גידול ביופילם מיקובקטריאלי כמודל לחקר עמידות מיקרוביאלית

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לפיתוח ביופילם כדורי. השיטה ניתנת להרחבה לנפחי תרבות שונים, ומאפשרת אימוץ קל למטרות ניסוי שונות. תכנון השיטה מאפשר הערכה איכותית או כמותית של פוטנציאל יצירת הביופילם של מספר מינים מיקובקטריאליים.

Abstract

חיידקים רבים משגשגים בקהילות טבעיות מורכבות, ומפגינים תכונות מפתח של רב-תאיות כגון תקשורת, שיתוף פעולה ותחרות. הביטוי השכיח ביותר של התנהגות רב-תאית חיידקית הוא היווצרות ביופילמים, הקשורים לעתים קרובות לפתוגנים. ביופילמים מציעים מקלט מפני חומרים אנטי-מיקרוביאליים, ומטפחים את הופעתה של עמידות מיקרוביאלית. הפרקטיקה המקובלת של גידול חיידקים בתרביות נוזליות של בקבוקים לנער אינה מייצגת את הצמיחה הפיזיולוגית הנכונה שלהם בטבע, וכתוצאה מכך מגבילה את הבנתנו את הדינמיקה המורכבת שלהם. יש לציין כי הפרופילים המטבוליים והשעתוק של חיידקים השוכנים בביופילמים דומים מאוד לאלה של תאים הגדלים באופן טבעי. הקבלה זו מדגישה את חשיבותם של ביופילמים כמודל אידיאלי למחקר יסודי ותרגומי. מאמר זה מתמקד בשימוש ב-Mycobacterium smegmatis כאורגניזם מודל כדי להדגים טכניקה לטיפוח ביופילמים כדוריים. הגישה ניתנת להתאמה לנפחי תרבית שונים, מה שמקל על יישומה למטרות ניסוי מגוונות כגון מחקרים מיקרוביאליים. יתר על כן, תכנון השיטה מאפשר הערכה איכותית או כמותית של יכולות יצירת הביופילם של מינים מיקובקטריאליים שונים עם התאמות קלות.

Introduction

חיידקים מסוגלים לשרוד כישויות חד-תאיות; עם זאת, ברוב התנאים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, הם מתארגנים למימטיקה קהילתית. ביופילם הוא ארגון קהילתי מוכר של חיידקים הנוצרים על ידי תאים מצטברים העטופים במטריצה¹ בייצור עצמי. הרכבה כזו היא בעלת חתימות של רב-תאיות מוקדמת ומספקת עמידות גבוהה יותר ללחץ למערכות חיידקים. ביופילמים הם לעתים קרובות סובלניים לאנטי-מיקרוביאליים, ומעריכים כי הם אחראים לכמעט 80% מהזיהומים המיקרוביאליים ^2,3.

שייק בקבוקים ותרביות מבוססות צלחות היו באופן מסורתי השיטות הרגילות לגידול חיידקים. ניתן לייחס את המקובלות וההצלחה העצומות שלהם לקלות הטיפול, יכולת השחזור והמדרגיות שלהם. עם זאת, היעדר הקשר פיזיולוגי מגביל את הפוטנציאל התרגומי של הידע שנוצר באמצעות מערכות כאלה⁴. לכן, ביופילמים הופכים למערכת מודל אטרקטיבית לחקר פתופיזיולוגיה חיידקית. ביופילמים מספקים מערכת מודל דינמית, המשקפת באופן הדוק תנאים טבעיים, ומאפשרת לחוקרים לשכפל היבטים פיזיולוגיים כגון שיפועים תזונתיים והטרוגניות מרחבית ^5,6.

