Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Resumen

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Resumen

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Este proceso es crucial para el correcto funcionamiento del cerebro, y su desregulación puede dar lugar a trastornos del neurodesarrollo y psiquiátricos después del nacimiento. De hecho, se ha descubierto que muchos genes responsables de estas enfermedades están involucrados en este proceso y, por lo tanto, revelar cómo estas mutaciones afectan la dinámica celular es importante para comprender la patogénesis de estas enfermedades. Este protocolo introduce una técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales en cortes de cerebro obtenidos de embriones de ratón. Las células se marcan con proteínas fluorescentes mediante electroporación en el útero , que visualiza células individuales migrando desde la zona ventricular con una alta relación señal-ruido. Además, este sistema de transferencia de genes in vivo nos permite realizar fácilmente experimentos de ganancia o pérdida de función en los genes dados mediante co-electroporación de su expresión o vectores de knockdown/knockout. Utilizando este protocolo, se puede analizar el comportamiento migratorio y la velocidad de migración de las células individuales, información que nunca se obtiene de cerebros fijos.

Introducción

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, la glía radial (apical) en la zona ventricular paleal (VZ) que recubre el ventrículo lateral produce primero neuronas y luego progenitores gliales con algún período de superposición¹. Las neuronas también se generan a partir de progenitores intermedios o glía radial basal en la zona subventricular (SVZ) adyacente a la VZ, los cuales se originan en la glía radial (apical) ^2,3. En ratones, las células gliales radiales producen solo neuronas en el día embrionario (E) 12-14, tanto neuronas como progenitores gliales en E15-16, y progenitores gliales a partir de E17⁴. La mayor población de progenitores gliales generados durante estas etapas embrionarias se diferencia preferentemente en astrocitos, aunque algunas células también se diferencian en oligodendrocitos⁵. Las neuronas y los progenitores de astrocitos generados en estas etapas migran hacia la superficie del cerebro y entran en la placa cortical (futura materia gris cortical). La migración neuronal de la VZ a la placa cortical se produce en múltiples fases. Las neuronas primero adoptan una morfología multipolar justo por encima de la zona de acumulación celular multipolar (MAZ), superponiéndose a la SVZ o zona intermedia, donde se extienden y retraen vigorosamente múltiples procesos delgados y migran lentamente (migración multipolar)^6,7. Después de aproximadamente 24 h, las neuronas se transforman en una morfología bipolar, extendiendo un proceso de avance grueso hacia la superficie del cerebro y un proceso de arrastre delgado hacia atrás, y migran linealmente hacia la superficie del cerebro utilizando un proceso radial que se extiende desde la glía radial hasta la superficie pial como un andamio, que se denomina modo de locomoción ^2,8. Debido a que las neuronas en modo de locomoción siempre alcanzan la superficie más externa de la placa cortical, pasando a través de sus predecesoras justo debajo de la zona marginal, las neuronas se alinean de adentro hacia afuera dependiendo de la fecha de nacimiento en la placa cortical ^9,10,11.

Por el contrario, los progenitores de los astrocitos migran rápidamente a la zona intermedia y a la placa cortical, con frecuentes cambios de dirección. Este comportamiento migratorio es completamente diferente a la migración neuronal y se denomina migración errática⁵. Los progenitores de astrocitos también migran a lo largo de los vasos sanguíneos en un proceso llamado migración guiada por los vasos sanguíneos. Los progenitores de astrocitos cambian entre estos modos de migración y alcanzan la placa cortical ^5,12. A pesar de que la posición de los astrocitos no está estrictamente determinada por su fecha de producción, se ha observado una leve tendencia de los astrocitos nacidos temprano a establecerse en la parte superficial de la placa cortical⁵. Curiosamente, los astrocitos que se asientan en la placa cortical se generan en etapas embrionarias y eventualmente se diferencian en astrocitos protoplasmáticos, mientras que los astrocitos generados postnatalmente no migran activamente, permanecen en la sustancia blanca y se diferencian en astrocitos fibrosos⁵. Todavía no está claro cómo se produce esta especificación dependiente de la etapa de los subtipos astrocíticos.

Se ha identificado un número creciente de genes implicados en la migración neuronal, entre ellos los implicados en los trastornos del neurodesarrollo y psiquiátricos^13,14. Por lo tanto, es crucial dilucidar los efectos de las mutaciones en estos genes en el comportamiento de las neuronas migratorias. Como se mencionó anteriormente, la migración neuronal ocurre en múltiples fases. Las observaciones time-lapse pueden determinar directamente la fase que se ve principalmente afectada (salida del ciclo celular, transición multipolar-bipolar, velocidad de migración de la locomoción, etcétera). Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la especificación, migración y posicionamiento de los astrocitos siguen siendo en gran medida desconocidos. Dado que los astrocitos desempeñan un papel crucial en la sinaptogénesis¹⁵ y en la formación de barreras hematoencefálicas durante el desarrollo del cerebro¹⁶, los defectos del desarrollo de los astrocitos pueden dar lugar a trastornos del neurodesarrollo. Los estudios de lapso de tiempo sobre los progenitores de astrocitos pueden aclarar estos mecanismos moleculares y su relación con las enfermedades mentales.

