Wachsender mykobakterieller Biofilm als Modell zur Untersuchung von Antibiotikaresistenzen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Entwicklung eines Pellikel-Biofilms. Die Methode ist auf verschiedene Kulturvolumina skalierbar und ermöglicht eine einfache Anwendung für verschiedene experimentelle Ziele. Das Methodendesign ermöglicht eine qualitative oder quantitative Bewertung des biofilmbildenden Potenzials mehrerer Mykobakterienarten.

Zusammenfassung

Viele Bakterien gedeihen in komplizierten natürlichen Gemeinschaften und weisen Schlüsselattribute der Vielzelligkeit wie Kommunikation, Kooperation und Wettbewerb auf. Die häufigste Manifestation des bakteriellen mehrzelligen Verhaltens ist die Bildung von Biofilmen, die oft mit Pathogenität verbunden sind. Biofilme bieten einen Zufluchtsort gegen antimikrobielle Wirkstoffe und begünstigen die Entstehung von Antibiotikaresistenzen. Die konventionelle Praxis der Kultivierung von Bakterien in Schüttelkolben-Flüssigkulturen repräsentiert nicht ihr richtiges physiologisches Wachstum in der Natur, was unser Verständnis ihrer komplizierten Dynamik einschränkt. Bemerkenswert ist, dass die metabolischen und transkriptionellen Profile von Bakterien, die sich in Biofilmen befinden, denen natürlich wachsender Zellen sehr ähnlich sind. Diese Parallelität unterstreicht die Bedeutung von Biofilmen als ideales Modell für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung von Mycobacterium smegmatis als Modellorganismus, um eine Technik zur Kultivierung von Pellikel-Biofilmen zu veranschaulichen. Der Ansatz ist an verschiedene Kulturvolumina anpassbar, was seine Implementierung für verschiedene experimentelle Ziele, wie z. B. antimikrobielle Studien, erleichtert. Darüber hinaus ermöglicht das Methodendesign die qualitative oder quantitative Bewertung der Biofilmbildungsfähigkeiten verschiedener Mykobakterienarten mit geringfügigen Anpassungen.

Einleitung

Bakterien sind in der Lage, als einzellige Einheiten zu überleben; Unter den meisten physiologisch relevanten Bedingungen organisieren sie sich jedoch in Gemeinschaftsmimetika. Biofilm ist eine weithin anerkannte Gemeinschaftsorganisation von Bakterien, die aus aggregierten Zellen bestehen, die in einer selbst produzierten Matrix eingeschlossen sind¹. Eine solche Assemblierung besitzt Signaturen einer frühen Vielzelligkeit und bietet eine höhere Stressresistenz für bakterielle Systeme. Biofilme sind oft tolerant gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen und sind schätzungsweise für fast 80 % der mikrobiellen Infektionen verantwortlich ^2,3.

Schüttelkolben und plattenbasierte Kulturen sind traditionell die üblichen Praktiken für die Bakterienkultivierung. Ihre enorme Akzeptanz und ihr Erfolg sind auf ihre einfache Handhabung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zurückzuführen. Das Fehlen eines physiologischen Kontexts schränkt jedoch das translationale Potenzial des mit solchen Systemen generierten Wissens ein⁴. Daher werden Biofilme zu einem attraktiven Modellsystem für die Erforschung der bakteriellen Pathophysiologie. Biofilme stellen ein dynamisches Modellsystem dar, das die natürlichen Bedingungen genau widerspiegelt und es den Forschern ermöglicht, physiologische Aspekte wie Nährstoffgradienten und räumliche Heterogenität zu replizieren ^5,6.

Der Biofilm-Lebensstil ist in mykobakteriellen Studien besonders relevant, da Mykobakterien, einschließlich des berüchtigten Mycobacterium tuberculosis, geschickte Biofilmbildner sind⁷. Ihre Fähigkeit, in Biofilmen zu gedeihen, trägt dazu bei, dass sie während einer Infektion im Wirtsgewebe bestehen bleiben. Angesichts der inhärenten Antibiotikaresistenz, die mit dem Lebensstil von Biofilmen verbunden ist, stellt es eine große Herausforderung bei der Behandlung von mykobakteriellen Erkrankungen^{dar 8}. Biofilme stellen auch ein ideales Modellsystem für die Untersuchung des mykobakteriellen Stoffwechsels dar, da sie die Untersuchung der einzigartigen metabolischen Anpassungen und Nährstoffverwertungsstrategien ermöglichen, die von Mykobakterien in komplexen mikrobiellen Gemeinschaften eingesetzt werden⁹.

