تصوير الفاصل الزمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية في شرائح دماغ الفأر الجنينية

Summary

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنشأ الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في منطقة البطين المبطنة للبطين وتهاجر نحو سطح الدماغ. تشارك العديد من الجينات في هذه العملية. يقدم هذا البروتوكول تقنية التصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية.

Abstract

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنشأ الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في منطقة البطين المبطنة للبطين وتهاجر نحو سطح الدماغ. هذه العملية ضرورية لوظيفة الدماغ المناسبة ، ويمكن أن يؤدي عدم تنظيمها إلى اضطرابات النمو العصبي والنفسي بعد الولادة. في الواقع ، تم العثور على العديد من الجينات المسؤولة عن هذه الأمراض تشارك في هذه العملية ، وبالتالي ، فإن الكشف عن كيفية تأثير هذه الطفرات على الديناميات الخلوية أمر مهم لفهم التسبب في هذه الأمراض. يقدم هذا البروتوكول تقنية للتصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية في شرائح الدماغ التي تم الحصول عليها من أجنة الفئران. يتم تمييز الخلايا ببروتينات الفلورسنت باستخدام التثقيب الكهربائي في الرحم ، والذي يصور الخلايا الفردية المهاجرة من منطقة البطين بنسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. علاوة على ذلك ، يتيح لنا نظام نقل الجينات في الجسم الحي إجراء تجارب اكتساب الوظيفة أو فقدان الوظيفة بسهولة على جينات معينة عن طريق التثقيب الكهربائي المشترك لتعبيرها أو نواقل الضربة القاضية / الضربة القاضية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تحليل سلوك الهجرة وسرعة هجرة الخلايا الفردية ، وهي معلومات لا يتم الحصول عليها أبدا من أدمغة ثابتة.

Introduction

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنتج الدبقية الكعبرية (القمية) في منطقة البطين الشاب (VZ) المبطنة للبطين الجانبي الخلايا العصبية الأولى ثم السلف الدبقي مع بعض الفترة المتداخلة¹. يتم إنشاء الخلايا العصبية أيضا من السلف الوسيط أو الدبقية الشعاعية القاعدية في المنطقة تحت البطينية (SVZ) المجاورة ل VZ ، وكلاهما ينشأ من الدبقية الشعاعية (القمية) ^2,3. في الفئران ، تنتج الخلايا الدبقية الشعاعية الخلايا العصبية فقط في اليوم الجنيني (E) 12-14 ، كل من الخلايا العصبية والأسلاف الدبقية في E15-16 ، والأسلاف الدبقية من E17 فصاعدا⁴. يتمايز السكان الرئيسيون من الأسلاف الدبقية المتولدة خلال هذه المراحل الجنينية بشكل تفضيلي إلى خلايا نجمية ، على الرغم من أن بعض الخلايا تتمايز أيضا إلى خلايا قليلة التغصن⁵. تهاجر الخلايا العصبية وأسلاف الخلايا النجمية المتولدة في هذه المراحل نحو سطح الدماغ وتدخل الصفيحة القشرية (المادة الرمادية القشرية المستقبلية). تحدث الهجرة العصبية من VZ إلى الصفيحة القشرية على مراحل متعددة. تتبنى الخلايا العصبية أولا مورفولوجيا متعددة الأقطاب فوق منطقة تراكم الخلايا متعددة الأقطاب (MAZ) ، متداخلة مع SVZ أو المنطقة الوسيطة ، حيث تمتد بقوة وتتراجع عن عمليات رقيقة متعددة وتهاجر ببطء (الهجرة متعددة الأقطاب)^6,7. بعد حوالي 24 ساعة ، تتحول الخلايا العصبية إلى مورفولوجيا ثنائية القطب ، وتمتد عملية رائدة سميكة نحو سطح الدماغ وعملية لاحقة رقيقة للخلف ، وتهاجر خطيا نحو سطح الدماغ باستخدام عملية شعاعية تمتد من الدبقية الشعاعية إلى سطح بيال كسقالة ، والتي تسمى وضع الحركة ^2,8. نظرا لأن الخلايا العصبية في وضع الحركة تصل دائما إلى السطح الخارجي للصفيحة القشرية ، وتمر عبر سابقاتها أسفل المنطقة الهامشية مباشرة ، يتم محاذاة الخلايا العصبية بطريقة تعتمد على تاريخ الميلاد من الداخل إلى الخارج في اللوحة القشرية^9،10،11.

