Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Zusammenfassung

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zusammenfassung

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Dieser Prozess ist entscheidend für die ordnungsgemäße Funktion des Gehirns, und seine Fehlregulation kann zu neurologischen Entwicklungsstörungen und psychiatrischen Störungen nach der Geburt führen. Tatsächlich wurde festgestellt, dass viele Gene, die für diese Krankheiten verantwortlich sind, an diesem Prozess beteiligt sind, und daher ist es wichtig zu zeigen, wie diese Mutationen die zelluläre Dynamik beeinflussen, um die Pathogenese dieser Krankheiten zu verstehen. Dieses Protokoll stellt eine Technik zur Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in Hirnschnitten vor, die aus Mausembryonen gewonnen wurden. Die Zellen werden mit fluoreszierenden Proteinen mittels In-utero-Elektroporation markiert, die die Migration einzelner Zellen aus der ventrikulären Zone mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis visualisiert. Darüber hinaus ermöglicht uns dieses in vivo Gentransfersystem die einfache Durchführung von Gain-of-Function- oder Gain-of-Function-Experimenten an den gegebenen Genen durch Co-Elektroporation ihrer Expressions- oder Knockdown/Knockout-Vektoren. Mit diesem Protokoll können das Migrationsverhalten und die Migrationsgeschwindigkeit einzelner Zellen analysiert werden, Informationen, die niemals von festen Gehirnen gewonnen werden.

Einleitung

Während der Entwicklung der Großhirnrinde produzieren die (apikalen) radialen Gliazellen in der pallidialen ventrikulären Zone (VZ), die den lateralen Ventrikel auskleiden, zuerst Neuronen und dann gliale Vorläuferzellen mit einer gewissen Überlappung der Periode¹. Neuronen werden auch aus intermediären Vorläuferzellen oder basalen radialen Gliazellen in der an die VZ angrenzenden subventrikulären Zone (SVZ) erzeugt, die beide aus den (apikalen) radialen Gliazellen stammen ^2,3. Bei Mäusen produzieren radiale Gliazellen nur Neuronen am Embryonaltag (E) 12-14, sowohl Neuronen als auch gliale Vorläuferzellen an E15-16 und gliale Vorläuferzellen ab E17⁴. Die Hauptpopulation von Gliavorläuferzellen, die in diesen embryonalen Stadien erzeugt werden, differenziert sich bevorzugt in Astrozyten, obwohl sich einige Zellen auch in Oligodendrozyten differenzieren⁵. Neuronen und Astrozyten-Vorläuferzellen, die in diesen Stadien gebildet werden, wandern zur Gehirnoberfläche und gelangen in die kortikale Platte (zukünftige kortikale graue Substanz). Die neuronale Migration von der VZ zur kortikalen Platte erfolgt in mehreren Phasen. Neuronen nehmen zunächst eine multipolare Morphologie knapp über der multipolaren Zellakkumulationszone (MAZ) an, die die SVZ oder Zwischenzone überlappt, wo sie mehrere dünne Prozesse kräftig aus- und zurückziehen und langsam wandern (multipolare Migration)^6,7. Nach etwa 24 Stunden verwandeln sich die Neuronen in eine bipolare Morphologie, die einen dicken Führungsfortsatz zur Gehirnoberfläche und einen dünnen Nachlauffortsatz nach hinten verlängert und linear zur Hirnoberfläche wandert, wobei ein radialer Prozess verwendet wird, der sich von der radialen Gliazelle bis zur Pialoberfläche als Gerüst erstreckt und als Lokomotionsmodus^{bezeichnet wird 2,8}. Da Neuronen im Fortbewegungsmodus immer die äußerste Oberfläche der kortikalen Platte erreichen und ihre Vorgänger knapp unterhalb der Marginalzone durchlaufen, sind die Neuronen in der kortikalen Platte ^9,10,11 geburtsdatumsabhängig von innen nach außen ausgerichtet.

