Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Riepilogo

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Abstract

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Questo processo è fondamentale per il corretto funzionamento del cervello e la sua disregolazione può provocare disturbi dello sviluppo neurologico e psichiatrici dopo la nascita. Infatti, è stato scoperto che molti geni responsabili di queste malattie sono coinvolti in questo processo, e quindi, rivelare come queste mutazioni influenzano la dinamica cellulare è importante per comprendere la patogenesi di queste malattie. Questo protocollo introduce una tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni migratori e progenitori gliali in fette di cervello ottenute da embrioni di topo. Le cellule sono marcate con proteine fluorescenti utilizzando l'elettroporazione in utero , che visualizza le singole cellule che migrano dalla zona ventricolare con un alto rapporto segnale/rumore. Inoltre, questo sistema di trasferimento genico in vivo ci permette di eseguire facilmente esperimenti di guadagno o perdita di funzione su determinati geni mediante co-elettroporazione dei loro vettori di espressione o knockdown/knockout. Utilizzando questo protocollo, è possibile analizzare il comportamento migratorio e la velocità di migrazione delle singole cellule, informazioni che non vengono mai ottenute da cervelli fissi.

Introduzione

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, la glia radiale (apicale) nella zona ventricolare palliale (VZ) che riveste il ventricolo laterale produce prima neuroni e poi progenitori gliali con un periodo di sovrapposizione¹. I neuroni sono generati anche da progenitori intermedi o glia radiale basale nella zona subventricolare (SVZ) adiacente alla VZ, entrambi originati dalla glia radiale (apicale) ^2,3. Nei topi, le cellule gliali radiali producono solo neuroni nel giorno embrionale (E) 12-14, sia neuroni che progenitori gliali in E15-16 e progenitori gliali da E17 in poi⁴. La maggior parte della popolazione di progenitori gliali generati durante questi stadi embrionali si differenzia preferenzialmente in astrociti, sebbene alcune cellule si differenzino anche in oligodendrociti⁵. I neuroni e i progenitori degli astrociti generati in queste fasi migrano verso la superficie cerebrale ed entrano nella placca corticale (futura materia grigia corticale). La migrazione neuronale dalla VZ alla placca corticale avviene in più fasi. I neuroni adottano inizialmente una morfologia multipolare appena sopra la zona di accumulo cellulare multipolare (MAZ), sovrapponendosi alla SVZ o zona intermedia, dove estendono e ritraggono vigorosamente più processi sottili e migrano lentamente (migrazione multipolare)^6,7. Dopo circa 24 ore, i neuroni si trasformano in una morfologia bipolare, estendendo un processo di guida spesso verso la superficie cerebrale e un processo di trascinamento sottile all'indietro, e migrano linearmente verso la superficie cerebrale utilizzando un processo radiale che si estende dalla glia radiale alla superficie piale come un'impalcatura, che è chiamata modalità di locomozione ^2,8. Poiché i neuroni in modalità locomozione raggiungono sempre la superficie più esterna della placca corticale, passando attraverso i loro predecessori appena sotto la zona marginale, i neuroni sono allineati in modo dipendente dalla data di nascita dall'interno verso l'esterno nella placca corticale ^9,10,11.

Al contrario, i progenitori degli astrociti migrano rapidamente verso la zona intermedia e la placca corticale, con frequenti cambiamenti direzionali. Questo comportamento migratorio è completamente diverso dalla migrazione neuronale ed è chiamato migrazione erratica⁵. I progenitori degli astrociti migrano anche lungo i vasi sanguigni in un processo chiamato migrazione guidata dai vasi sanguigni. I progenitori degli astrociti passano da una modalità di migrazione all'altra e raggiungono la placca corticale ^5,12. Sebbene il posizionamento degli astrociti non sia strettamente determinato dalla loro data di produzione, è stata osservata una lieve tendenza degli astrociti precoci a stabilirsi nella parte superficiale della placca corticale⁵. È interessante notare che gli astrociti che si depositano nella placca corticale sono generati in stadi embrionali e alla fine si differenziano in astrociti protoplasmatici, mentre gli astrociti generati postnatale non migrano attivamente, rimangono nella sostanza bianca e si differenziano in astrociti fibrosi⁵. Come si verifichi questa specificazione stadio-dipendente dei sottotipi astrocitici rimane poco chiaro.