في المقابل ، تهاجر أسلاف الخلايا النجمية بسرعة إلى المنطقة الوسيطة والصفيحة القشرية ، مع تغييرات اتجاهية متكررة. يختلف سلوك الهجرة هذا تماما عن الهجرة العصبية ويسمى الهجرة غير المنتظمة⁵. تهاجر أسلاف الخلايا النجمية أيضا على طول الأوعية الدموية في عملية تسمى الهجرة الموجهة بالأوعية الدموية. تقوم أسلاف الخلايا النجمية بالتبديل بين أوضاع الهجرة هذه والوصول إلى اللوحة القشرية ^5,12. على الرغم من أن موضع الخلايا النجمية لا يتم تحديده بدقة من خلال تاريخ إنتاجها ، فقد لوحظ ميل معتدل للخلايا النجمية المولودة مبكرا للاستقرار في الجزء السطحي من الصفيحة القشرية⁵. ومن المثير للاهتمام ، أن الخلايا النجمية التي تستقر في الصفيحة القشرية تتولد في المراحل الجنينية وتتمايز في النهاية إلى خلايا نجمية بروتوبلازمية ، في حين أن الخلايا النجمية المتولدة بعد الولادة لا تهاجر بنشاط ، وتبقى في المادة البيضاء ، وتتمايز إلى خلايا نجمية ليفية⁵. كيف تحدث هذه المواصفات المعتمدة على المرحلة للأنواع الفرعية النجمية لا تزال غير واضحة.

تم تحديد عدد متزايد من الجينات المشاركة في هجرة الخلايا العصبية ، بما في ذلك تلك المشاركة في اضطرابات النمو العصبي والنفسية^13،14. لذلك ، من الأهمية بمكان توضيح آثار الطفرات في هذه الجينات على سلوك الخلايا العصبية المهاجرة. كما ذكرنا سابقا ، تحدث الهجرة العصبية على مراحل متعددة. يمكن أن تحدد ملاحظات الفاصل الزمني بشكل مباشر المرحلة التي تتأثر بشكل رئيسي (خروج دورة الخلية ، والانتقال متعدد الأقطاب ثنائي القطب ، وسرعة هجرة الحركة ، وما إلى ذلك). ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء مواصفات الخلايا النجمية وهجرتها وموقعها لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. بالنظر إلى أن الخلايا النجمية تلعب أدوارا حاسمة في تكوين المشبك¹⁵ وتشكيل حاجز الدم في الدماغ أثناء نمو الدماغ¹⁶ ، فقد تؤدي العيوب التنموية في الخلايا النجمية إلى اضطرابات النمو العصبي. قد توضح دراسات الفاصل الزمني على أسلاف الخلايا النجمية هذه الآليات الجزيئية وعلاقتها بالمرض العقلي.

يوفر هذا البروتوكول طريقة لمراقبة الفاصل الزمني للخلايا المشتقة من VZ القشرية. تم بالفعل نشر بروتوكول فيديو مماثل لمراقبة هجرة الخلايا العصبية¹⁷. نصف هنا طريقة كل من الخلايا العصبية المهاجرة وأسلاف الخلايا النجمية. لتسمية هذه الخلايا ببروتينات الفلورسنت ، مثل البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء (GFP و RFP) ، يتم إدخال مخاليط البلازميد التي تحتوي على مكونات مناسبة في VZ القشري عن طريق التثقيب الكهربائي في الرحم في المراحل المناسبة^{18،19،20،21}. تتم إزالة الأجنة التي تم التلاعب بها في المراحل المطلوبة ، ويتم تقطيع الأدمغة واستخدامها لمراقبة الفاصل الزمني باستخدام مجهر المسح بالليزر. يمكن فحص سرعة الهجرة واتجاهها والسلوكيات الأخرى ، التي لا يتم تناولها أبدا باستخدام عينات الدماغ الثابتة ، باستخدام هذه الطريقة. يمكن بسهولة نقل نواقل التثقيب الكهربائي في الرحم والتعبير والضربة القاضية / الضربة القاضية بالتزامن مع ناقلات البروتين الفلورية ، مما يمكننا من إجراء دراسات كسب الوظيفة وفقدان الوظيفة لجينات معينة.