Im Gegensatz dazu wandern Astrozyten-Vorläuferzellen schnell in die Zwischenzone und die kortikale Platte, mit häufigen Richtungswechseln. Dieses Migrationsverhalten unterscheidet sich grundlegend von der neuronalen Migration und wird als unregelmäßige Migration^{bezeichnet 5}. Astrozyten-Vorläuferzellen wandern auch entlang der Blutgefäße, in einem Prozess, der als blutgefäßgesteuerte Migration bezeichnet wird. Astrozyten-Vorläuferzellen wechseln zwischen diesen Migrationsmodi und erreichen die kortikale Platte ^5,12. Obwohl die Positionierung von Astrozyten nicht streng durch ihr Entstehungsdatum bestimmt ist, wurde eine leichte Tendenz bei frühgeborenen Astrozyten beobachtet, sich im oberflächlichen Teil der kortikalen Platte^{anzusiedeln 5}. Interessanterweise werden Astrozyten, die sich in der kortikalen Platte ansiedeln, in embryonalen Stadien erzeugt und differenzieren sich schließlich zu protoplasmatischen Astrozyten, während postnatal erzeugte Astrozyten nicht aktiv wandern, in der weißen Substanz verbleiben und sich in fibröse Astrozyten differenzieren⁵. Wie diese stadienabhängige Spezifizierung astrozytärer Subtypen zustande kommt, bleibt unklar.

Eine wachsende Anzahl von Genen, die an der neuronalen Migration beteiligt sind, wurde identifiziert, einschließlich solcher, die an neurologischen Entwicklungsstörungen und psychiatrischen Störungen beteiligt sind^13,14. Daher ist es wichtig, die Auswirkungen von Mutationen in diesen Genen auf das Verhalten migrierender Neuronen aufzuklären. Wie bereits erwähnt, verläuft die neuronale Migration in mehreren Phasen. Zeitrafferbeobachtungen können direkt bestimmen, welche Phase hauptsächlich betroffen ist (Zellzyklusaustritt, multipolar-bipolarer Übergang, Migrationsgeschwindigkeit der Fortbewegung, etc.). Die molekularen Mechanismen, die der Spezifizierung, Migration und Positionierung von Astrozyten zugrunde liegen, sind jedoch weitgehend unbekannt. Angesichts der Tatsache, dass Astrozyten eine entscheidende Rolle bei der Synaptogenese¹⁵ und der Bildung der Blut-Hirn-Schranke während der Gehirnentwicklung spielen¹⁶, können Entwicklungsdefekte in Astrozyten zu neurologischen Entwicklungsstörungen führen. Zeitrafferstudien an Astrozyten-Vorläuferzellen können diese molekularen Mechanismen und ihre Beziehung zu psychischen Erkrankungen klären.

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Zeitrafferbeobachtung von kortikalen VZ-abgeleiteten Zellen. Ein ähnliches Videoprotokoll zur Beobachtung der neuronalen Migration wurde bereits veröffentlicht¹⁷. Hier beschreiben wir die Methode sowohl für die Migration von Neuronen als auch für Astrozyten-Vorläuferzellen. Um diese Zellen mit fluoreszierenden Proteinen, wie z. B. grün und rot fluoreszierenden Proteinen (GFP und RFP), zu markieren, werden Plasmidgemische, die geeignete Komponenten enthalten, durch In-utero-Elektroporation in den entsprechenden Stadien 18,19,20,21 in die kortikale VZ eingebracht. Die manipulierten Embryonen werden in den gewünschten Stadien entnommen, die Gehirne werden in Scheiben geschnitten und für Zeitrafferbeobachtungen mit einem Laser-Scanning-Mikroskop verwendet. Die Migrationsgeschwindigkeit, -richtung und andere Verhaltensweisen, die niemals mit festen Gehirnproben behandelt werden, können mit dieser Methode untersucht werden. Durch die Verwendung von In-utero-Elektroporation können Expressions- und Knockdown-/Knockout-Vektoren leicht gleichzeitig mit fluoreszierenden Proteinvektoren übertragen werden, was es uns ermöglicht, Funktionsgewinn- und Funktionsverluststudien spezifischer Gene durchzuführen.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde mit Genehmigung und gemäß den Richtlinien des Animal Care and Use Committee des Institute for Developmental Research, des Aichi Developmental Disability Center (#2019-013) und der Keio University (A2021-030) durchgeführt. Zeitlich trächtige ICR-Mäuse (Wildtyp) wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle). Um den Zusammenhang zwischen wandernden Zellen und Blutgefäßen zu beobachten, wurden Flt1-DsRed-Mäuse verwendet, bei denen die Endothelzellen DsRed²² exprimieren. Männliche Flt1-DsRed-Mäuse wurden mit weiblichen ICR-Mäusen gekreuzt (beide Mäuse waren im Alter von 8-24 Wochen). Alle Tiere wurden bis zur Probenahme unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen untergebracht und manipuliert. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. In-utero-Elektroporation