Während Biofilm zunehmend als besseres Modellsystem für mykobakterielle Studien akzeptiert wird¹⁰, besteht ein Bedarf an konsistenten und reproduzierbaren Standardarbeitsanweisungen, insbesondere um Parallelen zwischen Studien zu ziehen, die in verschiedenen Laboratorien durchgeführt wurden. Die hier beschriebene Methode beschreibt die Verfahren zur Biofilmbildung für eine Mykobakterienart, M. smegmatis. M. smegmatis ist ein leichter zugängliches Modell für die Untersuchung mykobakterieller Biofilme, da es nicht pathogen ist und die Kinetik der Biofilmbildung schneller ist. Die Methode kann modifiziert werden, um Anwendungen wie Antimykobakterien-Screening, Metabolitenextraktion und Omics-Studien zu ermöglichen.

Protokoll

Die Einzelheiten zu allen für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Die Medienvorbereitung von Sauton

1. Bereiten Sie 50 ml 2,5%ige Kaliumdihydrogenphosphatlösung vor, indem Sie 1,25 g Kaliumdihydrogenphosphat sorgfältig abwiegen und in 50 ml deionisiertem Wasser auflösen.
2. Bereiten Sie 50 ml 2,5%ige Magnesiumsulfatlösung vor, indem Sie 2,56 g Magnesiumsulfat wiegen und in 50 ml entionisiertem Wasser auflösen.
3. Bereiten Sie 10 ml 5%ige Eisenammoniumcitratlösung vor, indem Sie 0,5 g Eisenammoniumcitrat wiegen und in 10 ml deionisiertem Wasser auflösen. Bewahren Sie es in einer bernsteinfarbenen Tube auf.
4. Bereiten Sie 100 ml 20%ige Glukoselösung vor, indem Sie 20 g Glukose wiegen und in 100 ml deionisiertem Wasser auflösen. Die Filtersterilisation erfolgt mit einer sterilen 50-ml-Spritze und einem 0,2-μM-PVDF-Spritzenvorsatzfilter in einem Röhrchen.
5. Bereiten Sie 10 ml sterile 1%ige Zinksulfatlösung vor, indem Sie 0,1 g Zinksulfat sorgfältig abwiegen und in 10 ml entionisiertem Wasser auflösen. Filtersterilisieren Sie mit einer sterilen 10-ml-Spritze und einem 0,2 μM PVDF-Spritzenvorsatzfilter in der Laminarhaube.
6. Mischen Sie die vorbereiteten Komponenten in 750 mL entionisiertem Wasser, wie in Tabelle 1 beschrieben. Messen Sie den pH-Wert der Lösung und stellen Sie ihn auf 7 ein. Füllen Sie das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 900 mL auf.
7. Autoklavieren Sie das Medium bei 15 PSI und 121 °C für 15-20 Minuten. Abkühlen lassen. Fügen Sie dann 100 μl filtersterilisiertes 1%iges Zinksulfat hinzu. Fügen Sie 100 mL filtersterilisierte 20%ige Glukose hinzu und lösen Sie sie gut auf.

2. Zubereitung von filtersterilisiertem 5% Tween-80

1. Lösen Sie 0,5 ml Tween-80 in 9,5 ml entionisiertem Wasser.
2. Sterilisieren Sie die Lösung mit einer sterilen 10-ml-Spritze und einem 0,2-μM-PVDF-Spritzenvorsatzfilter in der Laminarhaube.

3. Vorbereitung der Primärkultur

1. Verwenden Sie in der Laminarhaube eine serologische Pipette, um 2 ml autoklaviertes LB-Medium in zwei sterile 14-ml-Reagenzgläser zu dispensieren.
2. 20 μl filtersterilisiertes 5%iges Tween-80 mit einer Mikropipette in die Reagenzgläser geben.
3. M. smegmatis wird in eines der Röhrchen geimpft, indem man seinen Kryo-Schaft mit einer Impfschlaufe hinzufügt. Das andere Reagenzglas dient als Medienkontrolle.
4. Inkubieren Sie die Röhrchen 48 h lang in einem Schüttel-Inkubator bei 300 U/min und 37 °C.
   HINWEIS: Das Medienkontrollrohr sollte kein Wachstum aufweisen.