Protocol

تم إجراء الدراسة الحالية بموافقة واتباع إرشادات لجنة رعاية واستخدام التابعة لمعهد البحوث التنموية ومركز أيتشي للإعاقة التنموية (# 2019-013) وجامعة كيو (A2021-030). تم الحصول على الفئران الحامل الموقوتة ICR (النوع البري) تجاريا (انظر جدول المواد). لمراقبة العلاقة بين الخلايا المهاجرة والأوعية الدموية ، تم استخدام الفئران Flt1-DsRed ، حيث تعبر الخلايا البطانية عن DsRed²². تم عبور ذكور الفئران Flt1-DsRed مع إناث الفئران ICR (كان كلا الفئران في سن 8-24 أسبوعا). تم إيواء جميع والتلاعب بها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) حتى أخذ العينات. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. في التثقيب الكهربائي الرحم

1. قم بإعداد محلول ملحي مخزن HEPES (HBS) عن طريق إضافة كمية متساوية من المياه المعقمة إلى 2x HBS المتاحة تجاريا.
2. هناك خياران للتخدير. إيزوفلوران (استنشاق) و MMB (حقن). في حالة استخدام MMB ، قم بإعداده على النحو التالي. أضف 0.75 مل من ميديتوميدين (1 مجم / مل) ، و 2 مل من الميدازولام (5 مجم / مل) ، و 2.5 مل من بوتورفانول (5 مجم / مل) في 19.75 مل من الماء المعقم²³.
   ملاحظة: يصبح هذا الحل المخدر أقل نشاطا في غضون 2 أشهر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية مع واقي خفيف.
3. تحضير حل أتيباميزول. تمييع 0.75 مل من أتيباميزول (5 ملغ / مل) مع 24.25 مل من الماء المعقم.
4. تحضير 0.2٪ (وزن / حجم) محلول أخضر سريع في الماء المعقم. تعقيم مع مرشح (حجم المسام 0.22 ميكرومتر).
5. تحضير البلازميد باستخدام مجموعة تنقية البلازميد التقليدية على أساس التحلل القلوي وتنقية العمود²³ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). قم بإذابة البلازميد المنقى من مزرعة بكتيريا 100 مل في 30-50 ميكرولتر من HBS لتحضير مخزون البلازميد (3-5 ميكروغرام / ميكرولتر) (الملف التكميلي 1).
   1. امزج وخفف مخزون البلازميد مع HBS ، وأضف حجم 1/10 من 0.2٪ Fast Green لتلوين الحقن. يتم تحديد المكونات والتركيزات النهائية للبلازميدات وفقا للغرض منها (الجدول 1).
6. اصنع الماصات الدقيقة عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب ماصة.
   ملاحظة: يتم قطع طرف الماصة بشكل غير مباشر باستخدام ملقط رفيع. يبلغ القطر الخارجي للطرف حوالي 70 ميكرومتر. ضع علامة على الماصات الدقيقة على فترات 2 ميكرولتر عن طريق امتصاص 2 ميكرولتر من الماء.
7. حقن مخدر MMB بجرعة 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم داخل الصفاق في الفأر الحامل في مرحلة مناسبة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
   ملاحظة: يجب تحديد المراحل الجنينية المراد التلاعب بها وفقا للغرض. لتسمية الخلايا العصبية الهرمية II / III المستقبلية ، E14.5 مناسب. لتسمية السلف الدبقية ، يجب إجراء التثقيب الكهربائي على E15-16. بدلا من ذلك ، يمكن تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (1٪ -2٪).
8. بعد تخدير الفأر بعمق ، ضعه على طبق دافئ عند 38 درجة مئوية.
   ملاحظة: تأكد من أن الماوس لا يستجيب لقرص الذيل.
9. بعد إزالة الفراء حول موقع الجراحة باستخدام كريم مزيل الشعر ، قم بتطهير المنطقة الجراحية عدة مرات بحركة دائرية باستخدام كل من المقشر القائم على اليود والكحول بنسبة 70٪. قم بعمل شق جلدي بطول 2 سم على طول خط الوسط من مستوى الزوج الخلفي الثاني من الحلمات الأمامية ، متبوعا بشق خط الوسط 2 سم في جدار البطن على طول خط ألبا (الشكل 1 أ).
   ملاحظة: في عملية شق في جدار البطن ، ارفعه قليلا بالملقط الناعم حتى لا تقطع الأعضاء الداخلية.
10. ضع ورقة بلاستيكية معقمة على الجلد وقطعة من المناديل الورقية المعقمة عليها (الشكل 1 أ). قم بعمل ثقب في المركز لكشف المنطقة الجراحية.
    ملاحظة: يتم وضع الورقة البلاستيكية المعقمة وورق المناديل المعقمة بعد إجراء الشق لأن مجال الرؤية الواسع مطلوب لوضع الشق في إشارة إلى موضع الحلمات.
11. بلل الورق باستخدام برنامج تلفزيوني معقم ، وراقب بعناية قرون الرحم من الشق ، واسحب قرن الرحم من خلال ثقوب الصفيحة البلاستيكية والورق.
12. باستخدام ماصة دقيقة متصلة بمجموعة أنبوب الشافطة ، قم بحقن 1 ميكرولتر من مزيج البلازميد في البطين الجانبي الأيسر أو الأيمن من خلال جدار الرحم عن طريق ضغط الزفير (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن حقن البلازميد باستخدام حاقن دقيق.
13. قرصة رأس الجنين بقطب كهربائي من نوع الملقط وتطبيق نبضات إلكترونية باستخدام كهربائي (35 فولت ل E14-16 ، 50 فولت ل E17 ، 50 مللي ثانية نبضات مربعة مع فترات 450 مللي ثانية ، 5 مرات) (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: لا تضغط على رأس الأجنة بقوة ، مما يؤدي إلى تلف الأجنة. يجب أن يكون التيار الفعلي 40-70 مللي أمبير.
14. ضع قرن الرحم مرة أخرى في تجويف البطن.
15. خياطة جدار البطن باستخدام خيط الحرير 5-0.
16. ضع محلول أتيباميزول بجرعة 10 ميكرولتر / جم من وزن الجسم داخل الصفاق.
17. خياطة الجلد باستخدام خيط الحرير 5-0.
    ملاحظة: يمكن إغلاق الجلد باستخدام مشبك تلقائي.
18. احتفظ بالفئران التي تم التلاعب بها على طبق دافئ لمدة 30 دقيقة على الأقل. ستبدأ الفئران في التحرك في القفص.
    ملاحظة: يجب أن يتم إجراء التثقيب الكهربائي في الرحم (من الخطوات 1.7 إلى 1.16) في غضون 30 دقيقة. وقت العملية النموذجي هو 20 دقيقة.