È stato identificato un numero crescente di geni coinvolti nella migrazione neuronale, compresi quelli coinvolti nei disturbi dello sviluppo neurologico e psichiatrici^13,14. Pertanto, è fondamentale chiarire gli effetti delle mutazioni in questi geni sul comportamento dei neuroni migratori. Come accennato in precedenza, la migrazione neuronale avviene in più fasi. Le osservazioni time-lapse possono determinare direttamente la fase che viene maggiormente interessata (uscita dal ciclo cellulare, transizione multipolare-bipolare, velocità di migrazione della locomozione, ecc.). Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base della specificazione, della migrazione e del posizionamento degli astrociti rimangono in gran parte sconosciuti. Dato che gli astrociti svolgono un ruolo cruciale nella sinaptogenesi¹⁵ e nella formazione della barriera emato-encefalica durante lo sviluppo del cervello¹⁶, i difetti di sviluppo negli astrociti possono causare disturbi dello sviluppo neurologico. Studi time-lapse sui progenitori degli astrociti possono chiarire questi meccanismi molecolari e la loro relazione con la malattia mentale.

Questo protocollo fornisce un metodo per l'osservazione in time-lapse di cellule corticali derivate da VZ. Un protocollo video simile per l'osservazione della migrazione neuronale è già stato pubblicato¹⁷. Qui, descriviamo il metodo sia per i neuroni migratori che per i progenitori degli astrociti. Per marcare queste cellule con proteine fluorescenti, come le proteine fluorescenti verdi e rosse (GFP e RFP), miscele plasmidi contenenti componenti appropriati vengono introdotte nella VZ corticale mediante elettroporazione in utero agli stadi appropriati 18,19,20,21. Gli embrioni manipolati vengono rimossi nelle fasi desiderate e i cervelli vengono affettati e utilizzati per osservazioni time-lapse utilizzando un microscopio a scansione laser. La velocità di migrazione, la direzione e altri comportamenti, che non vengono mai affrontati utilizzando campioni di cervello fissi, possono essere esaminati utilizzando questo metodo. Utilizzando l'elettroporazione in utero, l'espressione e i vettori knockdown/knockout possono essere facilmente trasferiti in concomitanza con vettori proteici fluorescenti, consentendoci di condurre studi di guadagno di funzione e perdita di funzione di geni specifici.

Protocollo

Il presente studio è stato condotto con l'approvazione e seguendo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto per la ricerca sullo sviluppo, del Centro per la disabilità dello sviluppo di Aichi (#2019-013) e dell'Università di Keio (A2021-030). Topi ICR (wild-type) gravidi temporizzati sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali). Per osservare la relazione tra le cellule in migrazione e i vasi sanguigni, sono stati utilizzati topi Flt1-DsRed, in cui le cellule endoteliali esprimono DsRed²². I topi maschi Flt1-DsRed sono stati incrociati con topi ICR femmine (entrambi i topi avevano un'età compresa tra 8 e 24 settimane). Tutti gli animali sono stati alloggiati e manipolati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) fino al campionamento. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Elettroporazione in utero

1. Preparare una soluzione salina tamponata HEPES (HBS) aggiungendo un volume uguale di acqua sterilizzata in autoclave a 2x HBS disponibile in commercio.
2. Ci sono due opzioni di anestetici; isoflurano (inalazione) e MMB (iniezione). Nel caso di utilizzo di MMB, prepararlo come segue. Aggiungere 0,75 mL di medetomidina (1 mg/mL), 2 mL di midazolam (5 mg/mL) e 2,5 mL di butorfanolo (5 mg/mL) in 19,75 mL di acqua autoclavata²³.
   NOTA: Questa soluzione anestetica diventa meno attiva entro 2 mesi. Conservare a 4 °C con schermo antiluce.
3. Preparare la soluzione di atipamezolo. Diluire 0,75 mL di atipamezolo (5 mg/mL) con 24,25 mL di acqua autoclavata.
4. Preparare la soluzione Fast Green allo 0,2% (p/v) in acqua sterilizzata in autoclave. Sterilizzare con un filtro (dimensione dei pori 0,22 μm).
5. Preparare il plasmide utilizzando un kit di purificazione del plasmide convenzionale basato sulla lisi alcalina e sulla purificazione della colonna²³ secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Sciogliere il plasmide purificato da 100 mL di coltura batterica in 30-50 μL di HBS per preparare lo stock plasmidico (3-5 μg/μL) (File supplementare 1).
   1. Mescolare e diluire le scorte plasmidiche con HBS e aggiungere 1/10 di volume di Fast Green allo 0,2% per colorare l'iniettore. I componenti e le concentrazioni finali dei plasmidi sono determinati in base al loro scopo (Tabella 1).
6. Realizzare le micropipette tirando i capillari di vetro utilizzando un estrattore per pipette.
   NOTA: La punta della pipetta viene tagliata obliquamente utilizzando una pinza fine. Il diametro esterno della punta è di circa 70 μm. Marcare le micropipette a intervalli di 2 μl aspirando 2 μl di acqua.
7. Iniettare l'anestetico MMB alla dose di 10 μL/g di peso corporeo per via intraperitoneale in un topo gravido in una fase appropriata (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente).
   NOTA: Gli stadi embrionali da manipolare devono essere determinati in base allo scopo. Per etichettare i futuri neuroni piramidali II/III, E14.5 è adatto. Per marcare i progenitori gliali, l'elettroporazione deve essere eseguita su E15-16. In alternativa, i topi possono essere anestetizzati mediante inalazione di isoflurano (1%-2%).
8. Dopo che il topo è stato profondamente anestetizzato, posizionarlo su un piatto caldo a 38 °C.
   NOTA: Assicurarsi che il mouse non risponda quando si pizzica la coda.
9. Dopo aver rimosso il pelo intorno al sito chirurgico utilizzando una crema depilatoria, disinfettare più volte l'area chirurgica con movimenti circolari sia con uno scrub a base di iodio che con alcol al 70%. Praticare un'incisione cutanea lunga 2 cm lungo la linea mediana dal livello del 2° paio di capezzoli^{più posteriori} anteriormente, seguita da un'incisione della linea mediana di 2 cm nella parete addominale lungo la linea alba (Figura 1A).
   NOTA: Nel processo di incisione nella parete addominale, sollevarla leggermente con una pinza fine per non tagliare gli organi interni.
10. Posizionare un foglio di plastica sterile sulla pelle e un pezzo di carta velina sterile su di esso (Figura 1A). Creare un foro al centro per esporre l'area chirurgica.
    NOTA: Il foglio di plastica sterile e la carta velina sterile vengono posizionati dopo aver effettuato l'incisione perché è necessario un ampio campo visivo per posizionare l'incisione facendo riferimento alla posizione dei capezzoli.
11. Bagnare la carta con PBS sterile, osservare attentamente le corna uterine dall'incisione ed estrarre le corna uterine attraverso i fori del foglio di plastica e della carta.
12. Utilizzando una micropipetta collegata a un tubo di aspirazione, iniettare 1 μl della miscela plasmidica nel ventricolo laterale sinistro o destro attraverso la parete uterina mediante pressione espiratoria (Figura 1A).
    NOTA: In alternativa, il plasmide può essere iniettato utilizzando un microiniettore.
13. Pizzicare la testa dell'embrione con un elettrodo a pinzetta e applicare impulsi elettronici utilizzando un elettroporatore (35 V per E14-16, 50 V per E17, impulsi quadrati di 50 ms con intervalli di 450 ms, 5 volte) (Figura 1A).
    NOTA: Non pizzicare con forza la testa degli embrioni, che danneggerebbe gli embrioni. La corrente effettiva dovrebbe essere di 40-70 mA.
14. Riposizionare il corno uterino nella cavità addominale.
15. Sutura la parete addominale utilizzando un filo di seta 5-0.
16. Applicare la soluzione di atipamezolo alla dose di 10 μL/g di peso corporeo per via intraperitoneale.
17. Sutura la pelle con un filo di seta 5-0.
    NOTA: La pelle può essere chiusa utilizzando un autoclip.
18. Tenere i mouse manipolati su una piastra calda per almeno 30 minuti. I topi inizieranno a muoversi nella gabbia.
    NOTA: La procedura di elettroporazione in utero (dai passaggi 1.7 a 1.16) deve essere eseguita entro 30 minuti. Il tempo di funzionamento tipico è di 20 minuti.

2. Preparazione delle fette

NOTA: La freschezza delle fette è la chiave del successo di questo esperimento. Le fette devono essere preparate (dai passaggi 2.5-2.12) entro 2 h.

