmbildungsfähigkeiten verschiedener Mykobakterienarten mit geringfügigen Anpassungen.

Einleitung

Bakterien sind in der Lage, als einzellige Einheiten zu überleben; Unter den meisten physiologisch relevanten Bedingungen organisieren sie sich jedoch in Gemeinschaftsmimetika. Biofilm ist eine weithin anerkannte Gemeinschaftsorganisation von Bakterien, die aus aggregierten Zellen bestehen, die in einer selbst produzierten Matrix eingeschlossen sind¹. Eine solche Assemblierung besitzt Signaturen einer frühen Vielzelligkeit und bietet eine höhere Stressresistenz für bakterielle Systeme. Biofilme sind oft tolerant gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen und sind schätzungsweise für fast 80 % der mikrobiellen Infek....

Protokoll

Die Einzelheiten zu allen für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Die Medienvorbereitung von Sauton

1. Bereiten Sie 50 ml 2,5%ige Kaliumdihydrogenphosphatlösung vor, indem Sie 1,25 g Kaliumdihydrogenphosphat sorgfältig abwiegen und in 50 ml deionisiertem Wasser auflösen.
2. Bereiten Sie 50 ml 2,5%ige Magnesiumsulfatlösung vor, indem Sie 2,56 g Magnesiumsulfat wiegen und in 50 ml entionisiertem Wasser auflösen.
3. Bereiten Sie 10 ml 5%ige Eisenammoniumcitratlösung vor, indem Sie 0,5 g Eisenammoniumcitr....

Diskussion

Die mehrzellige Lebensweise von Mikroben wurde vor fast einem Jahrhundert beschrieben; Klinische Studien sind jedoch nach wie vor spärlich, was vor allem auf den Mangel an robusten Methoden^{zurückzuführen ist 14}. Methoden, die in Arbeiten zur Biofilmbiologie beschrieben werden, sind oft schwer zu adaptieren. Hier wird erwartet, dass die detaillierte Methodik, unterstützt durch die Demonstration kritischer Schritte, die Reproduzierbarkeit der Protokolle verbesse.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251