Покадровая визуализация мигрирующих нейронов и глиальных предшественников в эмбриональных срезах мозга мышей

Резюме

Во время развития коры головного мозга нейроны и глиальные клетки берут начало в желудочковой зоне, выстилающей желудочек, и мигрируют к поверхности мозга. В этом процессе участвует множество генов. Этот протокол представляет собой технику покадровой визуализации мигрирующих нейронов и глиальных предшественников.

Аннотация

Во время развития коры головного мозга нейроны и глиальные клетки берут начало в желудочковой зоне, выстилающей желудочек, и мигрируют к поверхности мозга. Этот процесс имеет решающее значение для правильной работы мозга, и его нарушение может привести к нервно-психическим расстройствам и психическим расстройствам после рождения. На самом деле, было обнаружено, что многие гены, ответственные за эти заболевания, участвуют в этом процессе, и поэтому раскрытие того, как эти мутации влияют на клеточную динамику, важно для понимания патогенеза этих заболеваний. Этот протокол представляет собой метод покадровой визуализации мигрирующих нейронов и глиальных предшественников в срезах мозга, полученных из эмбрионов мышей. Клетки помечаются флуоресцентными белками с помощью внутриутробной электропорации, которая визуализирует отдельные клетки, мигрирующие из желудочковой зоны с высоким соотношением сигнал/шум. Более того, эта система переноса генов in vivo позволяет нам легко проводить эксперименты по усилению или потере функции на данных генах путем совместной электропорации их экспрессии или нокдаунов/нокаутных векторов. Используя этот протокол, можно анализировать миграционное поведение и скорость миграции отдельных клеток, информацию, которая никогда не получается от неподвижного мозга.

Введение

Во время развития коры головного мозга (апикальная) радиальная глия в паллиальной желудочковой зоне (ВЗ), выстилающей латеральный желудочек, продуцирует сначала нейроны, а затем глиальные предшественники с некоторым перекрывающимся периодом¹. Нейроны также генерируются промежуточными предшественниками или базальной радиальной глией в субвентрикулярной зоне (SVZ), прилегающей к VZ, оба из которых происходят из (апикальной) радиальной глии ^2,3. У мышей радиальные глиальные клетки продуцируют только нейроны на эмбриональный день (E) 12-14, оба нейрона и глиальные предшественники на E15-16, а глиальные предшественники с E17 и^{далее 4}. Основная популяция глиальных предшественников, образованных на этих эмбриональных стадиях, преимущественно дифференцируется в астроциты, хотя некоторые клетки также дифференцируются в олигодендроциты5^. Нейроны и предшественники астроцитов, образующиеся на этих стадиях, мигрируют к поверхности мозга и попадают в корковую пластину (будущее корковое серое вещество). Миграция нейронов из VZ в корковую пластинку происходит в несколько фаз. Нейроны сначала принимают многополярную морфологию непосредственно над многополярной зоной накопления клеток (МАЗ), перекрывая SVZ или промежуточную зону, где они энергично расширяются и втягивают множественные тонкие отростки и медленно мигрируют (мультиполярная миграция)^6,7. Примерно через 24 ч нейроны трансформируются в биполярную морфологию, расширяя толстый ведущий отросток к поверхности мозга и тонкий отстающий отросток назад, и линейно мигрируют к поверхности мозга, используя радиальный отросток, простирающийся от радиальной глии к поверхности пиала в качестве каркаса, который называется режимом локомоции ^2,8. Поскольку нейроны в режиме локомоции всегда достигают самой внешней поверхности корковой пластинки, проходя через своих предшественников прямо под маргинальной зоной, нейроны выстраиваются в корковой пластинке ^9,10,11 в зависимости от даты рождения наизнанку.

Напротив, предшественники астроцитов быстро мигрируют в промежуточную зону и кортикальную пластинку, с частыми изменениями направления. Это миграционное поведение полностью отличается от миграции нейронов и называется эрратической миграцией^. Предшественники астроцитов также мигрируют по кровеносным сосудам в процессе, называемом миграцией, управляемой кровеносными сосудами. Предшественники астроцитов переключаются между этими режимами миграции и достигают корковой пластинки ^5,12. Несмотря на то, что расположение астроцитов строго не определяется датой их образования^{, наблюдалась} умеренная тенденция раннерожденных астроцитов оседать в поверхностной части корковой пластинки. Интересно, что астроциты, которые оседают в корковой пластинке, генерируются на эмбриональных стадиях и в конечном итоге дифференцируются в протоплазматические астроциты, в то время как постнатально генерируемые астроциты не мигрируют активно, остаются в белом веществе и дифференцируются в волокнистые астроциты^. Как происходит эта стадийно-зависимая спецификация астроцитарных подтипов, остается неясным.