4. Vorbereitung der Sekundärkultur

1. Verwenden Sie in der Laminarhaube eine serologische Pipette, um 2 ml autoklaviertes LB-Medium in zwei sterile 14-ml-Reagenzgläser zu dispensieren.
2. 20 μl filtersterilisiertes 5%iges Tween-80 mit einer Mikropipette in die Reagenzgläser geben.
3. Geben Sie 20 μl der Primärkultur mit einer Mikropipette in eines der Röhrchen. Bewahren Sie die andere Röhre als Mediensteuerung auf.
4. Inkubieren Sie die Kulturen in einem Shaker-Inkubator bei 300 U/min und 37 °C, bis sie einen OD₆₀₀ von 0,6 bis 0,8 erreichen.
   HINWEIS: In der Regel dauert es 12 bis 14 Stunden, um einen OD₆₀₀ von 0,6 bis 0,8 zu erreichen. Es können auch andere Zelldichten verwendet werden, aber ein definierter OD_600-Wert hilft bei Vergleichsstudien.

5. Einrichten des Biofilms

1. In der laminaren Haube werden mit einer serologischen Pipette 6 ml Sauton-Medium, ergänzt mit 2 % Glukose, in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte dosiert.
2. Beimpfen Sie die jeweiligen Wells mit 120 μL (d.h. 2%) des Sekundärinokulums mit einer Mikropipette. Halten Sie einen ungeimpften gut als Medienkontrolle.
3. Mischen Sie das Medium und die Kultur, indem Sie mit einer 1-ml-Mikropipette auf und ab pipettieren. Decken Sie den Deckel ab und verschließen Sie die Platte vorsichtig mit Paraffinfolie.
4. Inkubieren Sie die Platte ungestört in einem statischen Inkubator bei 37 °C für 7 Tage.

6. Aufbau von Biofilmen für stadienspezifische Beobachtungen

HINWEIS: Der gesamte Aufbau des Biofilms ist derselbe wie in Schritt 5 beschrieben. Um Biofilm zu verschiedenen Zeitpunkten zu ernten oder abzubilden, wird empfohlen, dass derselbe Biofilm in mehreren Sets auf separaten Platten angelegt wird.

1. Um Biofilme zwischen Tag 3 und Tag 6 zu beobachten, bereiten Sie vier Platten mit identischen Bedingungen vor und verwenden Sie eine Platte pro Tag für die Bildgebung.
   HINWEIS: Die Biofilmschicht beginnt ab dem dritten Tag des Plattenaufbaus auf der Luft-Medium-Grenzfläche zu erscheinen.

7. Abschätzung der Biofilmentwicklung

1. Visuelle Schätzung
   1. Abbildung der Platten mit einem Gel-Dokumentationssystem mit epiweißer Lichtbeleuchtung (Abbildung 1).
      HINWEIS: Die Bildgebung liefert eine grobe qualitative und quantitative Schätzung des gebildeten Biofilms. Jede Kamera guter Qualität kann als Alternative verwendet werden.
2. Schätzung des Trockengewichts
   1. Führen Sie Trockengewichtsmessungen für eine genauere Quantifizierung durch.
   2. Um das Trockengewicht zu messen, wiegen Sie zunächst ein Löschpapier.
      HINWEIS: Anstelle von Löschpapier kann auch Filterpapier verwendet werden.
   3. Extrahieren Sie den Biofilm aus der 6-Well-Platte und übertragen Sie ihn mit einem Spachtel auf das Papier.
   4. Sammeln Sie vorsichtig den größten Teil des Biofilms aus der Kultur und achten Sie darauf, keine übermäßigen Mengen des Mediums auf das Papier zu übertragen.
   5. Lege den Biofilm auf das Löschpapier.
   6. Legen Sie es für 0,5-1 h bei 50 °C in einen Inkubator, bis der Biofilm vollständig getrocknet ist.
   7. Messen Sie das kombinierte Gewicht des Papiers und des Biofilms.
      HINWEIS: Trockengewicht des Biofilms=(Gewicht des Biofilms + Papier)-(Gewicht des Papiers)

