Cultiver un biofilm mycobactérien comme modèle pour étudier la résistance aux antimicrobiens

Résumé

Ce protocole décrit une méthode robuste pour développer un biofilm pelliculaire. La méthode est adaptable à différents volumes de culture, ce qui permet une adoption facile pour divers objectifs expérimentaux. La conception de la méthode permet d’évaluer qualitativement ou quantitativement le potentiel de formation de biofilms de plusieurs espèces mycobactériennes.

Résumé

De nombreuses bactéries prospèrent dans des communautés naturelles complexes, présentant des attributs clés de la multicellularité tels que la communication, la coopération et la compétition. La manifestation la plus répandue du comportement multicellulaire bactérien est la formation de biofilms, souvent liés à la pathogénicité. Les biofilms offrent un refuge contre les agents antimicrobiens, favorisant l’émergence de la résistance aux antimicrobiens. La pratique conventionnelle de cultiver des bactéries dans des cultures liquides en flacons agités ne parvient pas à représenter leur croissance physiologique appropriée dans la nature, ce qui limite par conséquent notre compréhension de leur dynamique complexe. Notamment, les profils métaboliques et transcriptionnels des bactéries résidant dans les biofilms ressemblent beaucoup à ceux des cellules en croissance naturelle. Ce parallélisme souligne l’importance des biofilms en tant que modèle idéal pour la recherche fondamentale et translationnelle. Cet article se concentre sur l’utilisation de Mycobacterium smegmatis comme organisme modèle pour illustrer une technique de culture de biofilms de pellicules. L’approche est adaptable à différents volumes de culture, facilitant sa mise en œuvre pour divers objectifs expérimentaux tels que les études antimicrobiennes. De plus, la conception de la méthode permet d’évaluer qualitativement ou quantitativement les capacités de formation de biofilms de différentes espèces mycobactériennes avec des ajustements mineurs.

Introduction

Les bactéries sont capables de survivre en tant qu’entités unicellulaires ; Cependant, dans la plupart des conditions physiologiquement pertinentes, ils s’organisent en mimétiques communautaires. Le biofilm est une organisation communautaire largement reconnue de bactéries formées de cellules agrégées enfermées dans une matrice autoproduite¹. Un tel assemblage possède des signatures de multicellularité précoce et offre une plus grande résistance au stress aux systèmes bactériens. Les biofilms sont souvent tolérants aux antimicrobiens et on estime qu’ils sont responsables de près de 80 % des infections microbiennes ^2,3.

Les cultures en flacons agités et sur plaque sont traditionnellement les pratiques habituelles pour la culture bactérienne. Leur énorme acceptabilité et leur succès peuvent être attribués à leur facilité de manipulation, à leur reproductibilité et à leur évolutivité. Cependant, l’absence de contexte physiologique limite le potentiel translationnel des connaissances générées à l’aide de tels systèmes⁴. Par conséquent, les biofilms deviennent un système modèle attrayant pour étudier la physiopathologie bactérienne. Les biofilms fournissent un système modèle dynamique, reflétant étroitement les conditions naturelles, permettant aux chercheurs de reproduire des aspects physiologiques tels que les gradients de nutriments et l’hétérogénéité spatiale ^5,6.

Le mode de vie du biofilm est particulièrement pertinent dans les études mycobactériennes, car les mycobactéries, y compris la célèbre Mycobacterium tuberculosis, sont des formateurs de biofilms⁷. Leur capacité à se développer dans les biofilms contribue à leur persistance dans les tissus de l’hôte pendant les infections. Il pose un formidable défi dans le traitement des maladies mycobactériennes, compte tenu de la résistance aux antibiotiques inhérente aux modes de vie des biofilms⁸. Les biofilms constituent également un système modèle idéal pour étudier le métabolisme des mycobactéries, car ils permettent d’étudier les adaptations métaboliques uniques et les stratégies d’utilisation des nutriments employées par les mycobactéries au sein de communautés microbiennes complexes⁹.

Alors que le biofilm est de plus en plus accepté comme un meilleur système modèle pour les études mycobactériennes¹⁰, il est nécessaire de disposer de procédures opérationnelles standard cohérentes et reproductibles, en particulier pour établir des parallèles entre les études menées dans différents laboratoires. La méthode décrite ici décrit les procédures de formation du biofilm pour une espèce mycobactérienne, M. smegmatis. M. smegmatis est un modèle plus accessible pour l’étude des biofilms mycobactériens, compte tenu de sa non-pathogénicité et de sa cinétique de formation de biofilm plus rapide. La méthode peut être modifiée pour s’adapter à des applications telles que le dépistage d’antimycobactériens, l’extraction de métabolites et les études omiques.

