Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Zusammenfassung

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zusammenfassung

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Dieser Prozess ist entscheidend für die ordnungsgemäße Funktion des Gehirns, und seine Fehlregulation kann zu neurologischen Entwicklungsstörungen und psychiatrischen Störungen nach der Geburt führen. Tatsächlich wurde festgestellt, dass viele Gene, die für diese Krankheiten verantwortlich sind, an diesem Prozess beteiligt sind, und daher ist es wichtig zu zeigen, wie diese Mutationen die zelluläre Dynamik beeinflussen, um die Pathogenese dieser Krankheiten zu verstehen. Dieses Protokoll stellt eine Technik zur Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in Hirnschnitten vor, die aus Mausembryonen gewonnen wurden. Die Zellen werden mit fluoreszierenden Proteinen mittels In-utero-Elektroporation markiert, die die Migration einzelner Zellen aus der ventrikulären Zone mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis visualisiert. Darüber hinaus ermöglicht uns dieses in vivo Gentransfersystem die einfache Durchführung von Gain-of-Function- oder Gain-of-Function-Experimenten an den gegebenen Genen durch Co-Elektroporation ihrer Expressions- oder Knockdown/Knockout-Vektoren. Mit diesem Protokoll können das Migrationsverhalten und die Migrationsgeschwindigkeit einzelner Zellen analysiert werden, Informationen, die niemals von festen Gehirnen gewonnen werden.

Einleitung

Während der Entwicklung der Großhirnrinde produzieren die (apikalen) radialen Gliazellen in der pallidialen ventrikulären Zone (VZ), die den lateralen Ventrikel auskleiden, zuerst Neuronen und dann gliale Vorläuferzellen mit einer gewissen Überlappung der Periode¹. Neuronen werden auch aus intermediären Vorläuferzellen oder basalen radialen Gliazellen in der an die VZ angrenzenden subventrikulären Zone (SVZ) erzeugt, die beide aus den (apikalen) radialen Gliazellen stammen ^2,3. Bei Mäusen produzieren radiale Gliazellen nur Neuronen am Embryonaltag (E) 12-14, sowohl Neuronen als auch gli....

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde mit Genehmigung und gemäß den Richtlinien des Animal Care and Use Committee des Institute for Developmental Research, des Aichi Developmental Disability Center (#2019-013) und der Keio University (A2021-030) durchgeführt. Zeitlich trächtige ICR-Mäuse (Wildtyp) wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle). Um den Zusammenhang zwischen wandernden Zellen und Blutgefäßen zu beobachten, wurden Flt1-DsRed-Mäuse verwendet, bei denen die Endothelzellen DsRed²² exprimieren. Männliche Flt1-DsRed-Mäuse wurden mit weiblichen ICR-Mäusen gekreuzt (beide Mäuse waren im Alter von 8-24 Wochen). Alle Tiere wur....

Diskussion

Mit diesem Protokoll wurde eine Methode zur Zeitrafferbeobachtung von Zellen eingeführt, die von der pallialen (kortikalen) VZ abstammen. Um die migrierenden Zellen aus der VZ zu markieren, verwendeten wir die in utero-Elektroporation, bei der einzelne Zellen eindeutig mit einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis markiert wurden als bei der viralen Vektor-vermittelten Markierung. Mit Hilfe der In-utero-Elektroporation kann jede Art von Vektor in beliebiger Kombination leicht in die radialen Gliazellen .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.