8. Antibiotika-Toleranz-Assay in Biofilmen

1. Schätzen Sie den MIC90 von Rifampicin in M. smegmatis Planktonkultur nach dem von Irith Wiegand et al. beschriebenen Protokoll unter Verwendung von Sautons Medien¹¹. Fügen Sie das Antibiotikum hinzu, wenn die Kulturen einen OD₆₀₀ von 0,2 erreichen.
2. Richten Sie die Platten für das Biofilmwachstum ein, wie in Schritt 5 des Protokolls beschrieben.
3. Am vierten Tag der Inkubation geben Sie Rifampicin mit einer Mikropipette in der laminaren Haube in Kulturen mit einer MIC90-Konzentration (64 μg/ml) von den Seiten der Vertiefung.
   HINWEIS: Gehen Sie vorsichtig vor, ohne den Biofilm zu sehr zu stören. Lassen Sie eine der Vertiefungen mit Biofilm unbehandelt.
4. Schwenken Sie die Platten langsam, um die Antibiotika zu mischen.
5. Decken Sie die Seiten der Platten mit Paraffinfolie ab und bewahren Sie sie für das weitere Wachstum im Inkubator auf.
6. Nach 24 Stunden werden die Platten von der Laminarhaube entfernt und Tween-80 bis zu einer Endkonzentration von 0,2 % in alle Vertiefungen mit Biofilm gegeben.
7. Decken Sie die Platten erneut mit Paraffinfolie ab und halten Sie sie 12 h lang bei 4 °C und 100 U/min.
8. Nehmen Sie die Platten in einer laminaren Haube heraus und homogenisieren Sie die Bestandteile mit einer 1 mL Mikropipette.
9. Waschen Sie die Bestandteile mit Sautons Medien unter Verwendung des in Anand et ^al.12 beschriebenen Protokolls.
10. Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellen in 6 mL Sauton-Medium und verdünnen sie auf Endkonzentrationen von ^10-4, ^10-5, ^10-6 und ^10-7.
11. 100 μl jeder Verdünnung mit autoklavierten Glasperlen auf LB-Agarplatten verteilen.
12. Verschließen Sie alle Platten mit Paraffinfolie und bewahren Sie sie in einem Inkubator bei 37 °C auf.
13. Zählen Sie nach 3 Tagen Inkubation die Kolonien auf jeder Platte. Betrachten Sie nur die Platten mit einer Koloniezahl zwischen 30 und 300.
14. Berechnen Sie KBE/ml und die relative Abnahme von KBE/ml unter Verwendung der bereitgestellten Formeln¹³.
    HINWEIS: KBE/ml = (Anzahl der Kolonien × Verdünnungsfaktor) / (Volumenplattiert (in mL))
    Relative Abnahme der KBE/ml = ((KBE/ml bei unbehandelten - KBE/ml bei behandelten)) / ((KBE/ml bei unbehandelt)) × 100

Ergebnisse

Ab dem dritten Tag werden Biofilm-Pellikel mit bloßem Auge sichtbar. Obwohl der Biofilm auf dem Sauton-Medium ohne 2% Glukose wächst, wurde bei der Zugabe eine Verbesserung der Retikulation beobachtet. Wir erhielten 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) Biofilm-Trockengewicht aus jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 1,5 ml Sauton-Medium (ergänzt mit 2 % Glukose), das vier Tage lang gezüchtet wurde. In Abbildung 2 war die Biofilmentwicklung von Tag 3 bis Tag 6...

Diskussion

Die mehrzellige Lebensweise von Mikroben wurde vor fast einem Jahrhundert beschrieben; Klinische Studien sind jedoch nach wie vor spärlich, was vor allem auf den Mangel an robusten Methoden^{zurückzuführen ist 14}. Methoden, die in Arbeiten zur Biofilmbiologie beschrieben werden, sind oft schwer zu adaptieren. Hier wird erwartet, dass die detaillierte Methodik, unterstützt durch die Demonstration kritischer Schritte, die Reproduzierbarkeit der Protokolle verbesse...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251