אורח החיים של הביופילם רלוונטי במיוחד במחקרים מיקובקטריאליים, שכן מיקובקטריה, כולל Mycobacterium tuberculosis הידוע לשמצה, הם יוצרי ביופילם מיומנים⁷. היכולת שלהם לשגשג בתוך ביופילמים תורמת להתמדה שלהם ברקמות המארחות במהלך זיהומים. הוא מציב אתגר עצום בטיפול במחלות מיקובקטריאליות, בהתחשב בעמידות האינהרנטית לאנטיביוטיקה הקשורה לאורח חיים של ביופילם⁸. ביופילמים מספקים גם מערכת מודל אידיאלית לחקר מטבוליזם מיקובקטריאלי, שכן הם מאפשרים לחקור את ההתאמות המטבוליות הייחודיות ואת אסטרטגיות ניצול החומרים המזינים המשמשות מיקובקטריה בתוך קהילות מיקרוביאליות מורכבות⁹.

בעוד שהביופילם מתקבל יותר ויותר כמודל טוב יותר למחקרים מיקובקטריאליים¹⁰, יש צורך בהליכי פעולה סטנדרטיים עקביים וניתנים לשחזור, במיוחד כדי ליצור הקבלה בין מחקרים שנערכו במעבדות שונות. השיטה המתוארת כאן מתארת הליכי היווצרות ביופילם עבור מין מיקובקטריאלי, M. smegmatis. M. smegmatis הוא מודל נגיש יותר לחקר ביופילמים מיקובקטריאליים, בהתחשב באי-פתוגניות שלו ובקינטיקה מהירה יותר של היווצרות ביופילם. ניתן לשנות את השיטה כך שתתאים ליישומים כמו סינון אנטי-מיקובקטריאלי, מיצוי מטבוליטים ומחקרי אומיקס.

Protocol

הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. ההכנה התקשורתית של סאוטון

1. הכן 50 מ"ל של 2.5% אשלגן dihydrogen פוספט פתרון על ידי שקילה בזהירות 1.25 גרם של אשלגן dihydrogen פוספט להמיס אותו ב 50 מ"ל של מים deionized.
2. הכינו 50 מ"ל של תמיסת מגנזיום גופרתי 2.5% על ידי שקילת 2.56 גרם מגנזיום גופרתי והמסתו ב 50 מ"ל של מים נטולי יונים.
3. הכן 10 מ"ל של תמיסת ציטראט אמוניום ברזל 5% על ידי שקילת 0.5 גרם ברזל אמוניום ציטראט והמסתו ב -10 מ"ל של מים נטולי יונים. אחסנו אותו בשפופרת ענבר.
4. הכינו 100 מ"ל של תמיסת גלוקוז 20% על ידי שקילת 20 גרם גלוקוז והמסתו ב -100 מ"ל מים נטולי יונים. יש לסנן-לעקר באמצעות מזרק סטרילי בנפח 50 מ"ל ומסנן מזרק PVDF בגודל 0.2 מיקרומטר בצינור.
5. הכן 10 מ"ל של תמיסת אבץ גופרתי סטרילית 1% על ידי שקילה זהירה של 0.1 גרם אבץ גופרתי והמסתו ב -10 מ"ל של מים נטולי יונים. יש לסנן-לעקר באמצעות מזרק סטרילי בנפח 10 מ"ל ומסנן מזרק PVDF בגודל 0.2 מיקרומטר במכסה המנוע הלמינרי.
6. ערבבו את הרכיבים המוכנים ב-750 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה כמתואר בטבלה 1. מדוד את ה- pH של התמיסה והתאם אותו ל -7. לפצות את נפח ל 900 מ"ל עם מים deionized.
7. Autoclave את המדיה ב 15 PSI ו 121 ° C במשך 15-20 דקות. תנו לו להתקרר. לאחר מכן, הוסף 100 μL של 1% אבץ גופרתי מעוקר במסנן. מוסיפים 100 מ"ל של 20% גלוקוז מעוקר במסנן וממיסים אותו היטב.

2. הכנת מסנן מעוקר 5% Tween-80

1. להמיס 0.5 מ"ל של Tween-80 ב 9.5 מ"ל של מים deionized.
2. סנן-חיטוי התמיסה באמצעות מזרק סטרילי 10 מ"ל ומסנן מזרק PVDF 0.2 מיקרומטר במכסה המנוע הלמינרי.