2. تحضير الشرائح

ملاحظة: نضارة الشرائح هي مفتاح نجاح هذه التجربة. يجب تحضير الشرائح (من الخطوات 2.5-2.12) في غضون ساعتين.

1. تحضير محلول ملح هانكس المتوازن باستخدام Ca²⁺ و Mg²⁺ ؛ HBSS (+). أضف 5 مل من CaCl₂ (14 جم / لتر ، معقم) و 5 مل من MgSO 4.7H₂O (20 جم / لتر ، معقم) إلى 500 مل من HBSS (-). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. ضع المحلول في فقاعة بنسبة 95٪ O₂ + 5٪ CO₂ لمدة 5 دقائق على الثلج قبل الاستخدام.
2. إعداد وسط الثقافة. هناك حاجة إلى 2.5 مل / طبق على الأقل. أضف 2 مل من مصل الجنين البقري ، 25 ميكرولتر من L-glutamine (200 mM) ، 200 μL B27 (50x) ، 50 μL من البنسلين + الستربتومايسين (10 K وحدة / مل و 10 ملغ / مل) إلى 8 مل من الوسط العصبي القاعدي.
3. إعداد 3 ٪ انخفاض درجة حرارة انصهار هلام الأغاروز. المسام 50 مل من HBSS (+) ، ثم إضافة 1.5 ملغ من الأغاروز درجة حرارة الانصهار المنخفضة ، والأوتوكلاف عليه. تذوب الأغاروز في فرن الميكروويف وتحتفظ به عند 50 درجة مئوية في حاضنة حمام مائي قبل الاستخدام.
4. أضف 1.9 مل من وسط الاستزراع إلى طبق قاعدة زجاجية. ضع ملحق زراعة الخلايا عليه بعناية حتى لا تحبس المصابيح الهوائية تحت المرشح ، ثم أضف 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع على المرشح (الشكل 1 ب). ضعه على الجليد.
5. بعد تخدير الفئران التي تم التلاعب بها عن طريق استنشاق 5٪ إيزوفلوران ، التضحية بها عن طريق خلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) في المراحل المناسبة التي يجب مراعاتها.
   ملاحظة: يومان (48 ساعة) و 3 أيام بعد التثقيب الكهربائي عند E14.5 مناسبان لمراقبة الانتقال متعدد الأقطاب ثنائي القطب ووضع الحركة ، على التوالي.
6. أخرج الأجنة وضعها في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني بارد.
7. حدد الأجنة عن طريق التعبير عن GFP أو بروتينات الفلورسنت الأخرى تحت المجهر.
8. بعد قطع رأس الأجنة ، قم بتشريح الأدمغة⁶ تحت مجهر تشريح واحتفظ بها في HBSS البارد (+).
9. صب جل الأغاروز المذاب بنسبة 3٪ في كريومولد (انظر جدول المواد) ، ثم ضع العقول فيه ولفها عدة مرات. ضعه في درجة حرارة الغرفة حتى يصلب الأغاروز تماما ، ثم ضعه على الجليد.
10. قم بتقطيع الأدمغة إكليليا بسمك 350 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم مهتز (انظر جدول المواد).
11. رتب الشرائح على المرشح (بحد أقصى 6 شرائح لكل مرشح).
12. اسحب وسط الاستزراع من داخل وخارج كوب المرشح (إجمالي 600 ميكرولتر). في هذه الخطوة ، يتم ضغط الشرائح وتثبيتها على مرشح. بعد 5 دقائق ، أضف 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى داخل ملحق زراعة الخلية.

