Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Resumen

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Resumen

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Este proceso es crucial para el correcto funcionamiento del cerebro, y su desregulación puede dar lugar a trastornos del neurodesarrollo y psiquiátricos después del nacimiento. De hecho, se ha descubierto que muchos genes responsables de estas enfermedades están involucrados en este proceso y, por lo tanto, revelar cómo estas mutaciones afectan la dinámica celular es importante para comprender la patogénesis de estas enfermedades. Este protocolo introduce una técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales en cortes de cerebro obtenidos de embriones de ratón. Las células se marcan con proteínas fluorescentes mediante electroporación en el útero , que visualiza células individuales migrando desde la zona ventricular con una alta relación señal-ruido. Además, este sistema de transferencia de genes in vivo nos permite realizar fácilmente experimentos de ganancia o pérdida de función en los genes dados mediante co-electroporación de su expresión o vectores de knockdown/knockout. Utilizando este protocolo, se puede analizar el comportamiento migratorio y la velocidad de migración de las células individuales, información que nunca se obtiene de cerebros fijos.

Introducción

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, la glía radial (apical) en la zona ventricular paleal (VZ) que recubre el ventrículo lateral produce primero neuronas y luego progenitores gliales con algún período de superposición¹. Las neuronas también se generan a partir de progenitores intermedios o glía radial basal en la zona subventricular (SVZ) adyacente a la VZ, los cuales se originan en la glía radial (apical) ^2,3. En ratones, las células gliales radiales producen solo neuronas en el día embrionario (E) 12-14, tanto neuronas como progenitores gliales en E15-16, y progenitores glia....

Protocolo

El presente estudio se realizó con la aprobación y siguiendo las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación del Desarrollo, el Centro de Discapacidad del Desarrollo de Aichi (#2019-013) y la Universidad de Keio (A2021-030). Se obtuvieron comercialmente ratones ICR (de tipo salvaje) preñados cronometrados (véase la Tabla de Materiales). Para observar la relación entre las células migratorias y los vasos sanguíneos, se utilizaron ratones Flt1-DsRed, en los que las células endoteliales expresan DsRed²². Los ratones machos Flt1-DsRed se cruzaron con ratones hembra ICR (ambos ratones tenían en....

Discusión

Este protocolo introdujo un método para la observación en lapso de tiempo de células derivadas de la VZ paleal (cortical). Para etiquetar las células migratorias de la VZ, utilizamos la electroporación en el útero, en la que las células individuales se marcaron claramente con una relación señal-ruido más alta que en el etiquetado mediado por vectores virales. Utilizando la electroporación intrauterina, cualquier tipo de vector en cualquier combinación puede introducirse fácilmente en las c?.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.