3. הכנת התרבות הראשונית

1. במכסה המנוע הלמינרי, השתמש פיפטה סרולוגית כדי לחלק 2 מ"ל של מדיה LB autoclaved לתוך שתי מבחנות סטריליות 14 מ"ל.
2. הוסף 20 μL של 5% Tween-80 מעוקר מסנן למבחנות באמצעות micropipette.
3. חסן את M. smegmatis לתוך אחת הצינורות על ידי הוספת מלאי ההקפאה שלה באמצעות לולאת חיסון. המבחנה השנייה משמשת כבקרת מדיה.
4. לדגור את הצינורות במשך 48 שעות באינקובטור שייקר ב 300 סל"ד ו 37 ° C.
   הערה: צינור בקרת המדיה לא אמור להראות גידול.

4. הכנת התרבות המשנית

1. במכסה המנוע הלמינרי, השתמש פיפטה סרולוגית כדי לחלק 2 מ"ל של מדיה LB autoclaved לתוך שתי מבחנות סטריליות 14 מ"ל.
2. הוסף 20 μL של 5% Tween-80 מעוקר מסנן למבחנות באמצעות micropipette.
3. הוסף 20 μL של התרבית הראשונית לאחד הצינורות באמצעות micropipette. שמור את הצינור השני כפקד מדיה.
4. דוגרים על התרביות באינקובטור שייקר ב-300 סל"ד וב-37 מעלות צלזיוס עד שהן מגיעות ל-OD₆₀₀ של 0.6 עד 0.8.
   הערה: בדרך כלל לוקח 12 עד 14 שעות להגיע ל- OD₆₀₀ של 0.6 עד 0.8. ניתן להשתמש גם בצפיפויות תאים אחרות, אך ערך OD₆₀₀ מוגדר מסייע במחקרים השוואתיים.

5. הגדרת הביופילם

1. במכסה המנוע הלמינרי, יש לפזר 6 מ"ל של מדיה של סאוטון בתוספת 2% גלוקוז לכל באר של צלחת 6 בארות באמצעות פיפטה סרולוגית.
2. לחסן את הבארות בהתאמה עם 120 μL (כלומר, 2%) של החיסון המשני באמצעות micropipette. שמור אחד לא מחוסן היטב כמו בקרת מדיה.
3. מערבבים את המדיה והתרבות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם מיקרופיפטה של 1 מ"ל. מכסים את המכסה ואוטמים בזהירות את הצלחת בסרט פרפין.
4. לדגור את הצלחת ללא הפרעה באינקובטור סטטי ב 37 ° C במשך 7 ימים.

6. הגדרת ביופילמים לתצפיות תלויות שלב

הערה: הגדרת הביופילם הכוללת זהה לזו המתוארת בשלב 5. כדי לקצור או לצלם ביופילם בנקודות זמן שונות, מוצע שאותו ביופילם יוצב במספר סטים על לוחות נפרדים.

1. כדי לצפות בביופילמים בין היום השלישי ליום השישי, הכינו ארבע צלחות בתנאים זהים והשתמשו בצלחת אחת ביום להדמיה.
   הערה: שכבת הביופילם מתחילה להופיע בממשק אוויר-תווך החל מהיום השלישי של הגדרת הלוחות.

7. הערכת התפתחות הביופילם

1. הערכה חזותית
   1. דמיינו את הלוחות באמצעות מערכת תיעוד ג'ל עם תאורת אור אפי-לבן (איור 1).
      הערה: הדמיה נותנת הערכה איכותית וכמותית של הביופילם שנוצר. כל מצלמה באיכות טובה יכולה לשמש כחלופה.
2. הערכת משקל יבש
   1. בצע מדידת משקל יבש לכימות מדויק יותר.
   2. כדי למדוד משקל יבש, התחל בשקילת נייר ניקוי.
      הערה: ניתן להשתמש גם בנייר סינון במקום נייר ניקוי.
   3. חלצו את הביופילם מצלחת 6 הקידוחים והעבירו אותו לנייר בעזרת מרית.
   4. אספו בזהירות את רוב הביופילם מהתרבות, והיזהרו שלא להעביר כמויות מוגזמות של המדיה לעיתון.
   5. הניחו את הביופילם על נייר הניקוי.
   6. מניחים אותו באינקובטור ב 50 ° C למשך 0.5-1 שעות עד שהביופילם מתייבש לחלוטין.
   7. מדוד את המשקל המשולב של הנייר והביופילם.
      הערה: משקל יבש של ביופילם=(משקל ביופילם + נייר)-(משקל נייר)

