A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לפיתוח ביופילם כדורי. השיטה ניתנת להרחבה לנפחי תרבות שונים, ומאפשרת אימוץ קל למטרות ניסוי שונות. תכנון השיטה מאפשר הערכה איכותית או כמותית של פוטנציאל יצירת הביופילם של מספר מינים מיקובקטריאליים.

Abstract

חיידקים רבים משגשגים בקהילות טבעיות מורכבות, ומפגינים תכונות מפתח של רב-תאיות כגון תקשורת, שיתוף פעולה ותחרות. הביטוי השכיח ביותר של התנהגות רב-תאית חיידקית הוא היווצרות ביופילמים, הקשורים לעתים קרובות לפתוגנים. ביופילמים מציעים מקלט מפני חומרים אנטי-מיקרוביאליים, ומטפחים את הופעתה של עמידות מיקרוביאלית. הפרקטיקה המקובלת של גידול חיידקים בתרביות נוזליות של בקבוקים לנער אינה מייצגת את הצמיחה הפיזיולוגית הנכונה שלהם בטבע, וכתוצאה מכך מגבילה את הבנתנו את הדינמיקה המורכבת שלהם. יש לציין כי הפרופילים המטבוליים והשעתוק של חיידקים השוכנים בביופילמים דומים מאוד לאלה של תאים הגדלים באופן טבעי. הקבלה זו מדגישה את חשיבותם של ביופילמים כמודל אידיאלי למחקר יסודי ותרגומי. מאמר זה מתמקד בשימוש ב-Mycobacterium smegmatis כאורגניזם מודל כדי להדגים טכניקה לטיפוח ביופילמים כדוריים. הגישה ניתנת להתאמה לנפחי תרבית שונים, מה שמקל על יישומה למטרות ניסוי מגוונות כגון מחקרים מיקרוביאליים. יתר על כן, תכנון השיטה מאפשר הערכה איכותית או כמותית של יכולות יצירת הביופילם של מינים מיקובקטריאליים שונים עם התאמות קלות.

Introduction

חיידקים מסוגלים לשרוד כישויות חד-תאיות; עם זאת, ברוב התנאים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, הם מתארגנים למימטיקה קהילתית. ביופילם הוא ארגון קהילתי מוכר של חיידקים הנוצרים על ידי תאים מצטברים העטופים במטריצה1 בייצור עצמי. הרכבה כזו היא בעלת חתימות של רב-תאיות מוקדמת ומספקת עמידות גבוהה יותר ללחץ למערכות חיידקים. ביופילמים הם לעתים קרובות סובלניים לאנטי-מיקרוביאליים, ומעריכים כי הם אחראים לכמעט 80% מהזיהומים המיקרוביאליים 2,3.

שייק בקבוקים ותרביות מבוססות צלחות היו באופן מסורתי השיטות הרגילות לגידול חיידקים. ניתן לייחס את המקובלו....

Protocol

הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. ההכנה התקשורתית של סאוטון

  1. הכן 50 מ"ל של 2.5% אשלגן dihydrogen פוספט פתרון על ידי שקילה בזהירות 1.25 גרם של אשלגן dihydrogen פוספט להמיס אותו ב 50 מ"ל של מים deionized.
  2. הכינו 50 מ"ל של תמיסת מגנזיום גופרתי 2.5% על ידי שקילת 2.56 גרם מגנזיום גופרתי והמסתו ב 50 מ"ל של מים נטולי יונים.
  3. הכן 10 מ"ל של תמיסת ציטראט אמוניום ברזל 5% על ידי שקילת 0.5 גרם ברזל אמוניום ציטראט והמסתו ב -10 מ"ל של מים נטולי יונים. אחסנו אותו בשפופרת ענבר.
  4. הכינו 100 מ"ל של תמיסת גלוקוז 20% על ידי ש....

תוצאות

כדורי ביופילם הופכים גלויים לעין בלתי מהיום השלישי ואילך. למרות שביופילם גדל על המדיה של סאוטון ללא 2% גלוקוז, נצפה שיפור ברטיקולציה כאשר הוא הוסף. השגנו 10.48 מ"ג ± 3.13 מ"ג (n = 4) של משקל יבש של ביופילם מכל באר של צלחת 24 בארות עם 1.5 מ"ל של מדיה של סאוטון (בתוספת 2% גלוקוז) גדל במשך אר.......

Discussion

אורח החיים הרב-תאי של מיקרובים תואר לפני כמעט מאה שנה; עם זאת, המחקרים הקליניים נותרו דלילים, בעיקר בשל היעדר שיטות חזקות14. שיטות המתוארות בעבודות על ביולוגיה של ביופילם הן לעתים קרובות קשות להסתגלות. כאן, המתודולוגיה המפורטת, בסיוע הדגמות של צעדים קריטיים, צ.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מלגת DBT-Ramalingaswami שהוענקה לעמית אנאנד.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µM PVDF syringe filterAxivaSFNY04 R
1 mL tipsGenetixGXM-611000 C
10 µL tipsGenetixGXM-6110 C
200 µL tipsGenetixGXM-61200C
6-well polypropylene platesTarsons980010
Amber tubesTarsons546051
AutoclaveHospharma
Biosafety Cabinet A IIMSET
Blotting paperAny suitable vendor
CentrifugeEppendorf
Citric acidSigma251275
CuvettesBio-Rad2239955
Ferric ammonium citrateSigmaF5879
Gel documentation systemBio-Rad
Glass BeadsSigmaG8772
GlucoseSigma49139
GlycerolSigmaG5516
Inoculation loopsGenaxyHS81121C
L-AspargineSigmaA0884
LB-agarHimediaM1151
LB-mediaHimediaM575
M. smegmatis mc2155 cryo-stockATCC700084
Magnesium sulfateSigmaM2643
MicropipettesGilson
ParafilmTarsons
Petri DishTarsons460020
pH meterLabman Scientific Instruments
Plate ReaderTecan
Polypropylene test tubesGenaxyGEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasicSigmaP5379
RifampicinMedchemExpressHY-B0272
Serological pipetteSPL Life Sciences95210
Shaker IncubatorEppendorf
Spatula
SpectrophotometerThermo Scientific
Static IncubatorCARON
Sterile 10 mL syringeBecton Dickinson309642
Sterile 50 mL syringeBecton Dickinson309653
Tween-80SigmaP1754
Weighing balanceSartorius
Zinc sulfateSigmaZ0251

References

  1. Davey, M. E., O'toole, G. A. Microbial biofilms: From ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
  2. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
  3. ....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved