Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Riepilogo

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Abstract

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Questo processo è fondamentale per il corretto funzionamento del cervello e la sua disregolazione può provocare disturbi dello sviluppo neurologico e psichiatrici dopo la nascita. Infatti, è stato scoperto che molti geni responsabili di queste malattie sono coinvolti in questo processo, e quindi, rivelare come queste mutazioni influenzano la dinamica cellulare è importante per comprendere la patogenesi di queste malattie. Questo protocollo introduce una tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni migratori e progenitori gliali in fette di cervello ottenute da embrioni di topo. Le cellule sono marcate con proteine fluorescenti utilizzando l'elettroporazione in utero , che visualizza le singole cellule che migrano dalla zona ventricolare con un alto rapporto segnale/rumore. Inoltre, questo sistema di trasferimento genico in vivo ci permette di eseguire facilmente esperimenti di guadagno o perdita di funzione su determinati geni mediante co-elettroporazione dei loro vettori di espressione o knockdown/knockout. Utilizzando questo protocollo, è possibile analizzare il comportamento migratorio e la velocità di migrazione delle singole cellule, informazioni che non vengono mai ottenute da cervelli fissi.

Introduzione

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, la glia radiale (apicale) nella zona ventricolare palliale (VZ) che riveste il ventricolo laterale produce prima neuroni e poi progenitori gliali con un periodo di sovrapposizione¹. I neuroni sono generati anche da progenitori intermedi o glia radiale basale nella zona subventricolare (SVZ) adiacente alla VZ, entrambi originati dalla glia radiale (apicale) ^2,3. Nei topi, le cellule gliali radiali producono solo neuroni nel giorno embrionale (E) 12-14, sia neuroni che progenitori gliali in E15-16 e progenitori gliali da E17 in poi

Protocollo

Il presente studio è stato condotto con l'approvazione e seguendo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto per la ricerca sullo sviluppo, del Centro per la disabilità dello sviluppo di Aichi (#2019-013) e dell'Università di Keio (A2021-030). Topi ICR (wild-type) gravidi temporizzati sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali). Per osservare la relazione tra le cellule in migrazione e i vasi sanguigni, sono stati utilizzati topi Flt1-DsRed, in cui le cellule endoteliali esprimono DsRed²². I topi maschi Flt1-DsRed sono stati incrociati con topi ICR femmine (entrambi i topi a....

Discussione

Questo protocollo ha introdotto un metodo per l'osservazione in time-lapse di cellule derivate dal VZ palliale (corticale). Per marcare le cellule in migrazione dal VZ, abbiamo utilizzato l'elettroporazione in utero, in cui le singole cellule sono state chiaramente marcate con un rapporto segnale/rumore più elevato rispetto alla marcatura mediata da vettori virali. Utilizzando l'elettroporazione in utero, qualsiasi tipo di vettore in qualsiasi combinazione può essere facilmente introdotto nelle cellul.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.