تصوير الفاصل الزمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية في شرائح دماغ الفأر الجنينية

Summary

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنشأ الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في منطقة البطين المبطنة للبطين وتهاجر نحو سطح الدماغ. تشارك العديد من الجينات في هذه العملية. يقدم هذا البروتوكول تقنية التصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية.

Abstract

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنشأ الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في منطقة البطين المبطنة للبطين وتهاجر نحو سطح الدماغ. هذه العملية ضرورية لوظيفة الدماغ المناسبة ، ويمكن أن يؤدي عدم تنظيمها إلى اضطرابات النمو العصبي والنفسي بعد الولادة. في الواقع ، تم العثور على العديد من الجينات المسؤولة عن هذه الأمراض تشارك في هذه العملية ، وبالتالي ، فإن الكشف عن كيفية تأثير هذه الطفرات على الديناميات الخلوية أمر مهم لفهم التسبب في هذه الأمراض. يقدم هذا البروتوكول تقنية للتصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية في شرائح الدماغ التي تم الحصول عليها من أجنة الفئران. يتم تمييز الخلايا ببروتينات الفلورسنت باستخدام التثقيب الكهربائي في الرحم ، والذي يصور الخلايا الفردية المهاجرة من منطقة البطين بنسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. علاوة على ذلك ، يتيح لنا نظام نقل الجينات في الجسم الحي إجراء تجارب اكتساب الوظيفة أو فقدان الوظيفة بسهولة على جينات معينة عن طريق التثقيب الكهربائي المشترك لتعبيرها أو نواقل الضربة القاضية / الضربة القاضية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تحليل سلوك الهجرة وسرعة هجرة الخلايا الفردية ، وهي معلومات لا يتم الحصول عليها أبدا من أدمغة ثابتة.

Introduction

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنتج الدبقية الكعبرية (القمية) في منطقة البطين الشاب (VZ) المبطنة للبطين الجانبي الخلايا العصبية الأولى ثم السلف الدبقي مع بعض الفترة المتداخلة¹. يتم إنشاء الخلايا العصبية أيضا من السلف الوسيط أو الدبقية الشعاعية القاعدية في المنطقة تحت البطينية (SVZ) المجاورة ل VZ ، وكلاهما ينشأ من الدبقية الشعاعية (القمية) ^2,3. في الفئران ، تنتج الخلايا الدبقية الشعاعية الخلايا العصبية فقط في اليوم الجنيني (E) 12-14 ، كل من الخلايا العصبية والأسلاف الدبقية في E15-16 ، والأسلاف الدبقية من E17 فصاعدا⁴. يتمايز السكان الرئيسيون من الأسلاف الدبقية المتول....

Protocol

تم إجراء الدراسة الحالية بموافقة واتباع إرشادات لجنة رعاية واستخدام التابعة لمعهد البحوث التنموية ومركز أيتشي للإعاقة التنموية (# 2019-013) وجامعة كيو (A2021-030). تم الحصول على الفئران الحامل الموقوتة ICR (النوع البري) تجاريا (انظر جدول المواد). لمراقبة العلاقة بين الخلايا المهاجرة والأوعية الدموية ، تم استخدام الفئران Flt1-DsRed ، حيث تعبر الخلايا البطانية عن DsRed²². تم عبور ذكور الفئران Flt1-DsRed مع إناث الفئران ICR (كان كلا الفئران في سن 8-24 أسبوعا). تم إيواء جميع والتلاعب بها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) حتى أخذ العينات. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.....

النتائج

تنتج الخلايا الدبقية الكعبرية في VZ الحبيبي الخلايا العصبية فقط حتى E14 ، وكل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في E15 و E16. لمراقبة السلوكيات المهاجرة للخلايا العصبية والخلايا الدبقية في وقت واحد ، قمنا بتصنيفها باستخدام GFP المحسن (EGFP) و RFP ، على التوالي ، باستخدام مروج خاص بالخلايا العصبية ?.......

Discussion

قدم هذا البروتوكول طريقة لمراقبة الفاصل الزمني للخلايا المشتقة من VZ الشاحب (القشري). لتسمية الخلايا المهاجرة من VZ ، استخدمنا في التثقيب الكهربائي للرحم ، حيث تم تمييز الخلايا الفردية بوضوح بنسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى من الملصقات بوساطة النواقل الفيروسية. باستخدام التثقيب الكهربائي.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.