8. בדיקת סבילות לאנטיביוטיקה בביופילמים

1. העריכו את MIC90 של ריפמפיצין בתרבית הפלנקטונית של M. smegmatis בהתאם לפרוטוקול שתואר על ידי אירית ויגנד ואחרים באמצעות המדיה של סאוטון¹¹. מוסיפים את האנטיביוטיקה כאשר התרביות מגיעות ל-OD₆₀₀ של 0.2.
2. הגדר את הלוחות לגידול ביופילם כמתואר בשלב 5 של הפרוטוקול.
3. ביום הרביעי של הדגירה מוסיפים ריפמפיצין לתרביות בריכוז MIC90 (64 מק"ג/מ"ל) מצידי הבאר באמצעות מיקרופיפטה במכסה המנוע הלמינרי.
   הערה: עשו זאת בזהירות מבלי להפריע יותר מדי לביופילם. השאירו את אחת הבארות עם ביופילם ללא טיפול.
4. מערבלים לאט את הצלחות כדי לערבב את האנטיביוטיקה.
5. מכסים את דפנות הצלחות בסרט פרפין ושומרים אותם באינקובטור להמשך צמיחה.
6. לאחר 24 שעות, הסירו את הלוחות ממכסה המנוע הלמינרי והוסיפו את Tween-80 לריכוז סופי של 0.2% בכל הבארות המכילות ביופילם.
7. שוב, לכסות את הצלחות עם סרט פרפין ולשמור אותם ב 4 ° C ו 100 סל"ד במשך 12 שעות.
8. הוציאו את הצלחות במכסה מנוע למינרי והומוגניזציה של המרכיבים עם מיקרופיפטה של 1 מ"ל.
9. שטפו את המרכיבים במדיה של סאוטון באמצעות הפרוטוקול המתואר ב-Anand et ^al.12.
10. לבסוף, להשעות מחדש את התאים במדיה של 6 מ"ל סאוטון ולדלל לריכוזים סופיים של ^10-4, ^10-5, ^{10-6 ו-10-7}.
11. מורחים 100 μL מכל דילול על לוחות LB-agar באמצעות חרוזי זכוכית אוטוקלאביים.
12. אוטמים את כל הצלחות באמצעות סרט פרפין ושומרים אותם באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
13. לאחר 3 ימי דגירה, ספרו מושבות על כל צלחת. קחו בחשבון רק את הצלחות עם ספירת מושבות בין 30 ל -300.
14. חשב CFU/מ"ל ואת הירידה היחסית ב- CFU/מ"ל באמצעות הנוסחאות שסופקו¹³.
    הערה: CFU/מ"ל = (מס' מושבות × גורם דילול) / (מצופה נפח (במ"ל))
    ירידה יחסית ב- CFU/mL = (CFU/mL ב- Untreated - CFU/mL ב- Tréated)) / ((CFU/mL ב- Untreated)) × 100

תוצאות

כדורי ביופילם הופכים גלויים לעין בלתי מהיום השלישי ואילך. למרות שביופילם גדל על המדיה של סאוטון ללא 2% גלוקוז, נצפה שיפור ברטיקולציה כאשר הוא הוסף. השגנו 10.48 מ"ג ± 3.13 מ"ג (n = 4) של משקל יבש של ביופילם מכל באר של צלחת 24 בארות עם 1.5 מ"ל של מדיה של סאוטון (בתוספת 2% גלוקוז) גדל במשך אר...

Discussion

אורח החיים הרב-תאי של מיקרובים תואר לפני כמעט מאה שנה; עם זאת, המחקרים הקליניים נותרו דלילים, בעיקר בשל היעדר שיטות חזקות¹⁴. שיטות המתוארות בעבודות על ביולוגיה של ביופילם הן לעתים קרובות קשות להסתגלות. כאן, המתודולוגיה המפורטת, בסיוע הדגמות של צעדים קריטיים, צ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251