Protocole

Les détails de tous les réactifs et équipements utilisés pour l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. La préparation médiatique de Sauton

1. Préparez 50 ml de solution de dihydrogénophosphate de potassium à 2,5 % en pesant soigneusement 1,25 g de dihydrogénophosphate de potassium et en le dissolvant dans 50 ml d’eau déminéralisée.
2. Préparez 50 ml de solution de sulfate de magnésium à 2,5 % en pesant 2,56 g de sulfate de magnésium et en le dissolvant dans 50 ml d’eau déminéralisée.
3. Préparez 10 ml de solution de citrate d’ammonium ferrique à 5 % en pesant 0,5 g de citrate d’ammonium ferrique et en le dissolvant dans 10 ml d’eau désionisée. Conservez-le dans un tube ambré.
4. Préparez 100 ml de solution de glucose à 20 % en pesant 20 g de glucose et en le dissolvant dans 100 ml d’eau déminéralisée. Stériliser par filtre à l’aide d’une seringue stérile de 50 ml et d’un filtre pour seringue en PVDF de 0,2 μM dans un tube.
5. Préparez 10 ml de solution stérile de sulfate de zinc à 1 % en pesant soigneusement 0,1 g de sulfate de zinc et en le dissolvant dans 10 ml d’eau déminéralisée. Stérilisez par filtre à l’aide d’une seringue stérile de 10 ml et d’un filtre de seringue en PVDF de 0,2 μM dans le capot laminaire.
6. Mélanger les composants préparés dans 750 mL d’eau déminéralisée comme décrit dans le tableau 1. Mesurez le pH de la solution et ajustez-le à 7. Compléter le volume à 900 mL avec de l’eau déminéralisée.
7. Autoclavez le média à 15 PSI et 121 °C pendant 15 à 20 min. Laissez-le refroidir. Ensuite, ajoutez 100 μL de sulfate de zinc à 1 % stérilisé par filtre. Ajoutez 100 ml de glucose à 20 % stérilisé par filtre et dissolvez-le bien.

2. Préparation du Tween-80 5% stérilisé par filtre

1. Dissoudre 0,5 mL de Tween-80 dans 9,5 mL d’eau désionisée.
2. Stérilisez la solution à l’aide d’une seringue stérile de 10 ml et d’un filtre pour seringue en PVDF de 0,2 μM dans le capot laminaire.

3. Préparation de la culture primaire

1. Dans le capuchon laminaire, à l’aide d’une pipette sérologique, distribuer 2 mL de milieu LB autoclavé dans deux tubes à essai stériles de 14 mL.
2. Ajouter 20 μL de Tween-80 5% stérilisé par filtre dans les tubes à essai à l’aide d’une micropipette.
3. Inocuculez M. smegmatis dans l’un des tubes en ajoutant son stock cryogénique à l’aide d’une boucle d’inoculation. L’autre tube à essai sert de contrôle du support.
4. Incuber les tubes pendant 48 h dans un incubateur à 300 tr/min et 37 °C.
   REMARQUE : Le tube de contrôle du support ne doit pas montrer de croissance.

4. Préparation de la culture secondaire

1. Dans le capuchon laminaire, à l’aide d’une pipette sérologique, distribuer 2 mL de milieu LB autoclavé dans deux tubes à essai stériles de 14 mL.
2. Ajouter 20 μL de Tween-80 5% stérilisé par filtre dans les tubes à essai à l’aide d’une micropipette.
3. Ajouter 20 μL de la culture primaire dans l’un des tubes à l’aide d’une micropipette. Gardez l’autre tube comme support de contrôle.
4. Incuber les cultures dans un incubateur à 300 tr/min et 37 °C jusqu’à ce qu’elles atteignent une DO₆₀₀ de 0,6 à 0,8.
   REMARQUE : Il faut généralement 12 à 14 heures pour atteindre une OD₆₀₀ de 0,6 à 0,8. D’autres densités cellulaires peuvent également être utilisées, mais une valeur OD₆₀₀ définie facilite les études comparatives.

5. Mise en place du biofilm

1. Dans le capuchon laminaire, distribuer 6 mL de milieu de Sauton complété par 2 % de glucose dans chaque puits d’une plaque à 6 puits à l’aide d’une pipette sérologique.
2. Inoculer dans les puits respectifs 120 μL (c.-à-d. 2 %) de l’inoculum secondaire à l’aide d’une micropipette. Gardez-en un non inoculé comme témoin du milieu.
3. Mélangez le milieu et la culture en pipetant de haut en bas à l’aide d’une micropipette de 1 ml. Couvrez le couvercle et fermez soigneusement la plaque avec un film de paraffine.
4. Incuber la plaque sans être dérangée dans un incubateur statique à 37 °C pendant 7 jours.

6. Mise en place de biofilms pour des observations spécifiques à un stade

REMARQUE : La configuration globale du biofilm est la même que celle décrite à l’étape 5. Pour récolter ou imager le biofilm à différents moments dans le temps, il est suggéré que le même biofilm soit mis en place en plusieurs ensembles sur des plaques distinctes.