1. Bereiten Sie HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBS) vor, indem Sie ein gleiches Volumen autoklaviertes Wasser zu handelsüblichen 2x HBS hinzufügen.
2. Es gibt zwei Möglichkeiten der Anästhesie; Isofluran (Inhalation) und MMB (Injektion). Wenn Sie MMB verwenden, bereiten Sie es wie folgt vor. Fügen Sie 0,75 ml Medetomidin (1 mg/ml), 2 ml Midazolam (5 mg/ml) und 2,5 ml Butorphanol (5 mg/ml) in 19,75 ml autoklaviertem Wasser^{hinzu 23}.
   HINWEIS: Diese Anästhesielösung wird innerhalb von 2 Monaten weniger aktiv. Bei 4 °C mit Lichtschutz lagern.
3. Bereiten Sie Atipamezol-Lösung vor. Verdünnen Sie 0,75 ml Atipamezol (5 mg/ml) mit 24,25 ml autoklaviertem Wasser.
4. Bereiten Sie 0,2 % (w/v) Fast Green Lösung in autoklaviertem Wasser vor. Mit einem Filter (Porengröße 0,22 μm) sterilisieren.
5. Das Plasmid ist unter Verwendung eines herkömmlichen Plasmidaufreinigungskits auf der Grundlage der alkalischen Lyse und der Säulenaufreinigung²³ gemäß den Anweisungen des Herstellers herzustellen (siehe Materialtabelle). Das gereinigte Plasmid aus 100 mL Bakterienkultur wird in 30-50 μl HBS gelöst, um den Plasmidbestand (3-5 μg/μL) herzustellen (Ergänzende Datei 1).
   1. Mischen und verdünnen Sie die Plasmidbestände mit HBS und fügen Sie 1/10 Volumen von 0,2 % Fast Green hinzu, um das Injektor zu färben. Die Bestandteile und Endkonzentrationen der Plasmide werden entsprechend ihrem Verwendungszweck bestimmt (Tabelle 1).
6. Stellen Sie die Mikropipetten her, indem Sie mit einem Pipettenabzieher an den Glaskapillaren ziehen.
   HINWEIS: Die Spitze der Pipette wird mit einer feinen Pinzette schräg abgeschnitten. Der Außendurchmesser der Spitze beträgt ca. 70 μm. Markieren Sie die Mikropipetten im Abstand von 2 μL, indem Sie 2 μl Wasser ansaugen.
7. Injizieren Sie einer trächtigen Maus zu einem geeigneten Zeitpunkt (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen) ein MMB-Anästhetikum in einer Dosis von 10 μl/g Körpergewicht intraperitoneal.
   HINWEIS: Die zu manipulierenden Embryonalstadien sollten je nach Verwendungszweck bestimmt werden. Um zukünftige II/III-Pyramidenneuronen zu markieren, eignet sich E14.5. Zur Markierung von Gliavorläuferzellen muss eine Elektroporation an E15-16 durchgeführt werden. Alternativ können die Mäuse durch Inhalation von Isofluran (1%-2%) betäubt werden.
8. Nachdem die Maus tief betäubt wurde, legen Sie sie auf eine warme Platte bei 38 °C.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht auf das Einklemmen des Schwanzes reagiert.
9. Nach der Entfernung des Fells um die Operationsstelle mit Enthaarungscreme desinfizieren Sie das Operationsgebiet mehrmals in kreisenden Bewegungen sowohl mit einem Peeling auf Jodbasis als auch mit 70% Alkohol. Machen Sie einen 2 cm langen Hautschnitt entlang der Mittellinie von der Höhe des^{zweithintersten} Brustwarzenpaares nach vorne, gefolgt von einem 2 cm langen Schnitt in der Bauchdecke entlang der Linea alba (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Heben Sie die Bauchdecke beim Schnitt mit einer feinen Zange leicht an, um die inneren Organe nicht zu durchtrennen.
10. Legen Sie eine sterile Plastikfolie auf die Haut und ein Stück steriles Seidenpapier darauf (Abbildung 1A). Erstellen Sie ein Loch in der Mitte, um den Operationsbereich freizulegen.
    HINWEIS: Die sterile Plastikfolie und das sterile Seidenpapier werden nach dem Schnitt platziert, da ein weites Sichtfeld erforderlich ist, um den Schnitt in Bezug auf die Position der Brustwarzen zu positionieren.
11. Befeuchten Sie das Papier mit sterilem PBS, beobachten Sie vorsichtig die Gebärmutterhörner vom Schnitt an und ziehen Sie das Gebärmutterhorn durch die Löcher der Plastikfolie und des Papiers heraus.
12. Injizieren Sie mit einer Mikropipette, die an einer Aspiratorröhrchenanordnung befestigt ist, 1 μl der Plasmidmischung durch exspiratorischen Druck durch die Gebärmutterwand in den linken oder rechten Seitenventrikel (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Alternativ kann das Plasmid mit einem Mikroinjektor injiziert werden.
13. Kneifen Sie den Kopf des Embryos mit einer Pinzettenelektrode zusammen und legen Sie elektronische Impulse mit einem Elektroporator an (35 V für E14-16, 50 V für E17, 50 ms Rechteckimpulse im Abstand von 450 ms, 5 Mal) (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Kneifen Sie den Kopf der Embryonen nicht stark ein, da dies die Embryonen beschädigen würde. Der tatsächliche Strom sollte 40-70 mA betragen.
14. Setzen Sie das Gebärmutterhorn wieder in die Bauchhöhle ein.
15. Nähen Sie die Bauchdecke mit einem 5-0 Seidenfaden.
16. Tragen Sie Atipamezol-Lösung in einer Dosis von 10 μl/g Körpergewicht intraperitoneal auf.
17. Nähen Sie die Haut mit einem 5-0 Seidenfaden.
    HINWEIS: Die Haut kann mit einem Autoclip geschlossen werden.
18. Halten Sie die manipulierten Mäuse mindestens 30 Minuten lang auf einer warmen Platte. Die Mäuse beginnen sich im Käfig zu bewegen.
    HINWEIS: Das Verfahren der In-utero-Elektroporation (von den Schritten 1.7 bis 1.16) sollte innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden. Die typische Betriebszeit beträgt 20 Minuten.