Выявлено растущее число генов, участвующих в миграции нейронов, в том числе тех, которые участвуют в развитии нервной системы и психических расстройствах^13,14. Поэтому крайне важно выяснить влияние мутаций в этих генах на поведение мигрирующих нейронов. Как упоминалось ранее, миграция нейронов происходит в несколько фаз. Покадровые наблюдения могут непосредственно определить фазу, которая в основном затронута (выход из клеточного цикла, мультиполярно-биполярный переход, скорость миграции локомоции и т. д.). Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе спецификации, миграции и позиционирования астроцитов, остаются в значительной степени неизвестными. Учитывая, что астроциты играют решающую роль в синаптогенезе15 и формировании гематоэнцефалического барьера во время развития ^мозга16, дефекты развития астроцитов могут приводить к нарушениям развития нервной системы. Покадровые исследования предшественников астроцитов могут прояснить эти молекулярные механизмы и их связь с психическими заболеваниями.

Этот протокол предоставляет метод покадрового наблюдения за корковыми клетками, полученными из VZ. Подобный видеопротокол для наблюдения за миграцией нейронов уже опубликован¹⁷. В этой статье мы опишем метод как для мигрирующих нейронов, так и для предшественников астроцитов. Для мечения этих клеток флуоресцентными белками, такими как зеленые и красные флуоресцентные белки (GFP и RFP), плазмидные смеси, содержащие соответствующие компоненты, вводят в кортикальную VZ путем внутриутробной электропорации на соответствующих стадиях 18,19,20,21. Манипулируемые эмбрионы удаляются на желаемых стадиях, а мозг разрезается и используется для покадровых наблюдений с помощью лазерного сканирующего микроскопа. Скорость, направление миграции и другие факторы поведения, которые никогда не рассматриваются с помощью фиксированных образцов мозга, могут быть изучены с помощью этого метода. Использование внутриутробной электропорации, экспрессии и нокдауна/нокаута векторов может быть легко перенесено одновременно с флуоресцентными белковыми векторами, что позволяет нам проводить исследования усиления и потери функции конкретных генов.

протокол

Настоящее исследование было проведено с одобрения и в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу за животными и их использованию Института исследований развития, Центра инвалидности развития Айти (#2019-013) и Университета Кэйо (A2021-030). Мышей с временной беременностью ICR (дикого типа) были получены коммерчески (см. таблицу материалов). Для наблюдения за взаимосвязью между мигрирующими клетками и кровеносными сосудами использовали мышей Flt1-DsRed, у которых эндотелиальные клетки экспрессируют DsRed²². Самцов мышей Flt1-DsRed скрещивали с самками мышей ICR (обе мыши были в возрасте 8-24 недель). Все животные содержались и обрабатывались в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF) до отбора проб. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Внутриутробная электропорация