Este protocolo proporciona un método para la observación en lapso de tiempo de las células corticales derivadas de VZ. Ya se ha publicado un protocolo de vídeo similar para la observación de la migración neuronal¹⁷. Aquí, describimos el método para las neuronas migratorias y los progenitores de astrocitos. Para marcar estas células con proteínas fluorescentes, como las proteínas fluorescentes verdes y rojas (GFP y RFP), se introducen mezclas de plásmidos que contienen componentes apropiados en la VZ cortical mediante electroporación en el útero en etapas apropiadas 18,19,20,21. Los embriones manipulados se extraen en las etapas deseadas, y los cerebros se cortan y se utilizan para observaciones de lapso de tiempo utilizando un microscopio de escaneo láser. La velocidad de migración, la dirección y otros comportamientos, que nunca se abordan con muestras fijas de cerebro, se pueden examinar con este método. Mediante el uso de electroporación en el útero, la expresión y los vectores knockdown/knockout pueden transferirse fácilmente de forma concomitante con vectores de proteínas fluorescentes, lo que nos permite realizar estudios de ganancia y pérdida de función de genes específicos.

Protocolo

El presente estudio se realizó con la aprobación y siguiendo las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación del Desarrollo, el Centro de Discapacidad del Desarrollo de Aichi (#2019-013) y la Universidad de Keio (A2021-030). Se obtuvieron comercialmente ratones ICR (de tipo salvaje) preñados cronometrados (véase la Tabla de Materiales). Para observar la relación entre las células migratorias y los vasos sanguíneos, se utilizaron ratones Flt1-DsRed, en los que las células endoteliales expresan DsRed²². Los ratones machos Flt1-DsRed se cruzaron con ratones hembra ICR (ambos ratones tenían entre 8 y 24 semanas de edad). Todos los animales fueron alojados y manipulados en condiciones específicas libres de patógenos (SPF) hasta el muestreo. Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Electroporación en el útero

1. Prepare la solución salina tamponada por HEPES (HBS) agregando un volumen igual de agua esterilizada en autoclave a 2 HBS disponibles comercialmente.
2. Hay dos opciones de anestésicos; isoflurano (inhalación) y MMB (inyección). En el caso de utilizar MMB, prepáralo de la siguiente manera. Añadir 0,75 mL de medetomidina (1 mg/mL), 2 mL de midazolam (5 mg/mL) y 2,5 mL de butorfanol (5 mg/mL) en 19,75 mL de agua esterilizada en autoclave²³.
   NOTA: Esta solución anestésica se vuelve menos activa en 2 meses. Almacenar a 4 °C con pantalla de luz.
3. Prepare la solución de atipamezol. Diluir 0,75 mL de atipamezol (5 mg/mL) con 24,25 mL de agua esterilizada en autoclave.
4. Prepare una solución Fast Green al 0,2% (p/v) en agua esterilizada en autoclave. Esterilizar con un filtro (tamaño de poro de 0,22 μm).
5. Prepare el plásmido utilizando un kit de purificación de plásmidos convencional basado en lisis alcalina y purificación en columna²³ de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Disolver el plásmido purificado a partir de un cultivo de bacterias de 100 mL en 30-50 μL de HBS para preparar el stock de plásmidos (3-5 μg/μL) (Archivo suplementario 1).
   1. Mezcle y diluya las existencias de plásmidos con HBS, y agregue 1/10 de volumen de 0.2% Fast Green para colorear el inyectante. Los componentes y las concentraciones finales de los plásmidos se determinan de acuerdo con su propósito (Tabla 1).
6. Fabrica las micropipetas tirando de los capilares de vidrio con un extractor de pipetas.
   NOTA: La punta de la pipeta se corta oblicuamente con pinzas finas. El diámetro exterior de la punta es de aproximadamente 70 μm. Marque las micropipetas a intervalos de 2 μL aspirando 2 μL de agua.
7. Inyectar el anestésico MMB a una dosis de 10 μL/g de peso corporal por vía intraperitoneal en una rata embarazada en una etapa apropiada (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
   NOTA: Los estadios embrionarios a manipular deben determinarse de acuerdo con el propósito. Para etiquetar las futuras neuronas piramidales II/III, E14.5 es adecuada. Para etiquetar los progenitores gliales, la electroporación debe realizarse en E15-16. Alternativamente, los ratones pueden ser anestesiados por inhalación de isoflurano (1%-2%).
8. Después de que el ratón esté profundamente anestesiado, colóquelo en un plato caliente a 38 ° C.
   NOTA: Asegúrese de que el mouse no responda al pellizcar la cola.
9. Después de eliminar el pelo alrededor del sitio quirúrgico con crema depilatoria, desinfecte el área quirúrgica varias veces con movimientos circulares con un exfoliante a base de yodo y alcohol al 70%. Realice una incisión en la piel de 2 cm de largo a lo largo de la línea media desde el nivel del^2º par de pezones más posterior en la parte anterior, seguida de una incisión de 2 cm en la línea media en la pared abdominal a lo largo de la línea alba (Figura 1A).
   NOTA: En el proceso de incisión en la pared abdominal, levántela ligeramente con pinzas finas para no cortar los órganos internos.
10. Coloque una lámina de plástico estéril sobre la piel y un pedazo de papel de seda estéril sobre ella (Figura 1A). Crea un agujero en el centro para exponer el área quirúrgica.
    NOTA: La lámina de plástico estéril y el papel de seda estéril se colocan después de realizar la incisión porque se requiere un campo de visión amplio para posicionar la incisión refiriéndose a la posición de los pezones.
11. Humedece el papel con PBS estéril, observa cuidadosamente los cuernos uterinos desde la incisión y saca el cuerno uterino a través de los agujeros de la hoja de plástico y el papel.
12. Utilizando una micropipeta conectada a un conjunto de tubo aspirador, inyecte 1 μL de la mezcla de plásmidos en el ventrículo lateral izquierdo o derecho a través de la pared uterina mediante presión espiratoria (Figura 1A).
    NOTA: Alternativamente, el plásmido se puede inyectar mediante el uso de un microinyector.
13. Pellizcar la cabeza del embrión con un electrodo tipo pinza y aplicar pulsos electrónicos utilizando un electroporador (35 V para E14-16, 50 V para E17, 50 ms pulsos cuadrados con intervalos de 450 ms, 5 veces) (Figura 1A).
    NOTA: No pellizque la cabeza de los embriones con fuerza, lo que dañará los embriones. La corriente real debe ser de 40-70 mA.
14. Vuelva a colocar el cuerno uterino en la cavidad abdominal.
15. Sutura la pared abdominal con un hilo de seda 5-0.
16. Aplicar solución de atipamezol a una dosis de 10 μL/g de peso corporal por vía intraperitoneal.
17. Sutura la piel con un hilo de seda 5-0.
    NOTA: La piel se puede cerrar con un autoclip.
18. Mantenga los ratones manipulados en un plato caliente durante al menos 30 minutos. Los ratones comenzarán a moverse en la jaula.
    NOTA: El procedimiento de electroporación en el útero (de los pasos 1.7 a 1.16) debe realizarse dentro de los 30 minutos. El tiempo de funcionamiento típico es de 20 min.