2. Vorbereitung der Scheiben

HINWEIS: Die Frische der Scheiben ist der Schlüssel zum Erfolg dieses Experiments. Die Scheiben müssen innerhalb von 2 h (aus den Schritten 2.5-2.12) vorbereitet werden.

1. Bereiten Sie die ausgewogene Salzlösung der Hanks mit Ca²⁺ und Mg²⁺ zu; HBSS(+). 5 mL CaCl₂ (14 g/L, autoklaviert) und 5 mL MgSO 4,7H₂O (20 g/L, autoklaviert) zu 500 mL HBSS(-) hinzufügen. Bei 4 °C lagern. Die Lösung vor Gebrauch 5 min lang mit 95 %_O2 + 5 % CO₂ -Gas auf Eis sprudeln.
2. Bereiten Sie das Nährmedium vor. Es werden mindestens 2,5 ml/Schale benötigt. Fügen Sie 2 ml fötales Rinderserum, 25 μl L-Glutamin (200 mM), 200 μl B27 (50x), 50 μl Penicillin + Streptomycin (10 K Einheiten/ml und 10 mg/ml) zu 8 ml Neurobasalmedium hinzu.
3. Bereiten Sie Agarosegel mit 3 % niedriger Schmelztemperatur vor. Porieren Sie 50 mL HBSS(+), fügen Sie dann 1,5 mg Agarose bei niedriger Schmelztemperatur hinzu und autoklavieren Sie es. Die Agarose in der Mikrowelle schmelzen und vor der Verwendung bei 50 °C in einem Wasserbad-Inkubator aufbewahren.
4. Geben Sie 1,9 ml Nährmedium in eine Glasbodenschale. Setzen Sie vorsichtig einen Zellkultureinsatz darauf auf, um Luftkolben nicht unter dem Filter einzuschließen, und geben Sie dann 500 μl Kulturmedium auf den Filter (Abbildung 1B). Lege es auf Eis.
5. Nach der Betäubung der manipulierten Mäuse durch Inhalation von 5% Isofluran werden sie durch Zervixluxation (nach institutionell anerkannten Protokollen) in geeigneten Stadien getötet, um sie zu beobachten.
   HINWEIS: Zwei Tage (48 h) bzw. 3 Tage nach der Elektroporation bei E14,5 sind für die Beobachtung des multipolar-bipolaren Übergangs bzw. des Fortbewegungsmodus geeignet.
6. Nehmen Sie die Embryonen heraus und legen Sie sie in eine Petrischale mit kaltem PBS.
7. Selektieren Sie die Embryonen durch die Expression von GFP oder anderen fluoreszierenden Proteinen unter einem Mikroskop.
8. Nach der Enthauptung der Embryonen wird das Gehirn⁶ unter einem Präpariermikroskop präpariert und in kaltem HBSS(+) aufbewahrt.
9. Gießen Sie das geschmolzene Agarosegel mit einer niedrigen Schmelztemperatur von 3 % in ein Kryomold (siehe Materialtabelle), legen Sie dann die Gehirne hinein und rollen Sie sie mehrmals. Stelle es bei Raumtemperatur auf, bis die Agarose vollständig fest geworden ist, und lege es dann auf Eis.
10. Schneiden Sie das Gehirn mit einem vibrierenden Mikrotom in einer Dicke von 350 μm koronal auf (siehe Materialtabelle).
11. Ordnen Sie die Scheiben auf dem Filter an (maximal 6 Scheiben pro Filter).
12. Ziehen Sie das Nährmedium von der Innen- und Außenseite des Filterbechers (insgesamt 600 μl) heraus. In diesem Schritt werden die Scheiben gepresst und auf einem Filter fixiert. Geben Sie nach 5 Minuten 100 μl Kulturmedium in die Innenseite des Zellkultureinsatzes.