1. Приготовьте буферизованный физиологический раствор HEPES, добавив равный объем автоклавной воды к коммерчески доступным 2x HBS.
2. Существует два варианта анестетиков; изофлуран (ингаляции) и MMB (инъекции). В случае использования MMB, готовьте его следующим образом. Добавьте 0,75 мл медетомидина (1 мг/мл), 2 мл мидазолама (5 мг/мл) и 2,5 мл буторфанола (5 мг/мл) в 19,75 мл автоклавированной воды²³.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот обезболивающий раствор становится менее активным в течение 2 месяцев. Хранить при температуре 4 °C с помощью светозащитного экрана.
3. Приготовьте раствор атипамезола. Разведите 0,75 мл атипамезола (5 мг/мл) с 24,25 мл автоклавной воды.
4. Приготовьте 0,2% (масс./об.) раствор Fast Green в автоклавной воде. Простерилизовать с помощью фильтра (размер пор 0,22 мкм).
5. Готовят плазмиду с помощью обычного набора для очистки плазмид на основе щелочного лизиса и очистки колонки²³ в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Растворите очищенную плазмиду из 100 мл культуры бактерий в 30-50 мкл HBS для получения плазмидного сырья (3-5 мкг/мкл) (Дополнительный файл 1).
   1. Смешайте и разбавьте плазмидные массы с HBS и добавьте 1/10 объема 0,2% Fast Green для окрашивания инжектора. Компоненты и конечные концентрации плазмид определены в соответствии с их назначением (табл. 1).
6. Делайте микропипетки, вытягивая стеклянные капилляры с помощью съемника для пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик пипетки разрезается наискось с помощью тонких щипцов. Внешний диаметр наконечника составляет примерно 70 мкм. Отметьте микропипетки с интервалом 2 μл, всасывая 2 μл воды.
7. Введите анестетик MMB в дозе 10 мкл/г массы тела внутрибрюшинно беременной мыши на соответствующем этапе (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
   Примечание: Эмбриональные стадии, с которыми необходимо манипулировать, должны быть определены в соответствии с целью. Для обозначения будущих пирамидальных нейронов II/III подходит E14.5. Для маркировки глиальных предшественников необходимо провести электропорацию на Е15-16. В качестве альтернативы, мышей можно обезболить путем ингаляции изофлурана (1%-2%).
8. После того, как мышь будет глубоко обезболиваена, поместите ее на теплую пластину при температуре 38 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы мышь не реагировала на щипки за хвост.
9. После удаления шерсти вокруг места операции с помощью крема для депиляции продезинфицируйте операционную область несколько раз круговыми движениями как скрабом на основе йода, так и 70% спиртом. Сделайте разрез кожи длиной 2 см по средней линии от уровня^2-й самой задней пары сосков спереди, а затем разрез по средней линии 2 см в брюшной стенке по белой линии (рисунок 1А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе разреза брюшной стенки слегка приподнимайте его тонкими щипцами, чтобы не разрезать внутренние органы.
10. Положите на кожу стерильный пластиковый лист и на него лист стерильной папиросной бумаги (рисунок 1А). Создайте отверстие в центре, чтобы обнажить операционную область.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильный пластиковый лист и стерильная папиросная бумага помещаются после разреза, потому что для расположения разреза относительно положения сосков требуется широкое поле обзора.
11. Намочите бумагу стерильным ПБС, внимательно осмотрите рога матки от разреза, а рог матки вытяните через отверстия пластикового листа и бумаги.
12. С помощью микропипетки, прикрепленной к аспираторной трубке, введите 1 мкл плазмидной смеси в левый или правый боковой желудочек через стенку матки под давлением выдоха (рис. 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы плазмида может быть введена с помощью микроинъектора.
13. Защемите головку эмбриона электродом пинцетального типа и подайте электронные импульсы с помощью электропоратора (35 В для Е14-16, 50 В для Е17, квадратные импульсы 50 мс с интервалом 450 мс, 5 раз) (рисунок 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не зажимайте сильно голову эмбрионов, так как это может повредить эмбрионы. Фактический ток должен составлять 40-70 мА.
14. Поместите маточный рог обратно в брюшную полость.
15. Сшить брюшную стенку с помощью шелковой нити 5-0.
16. Применяют раствор атипамезола в дозе 10 мкл/г массы тела внутрибрюшинно.
17. Сшить кожу с помощью шелковой нити 5-0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скин можно закрыть с помощью автоклипа.
18. Держите обработанных мышей на теплой тарелке не менее 30 минут. Мыши начнут двигаться в клетке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура внутриутробной электропорации (с шагов 1.7 по 1.16) должна быть выполнена в течение 30 минут. Типичное время работы составляет 20 минут.

2. Подготовка ломтиков

ПРИМЕЧАНИЕ: Свежесть ломтиков является ключом к успеху этого эксперимента. Ломтики должны быть подготовлены (из шагов 2.5-2.12) в течение 2 часов.