1. Preparare la soluzione salina bilanciata di Hanks con Ca²⁺ e Mg²⁺; HBSS(+). Aggiungere 5 mL di CaCl₂ (14 g/L, sterilizzato in autoclave) e 5 mL di MgSO 4.7H₂O (20 g/L, sterilizzato in autoclave) a 500 mL di HBSS(-). Conservare a 4 °C. Far bollire la soluzione con gas 95% O₂ + 5% CO₂ per 5 minuti su ghiaccio prima dell'uso.
2. Preparare il terreno di coltura. Sono necessari almeno 2,5 ml/piatto. Aggiungere 2 ml di siero fetale bovino, 25 μl di L-glutammina (200 mM), 200 μl di B27 (50x), 50 μl di penicillina + streptomicina (10 K unità/mL e 10 mg/mL) a 8 mL di terreno neurobasale.
3. Preparare il gel di agarosio a bassa temperatura di fusione al 3%. Porare 50 mL di HBSS(+), quindi aggiungere 1,5 mg di agarosio a bassa temperatura di fusione e sterilizzarlo in autoclave. Sciogliere l'agarosio in un forno a microonde e mantenerlo a 50 °C in un'incubatrice a bagnomaria prima dell'uso.
4. Aggiungere 1,9 ml di terreno di coltura in un piatto di base in vetro. Applicare con cura un inserto per colture cellulari per non intrappolare i bulbi d'aria sotto il filtro, quindi aggiungere 500 μl di terreno di coltura sul filtro (Figura 1B). Mettilo sul ghiaccio.
5. Dopo aver anestetizzato i topi manipolati mediante inalazione di isoflurano al 5%, sacrificarli mediante lussazione cervicale (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) nelle fasi appropriate da osservare.
   NOTA: Due giorni (48 h) e 3 giorni dopo l'elettroporazione a E14.5 sono adatti per osservare rispettivamente la transizione multipolare-bipolare e la modalità di locomozione.
6. Estrarre gli embrioni e metterli in una capsula di Petri con PBS freddo.
7. Selezionare gli embrioni mediante l'espressione di GFP o altre proteine fluorescenti al microscopio.
8. Dopo la decapitazione degli embrioni, sezionare i cervelli⁶ al microscopio da dissezione e tenerli in HBSS (+) freddo.
9. Versare il gel di agarosio fuso al 3% a bassa temperatura di fusione in un criomold (vedi Tabella dei materiali), quindi inserire i cervelli e arrotolarli più volte. Mettetelo a temperatura ambiente fino a quando l'agarosio non si sarà completamente solidificato, quindi mettetelo sul ghiaccio.
10. Affettare il cervello coronalmente allo spessore di 350 μm utilizzando un microtomo vibrante (vedi Tabella dei materiali).
11. Disporre le fette sul filtro (massimo 6 fette per filtro).
12. Estrarre il terreno di coltura dall'interno e dall'esterno della coppa del filtro (600 μl in totale). In questa fase, le fette vengono pressate e fissate su un filtro. Dopo 5 minuti, aggiungere 100 μL di terreno di coltura all'interno dell'inserto di coltura cellulare.

3. Imaging time-lapse

1. Mantenere la camera di coltura montata sul tavolino di un microscopio a scansione laser invertita a 37 °C utilizzando il riscaldatore della camera o una cappa che racchiude il microscopio almeno 30 minuti prima dell'imaging per evitare la deriva Z. Fornire gas umidificato al 5% di CO₂ + 40% di O₂ alla camera di coltura.
2. Posizionare il piatto di coltura con le fette preparate sopra nella camera di coltura.
3. Utilizzando un obiettivo 20x a lunga distanza di lavoro (NA = 0,45), acquisisci circa 10 immagini Z-stack con incrementi di 5 μm ogni 15-30 minuti per 24 ore.
   NOTA: Si consiglia vivamente l'uso di uno stadio XY motorizzato. Questo ci permette di ottenere immagini da più campi oggettivi. Tipicamente, otteniamo 10-20 immagini da diversi campi oggettivi in un esperimento time-lapse.

4. Analisi di imaging

1. Converti le immagini XYZT in XYT con la massima proiezione dell'asse Z utilizzando ImageJ o altri software.
   NOTA: Se le fette sono scivolate durante l'osservazione, regolare la posizione delle celle all'interno delle immagini utilizzando StackRed, un plug-in di ImageJ, con la sua funzione di trasformazione del corpo rigido (vedi Tabella dei materiali).
2. Tracciare la traiettoria delle cellule GFP- o di altre cellule fluorescenti positive alle proteine, manualmente o automaticamente. Il tracciamento manuale e automatico può essere eseguito utilizzando rispettivamente MTrackJ²⁴ e TrackMate ^25,26 (plug-in ImageJ). Il tracciamento automatico con TrackMate è efficiente per analizzare molte celle in modo imparziale. Tuttavia, il tracciamento manuale con MTrackJ rimane utile per il tracciamento accurato delle singole cellule.

Risultati

Le cellule gliali radiali nel VZ palliale producono solo neuroni fino a E14, e sia i neuroni che le cellule gliali a E15 ed E16. Per osservare contemporaneamente i comportamenti migratori dei neuroni e delle cellule gliali, li abbiamo marcati con GFP potenziata (EGFP) e RFP, rispettivamente, utilizzando un promotore neurone-specifico, il promotore Tα1²⁷ e il promotore²⁸ della proteina acida fibrillare gliale umana (hGFAP), che è preferenzialmente attivato negli a...

Discussione

Questo protocollo ha introdotto un metodo per l'osservazione in time-lapse di cellule derivate dal VZ palliale (corticale). Per marcare le cellule in migrazione dal VZ, abbiamo utilizzato l'elettroporazione in utero, in cui le singole cellule sono state chiaramente marcate con un rapporto segnale/rumore più elevato rispetto alla marcatura mediata da vettori virali. Utilizzando l'elettroporazione in utero, qualsiasi tipo di vettore in qualsiasi combinazione può essere facilmente introdotto nelle cellul...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.