3. التصوير بفاصل زمني

1. احتفظ بحجرة المزرعة مثبتة على مرحلة مجهر المسح بالليزر المقلوب عند 37 درجة مئوية باستخدام سخان الغرفة أو غطاء يحيط بالمجهر قبل 30 دقيقة على الأقل من التصوير لمنع انحراف Z. قم بتزويد غرفة الثقافة بغاز مرطب بنسبة 5٪ CO₂ + 40٪ O₂ .
2. اضبط طبق الثقافة مع الشرائح المحضرة أعلاه في غرفة الثقافة.
3. باستخدام عدسة 20x لمسافة عمل طويلة (NA = 0.45) ، احصل على حوالي 10 صور Z-stack بخطوات 5 ميكرومتر كل 15-30 دقيقة لمدة 24 ساعة.
   ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام مرحلة XY الآلية. يتيح لنا ذلك الحصول على صور من حقول موضوعية متعددة. عادة ، نحصل على 10-20 صورة من حقول موضوعية مختلفة في تجربة واحدة بفاصل زمني.

4. تحليل التصوير

1. قم بتحويل صور XYZT إلى XYT بأقصى إسقاط للمحور Z باستخدام ImageJ أو برامج أخرى.
   ملاحظة: إذا انزلقت الشرائح أثناء الملاحظة ، فاضبط موضع الخلايا داخل الصور باستخدام StackRed ، وهو مكون إضافي ل ImageJ ، مع وظيفته المتمثلة في تحويل الجسم الصلب (انظر جدول المواد).
2. تتبع مسار GFP- أو غيرها من الخلايا الإيجابية للبروتين الفلوري إما يدويا أو تلقائيا. يمكن إجراء التتبع اليدوي والتلقائي باستخدام MTrackJ²⁴ و TrackMate ^25,26 (مكونات ImageJ الإضافية) ، على التوالي. يعد التتبع التلقائي باستخدام TrackMate فعالا لتحليل العديد من الخلايا بطريقة غير متحيزة. ومع ذلك ، يظل التتبع اليدوي باستخدام MTrackJ مفيدا للتتبع الدقيق للخلايا الفردية.

النتائج

تنتج الخلايا الدبقية الكعبرية في VZ الحبيبي الخلايا العصبية فقط حتى E14 ، وكل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في E15 و E16. لمراقبة السلوكيات المهاجرة للخلايا العصبية والخلايا الدبقية في وقت واحد ، قمنا بتصنيفها باستخدام GFP المحسن (EGFP) و RFP ، على التوالي ، باستخدام مروج خاص بالخلايا العصبية ?...

Discussion

قدم هذا البروتوكول طريقة لمراقبة الفاصل الزمني للخلايا المشتقة من VZ الشاحب (القشري). لتسمية الخلايا المهاجرة من VZ ، استخدمنا في التثقيب الكهربائي للرحم ، حيث تم تمييز الخلايا الفردية بوضوح بنسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى من الملصقات بوساطة النواقل الفيروسية. باستخدام التثقيب الكهربائي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.