גידול ביופילם מיקובקטריאלי כמודל לחקר עמידות מיקרוביאלית

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לפיתוח ביופילם כדורי. השיטה ניתנת להרחבה לנפחי תרבות שונים, ומאפשרת אימוץ קל למטרות ניסוי שונות. תכנון השיטה מאפשר הערכה איכותית או כמותית של פוטנציאל יצירת הביופילם של מספר מינים מיקובקטריאליים.

Abstract

חיידקים רבים משגשגים בקהילות טבעיות מורכבות, ומפגינים תכונות מפתח של רב-תאיות כגון תקשורת, שיתוף פעולה ותחרות. הביטוי השכיח ביותר של התנהגות רב-תאית חיידקית הוא היווצרות ביופילמים, הקשורים לעתים קרובות לפתוגנים. ביופילמים מציעים מקלט מפני חומרים אנטי-מיקרוביאליים, ומטפחים את הופעתה של עמידות מיקרוביאלית. הפרקטיקה המקובלת של גידול חיידקים בתרביות נוזליות של בקבוקים לנער אינה מייצגת את הצמיחה הפיזיולוגית הנכונה שלהם בטבע, וכתוצאה מכך מגבילה את הבנתנו את הדינמיקה המורכבת שלהם. יש לציין כי הפרופילים המטבוליים והשעתוק של חיידקים השוכנים בביופילמים דומים מאוד לאלה של תאים הגדלים באופן טבעי. הקבלה זו מדגישה את חשיבותם של ביופילמים כמודל אידיאלי למחקר יסודי ותרגומי. מאמר זה מתמקד בשימוש ב-Mycobacterium smegmatis כאורגניזם מודל כדי להדגים טכניקה לטיפוח ביופילמים כדוריים. הגישה ניתנת להתאמה לנפחי תרבית שונים, מה שמקל על יישומה למטרות ניסוי מגוונות כגון מחקרים מיקרוביאליים. יתר על כן, תכנון השיטה מאפשר הערכה איכותית או כמותית של יכולות יצירת הביופילם של מינים מיקובקטריאליים שונים עם התאמות קלות.

Introduction

חיידקים מסוגלים לשרוד כישויות חד-תאיות; עם זאת, ברוב התנאים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, הם מתארגנים למימטיקה קהילתית. ביופילם הוא ארגון קהילתי מוכר של חיידקים הנוצרים על ידי תאים מצטברים העטופים במטריצה¹ בייצור עצמי. הרכבה כזו היא בעלת חתימות של רב-תאיות מוקדמת ומספקת עמידות גבוהה יותר ללחץ למערכות חיידקים. ביופילמים הם לעתים קרובות סובלניים לאנטי-מיקרוביאליים, ומעריכים כי הם אחראים לכמעט 80% מהזיהומים המיקרוביאליים ^2,3.

שייק בקבוקים ותרביות מבוססות צלחות היו באופן מסורתי השיטות הרגילות לגידול חיידקים. ניתן לייחס את המקובלו....

Protocol

הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. ההכנה התקשורתית של סאוטון

1. הכן 50 מ"ל של 2.5% אשלגן dihydrogen פוספט פתרון על ידי שקילה בזהירות 1.25 גרם של אשלגן dihydrogen פוספט להמיס אותו ב 50 מ"ל של מים deionized.
2. הכינו 50 מ"ל של תמיסת מגנזיום גופרתי 2.5% על ידי שקילת 2.56 גרם מגנזיום גופרתי והמסתו ב 50 מ"ל של מים נטולי יונים.
3. הכן 10 מ"ל של תמיסת ציטראט אמוניום ברזל 5% על ידי שקילת 0.5 גרם ברזל אמוניום ציטראט והמסתו ב -10 מ"ל של מים נטולי יונים. אחסנו אותו בשפופרת ענבר.
4. הכינו 100 מ"ל של תמיסת גלוקוז 20% על ידי ש....

תוצאות

כדורי ביופילם הופכים גלויים לעין בלתי מהיום השלישי ואילך. למרות שביופילם גדל על המדיה של סאוטון ללא 2% גלוקוז, נצפה שיפור ברטיקולציה כאשר הוא הוסף. השגנו 10.48 מ"ג ± 3.13 מ"ג (n = 4) של משקל יבש של ביופילם מכל באר של צלחת 24 בארות עם 1.5 מ"ל של מדיה של סאוטון (בתוספת 2% גלוקוז) גדל במשך אר.......

Discussion

אורח החיים הרב-תאי של מיקרובים תואר לפני כמעט מאה שנה; עם זאת, המחקרים הקליניים נותרו דלילים, בעיקר בשל היעדר שיטות חזקות¹⁴. שיטות המתוארות בעבודות על ביולוגיה של ביופילם הן לעתים קרובות קשות להסתגלות. כאן, המתודולוגיה המפורטת, בסיוע הדגמות של צעדים קריטיים, צ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251