1. Приготовьте сбалансированный солевой раствор Хэнкса с Ca²⁺ и Mg²⁺; HBSS(+). Добавьте 5 мл CaCl₂ (14 г/л, автоклавирование) и 5 мл MgSO_{4.7H 2O}(20 г/л, автоклавирование) к 500 мл HBSS(-). Хранить при температуре 4 °C. Перед использованием раствор с 95% O₂ + 5% CO₂ в течение 5 минут опустошите на лед.
2. Подготовьте питательную среду. Необходимо не менее 2,5 мл на чашку. Добавьте 2 мл фетальной бычьей сыворотки, 25 мкл L-глутамина (200 мМ), 200 мкл B27 (50x), 50 мкл пенициллина + стрептомицина (10 тыс. ед./мл и 10 мг/мл) к 8 мл нейробазальной среды.
3. Приготовьте 3% агарозный гель с низкой температурой плавления. Порите 50 мл HBSS (+), затем добавьте 1,5 мг агарозы с низкой температурой плавления и автоклавируйте ее. Перед использованием растопите агарозу в микроволновой печи и выдержите ее при температуре 50 °C в инкубаторе на водяной бане.
4. Добавьте 1,9 мл питательной среды в стеклянную форму для основания. Осторожно наденьте на него вставку для клеточных культур, чтобы не застрять воздушные колбы под фильтром, затем добавьте 500 мкл питательной среды на фильтр (рис. 1B). Положите его на лед.
5. После обезболивания манипулируемых мышей путем ингаляции 5% изофлурана принесите их в жертву путем вывиха шейки матки (в соответствии с институционально утвержденными протоколами) на соответствующих стадиях наблюдения.
   Примечание: Через два дня (48 ч) и 3 дня после электропорации в точке E14.5 можно наблюдать мультиполярно-биполярный переход и режим локомоции соответственно.
6. Достаньте эмбрионы и поместите их в чашку Петри с холодной PBS.
7. Отбирают эмбрионы по экспрессии GFP или других флуоресцентных белков под микроскопом.
8. После обезглавливания эмбрионов рассеките мозг⁶ под препарирующим микроскопом и держите его в холоде HBSS(+).
9. Расплавленный 3% агарозный гель низкой температуры плавления вылейте в криомолд (см. Таблицу материалов), а затем поместите в него мозги и прокатайте их несколько раз. Поместите его при комнатной температуре до полного застывания агарозы, а затем поместите на лед.
10. Коронально разрежьте мозг на толщину 350 мкм с помощью вибрирующего микротома (см. Таблицу материалов).
11. Расположите ломтики на фильтре (максимум 6 ломтиков на фильтр).
12. Извлеките питательную среду изнутри и снаружи фильтрующего стакана (всего 600 мкл). На этом этапе ломтики прижимаются и фиксируются на фильтре. Через 5 минут добавьте 100 мкл питательной среды внутрь вкладыша для клеточной культуры.

3. Покадровая съемка

1. Камеру для культивирования, установленную на предметном столике инвертированного лазерного сканирующего микроскопа, следует держать при температуре 37 °C с помощью нагревателя камеры или колпака, закрывающего микроскоп, не менее чем за 30 минут до получения изображения, чтобы предотвратить дрейф Z. Подайте увлажненный газ 5%_CO2 + 40%_O2 в камеру для культивирования.
2. Установите чашку для культуры с подготовленными выше ломтиками в камеру для культуры.
3. Используя 20-кратный объектив с большим рабочим расстоянием (NA = 0,45), получите около 10 изображений Z-стека с шагом 5 мкм каждые 15-30 минут в течение 24 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать моторизованный двухкоординатный стол. Это позволяет нам получать изображения из нескольких объективных полей. Как правило, в одном эксперименте с интервальной съемкой мы получаем 10-20 изображений с разных объективных полей.

4. Визуализирующий анализ

1. Преобразуйте изображения XYZT в XYT по максимальной проекции оси Z с помощью ImageJ или другого программного обеспечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если срезы скользили во время наблюдения, отрегулируйте положение ячеек внутри изображений с помощью StackRed, плагина ImageJ, с функцией трансформации твердого тела (см. Таблицу материалов).
2. Отслеживайте траекторию GFP- или других флуоресцентных белков-положительных клеток вручную или автоматически. Ручная и автоматическая трассировка может быть выполнена с помощью MTrackJ²⁴ и TrackMate ^25,26 (плагины ImageJ) соответственно. Автоматическая трассировка с помощью TrackMate эффективна для непредвзятого анализа большого количества ячеек. Тем не менее, ручная трассировка с помощью MTrackJ остается полезной для точного отслеживания отдельных ячеек.

Результаты

Радиальные глиальные клетки в паллиальном VZ продуцируют только нейроны до Е14, а также нейроны и глиальные клетки до Е15 и Е16. Чтобы наблюдать за миграционным поведением нейронов и глиальных клеток одновременно, мы пометили их усиленными GFP (EGFP) и RFP соответственно, используя нейрон-специф...

Обсуждение

Этот протокол представил метод покадрового наблюдения за клетками, полученными из паллиального (коркового) VZ. Для мечения мигрирующих клеток из VZ мы использовали внутриутробную электропорацию, при которой отдельные клетки были четко помечены с более высоким соотношением сигнал/?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.