1. Pour observer les biofilms entre le jour 3 et le jour 6, préparez quatre plaques dans des conditions identiques et utilisez une plaque par jour pour l’imagerie.
   REMARQUE : La couche de biofilm commence à apparaître sur l’interface air-milieu à partir du troisième jour de configuration de la plaque.

7. Estimation du développement du biofilm

1. Estimation visuelle
   1. Imagez les plaques à l’aide d’un système de documentation en gel avec éclairage à lumière épi-blanche (Figure 1).
      REMARQUE : L’imagerie donne une estimation qualitative et quantitative grossière du biofilm formé. N’importe quel appareil photo de bonne qualité peut être utilisé comme alternative.
2. Estimation du poids à sec
   1. Effectuez une mesure du poids à sec pour une quantification plus précise.
   2. Pour mesurer le poids à sec, commencez par peser un papier buvard.
      REMARQUE : Le papier filtre peut également être utilisé à la place du papier buvard.
   3. Extrayez le biofilm de la plaque à 6 puits et transférez-le sur le papier à l’aide d’une spatule.
   4. Prélevez soigneusement la majeure partie du biofilm de la culture, en prenant soin de ne pas transférer des quantités excessives de milieu sur le papier.
   5. Placez le biofilm sur le papier buvard.
   6. Placez-le dans un incubateur à 50 °C pendant 0,5 à 1 h jusqu’à ce que le biofilm sèche complètement.
   7. Mesurez le poids combiné du papier et du biofilm.
      REMARQUE : Poids sec du biofilm = (Poids du biofilm + papier)-(Poids du papier)

8. Dosage de la tolérance aux antibiotiques dans les biofilms

1. Estimer la CMI90 de la rifampicine dans la culture planctonique de M. smegmatis en suivant le protocole décrit par Irith Wiegand et al. en utilisant le milieu de Sauton¹¹. Ajouter l’antibiotique lorsque les cultures atteignent une DO₆₀₀ de 0,2.
2. Installez les plaques pour la croissance du biofilm comme décrit à l’étape 5 du protocole.
3. Le quatrième jour d’incubation, ajouter la rifampicine aux cultures à la concentration MIC90 (64 μg/mL) à partir des côtés du puits à l’aide d’une micropipette dans le capuchon laminaire.
   REMARQUE : Faites-le avec précaution sans trop déranger le biofilm. Laissez l’un des puits avec un biofilm non traité.
4. Faites tourner lentement les plaques pour mélanger les antibiotiques.
5. Couvrez les côtés des plaques d’un film de paraffine et conservez-les dans l’incubateur pour une croissance ultérieure.
6. Après 24 h, retirez les plaques du capot laminaire et ajoutez Tween-80 à une concentration finale de 0,2% dans tous les puits contenant du biofilm.
7. Une fois de plus, couvrez les plaques d’un film de paraffine et maintenez-les à 4 °C et 100 tr/min pendant 12 h.
8. Sortir les plaques dans un capuchon laminaire et homogénéiser les constituants à l’aide d’une micropipette de 1 ml.
9. Lavez les constituants avec le milieu de Sauton en utilisant le protocole décrit dans Anand et ^al.12.
10. Enfin, remettre les cellules en suspension dans un milieu de 6 mL de Sauton et les diluer jusqu’à des concentrations finales de ^10-4, ^10-5, ^10-6 et ^10-7.
11. Étaler 100 μL de chaque dilution sur des plaques de gélose LB à l’aide de billes de verre autoclavées.
12. Fermez toutes les plaques à l’aide d’un film de paraffine et conservez-les dans un incubateur à 37 °C.
13. Après 3 jours d’incubation, comptez les colonies sur chaque plaque. Ne considérez que les plaques avec un nombre de colonies compris entre 30 et 300.
14. Calculer l’UFC/mL et la diminution relative de l’UFC/mL à l’aide des formules fournies¹³.
    REMARQUE : UFC/mL = (Nombre de colonies × facteur de dilution) / (Volume plaqué (en mL))
    Diminution relative de l’UFC/mL = ((UFC/mL dans les aliments non traités - UFC/mL dans les aliments traités)) / ((UFC/mL dans les aliments non traités)) × 100

Résultats

Les pellicules du biofilm deviennent visibles à l’œil nu à partir du troisième jour. Bien que le biofilm se développe sur le milieu de Sauton sans 2% de glucose, une amélioration a été observée dans la réticulation lorsqu’il a été ajouté. Nous avons obtenu 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) de poids sec de biofilm à partir de chaque puits d’une plaque de 24 puits avec 1,5 mL de milieu de Sauton (complété par 2% de glucose) cultivé pendant quatre jours. Sur

Discussion

Le mode de vie multicellulaire des microbes a été décrit il y a près d’un siècle. Cependant, les études cliniques restent rares, principalement en raison du manque de méthodes robustes¹⁴. Les méthodes décrites dans les travaux sur la biologie du biofilm sont souvent difficiles à adapter. Ici, la méthodologie détaillée, aidée par des démonstrations d’étapes critiques, devrait améliorer la reproductibilité des protocoles.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251