3. Zeitraffer-Bildgebung

1. Halten Sie die Kulturkammer mindestens 30 Minuten vor der Bildgebung auf dem Tisch eines inversen Laserscan-Mikroskops bei 37 °C mit der Heizung der Kammer oder einer Haube, die das Mikroskop umschließt, montiert, um eine Z-Drift zu vermeiden. Geben Sie befeuchtetes 5 % CO₂ + 40 % O₂ -Gas in die Kulturkammer.
2. Stellen Sie die Kulturschale mit den oben vorbereiteten Scheiben in die Kulturkammer.
3. Mit einem 20-fachen Objektiv mit großem Arbeitsabstand (NA = 0,45) können Sie etwa 10 Z-Stapel-Bilder mit 5-μm-Schritten alle 15-30 Minuten für 24 Stunden aufnehmen.
   HINWEIS: Die Verwendung eines motorisierten XY-Tisches wird dringend empfohlen. Dies ermöglicht es uns, Bilder aus mehreren objektiven Bereichen zu erhalten. In der Regel erhalten wir in einem Zeitraffer-Experiment 10-20 Bilder aus verschiedenen Objektivfeldern.

4. Bildgebende Analyse

1. Konvertieren Sie XYZT-Bilder in XYT durch die maximale Projektion der Z-Achse mit ImageJ oder einer anderen Software.
   HINWEIS: Wenn die Schichten während der Beobachtung verschoben wurden, passen Sie die Position der Zellen in den Bildern mit StackRed an, einem ImageJ-Plug-in mit seiner Funktion der Steifkörpertransformation (siehe Materialtabelle).
2. Verfolgen Sie die Flugbahn von GFP- oder anderen fluoreszierenden Protein-positiven Zellen entweder manuell oder automatisch. Manuelles und automatisches Tracing kann mit MTrackJ²⁴ bzw. TrackMate ^25,26 (ImageJ-Plugins) durchgeführt werden. Die automatische Rückverfolgung mit TrackMate ist effizient, um viele Zellen unvoreingenommen zu analysieren. Die manuelle Rückverfolgung mit MTrackJ bleibt jedoch nützlich, um einzelne Zellen genau zu verfolgen.

Ergebnisse

Radiale Gliazellen in der pallialen VZ produzieren nur Neuronen bis E14 und sowohl Neuronen als auch Gliazellen bei E15 und E16. Um das Migrationsverhalten von Neuronen und Gliazellen gleichzeitig zu beobachten, haben wir sie mit verstärktem GFP (EGFP) bzw. RFP markiert, indem wir einen neuronenspezifischen Promotor, den Tα1-Promotor²⁷, und den humanen humanen sauren Gliafibrillenprotein (hGFAP)-Promotor²⁸ verwendeten, der bevorzugt in Astrozyten aktiviert wird. ...

Diskussion

Mit diesem Protokoll wurde eine Methode zur Zeitrafferbeobachtung von Zellen eingeführt, die von der pallialen (kortikalen) VZ abstammen. Um die migrierenden Zellen aus der VZ zu markieren, verwendeten wir die in utero-Elektroporation, bei der einzelne Zellen eindeutig mit einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis markiert wurden als bei der viralen Vektor-vermittelten Markierung. Mit Hilfe der In-utero-Elektroporation kann jede Art von Vektor in beliebiger Kombination leicht in die radialen Gliazellen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.