2. Preparación de las lonchas

NOTA: La frescura de las rodajas es la clave del éxito de este experimento. Las lonchas deben prepararse (de los pasos 2.5-2.12) en 2 h.

1. Prepare la solución salina equilibrada de Hanks con Ca²⁺ y Mg²⁺; HBSS(+). Añadir 5 mL de CaCl₂ (14 g/L, esterilizado en autoclave) y 5 mL de MgSO 4.7H₂O (20 g/L, esterilizado en autoclave) a 500 mL de HBSS(-). Conservar a 4 °C. Burbujee la solución con 95% de gas_O2 + 5% CO₂ durante 5 minutos en hielo antes de usar.
2. Preparar el medio de cultivo. Se necesitan al menos 2,5 mL/plato. Añadir 2 mL de suero fetal bovino, 25 μL de L-glutamina (200 mM), 200 μL de B27 (50x), 50 μL de penicilina + estreptomicina (10 K unidades/mL y 10 mg/mL) a 8 mL de medio Neurobasal.
3. Preparar gel de agarosa al 3% a baja temperatura de fusión. Poros de 50 mL de HBSS(+), luego agregue 1,5 mg de agarosa a baja temperatura de fusión y autoclave. Derrita la agarosa en un horno microondas y manténgala a 50 °C en una incubadora al baño de agua antes de usarla.
4. Agregue 1,9 mL de medio de cultivo a una placa base de vidrio. Coloque un inserto de cultivo celular sobre él con cuidado para no atrapar las bombillas de aire debajo del filtro, luego agregue 500 μL de medio de cultivo en el filtro (Figura 1B). Colócalo sobre hielo.
5. Después de anestesiar a los ratones manipulados por inhalación de isoflurano al 5%, sacrificarlos por luxación cervical (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente) en las etapas apropiadas a observar.
   NOTA: Dos días (48 h) y 3 días después de la electroporación en E14.5 son adecuados para observar la transición multipolar-bipolar y el modo de locomoción, respectivamente.
6. Saca los embriones y colócalos en una placa de Petri con PBS frío.
7. Seleccionar los embriones mediante la expresión de GFP u otras proteínas fluorescentes bajo un microscopio.
8. Después de la decapitación de los embriones, diseccionar los cerebros⁶ bajo un microscopio de disección y mantenerlos en HBSS frío(+).
9. Vierta el gel de agarosa derretido al 3% a baja temperatura de fusión en un criomold (consulte la Tabla de materiales), y luego coloque los sesos en él y gírelos varias veces. Colócalo a temperatura ambiente hasta que la agarosa se solidifique por completo y luego colócalo sobre hielo.
10. Cortar los sesos coronalmente con un grosor de 350 μm utilizando un micrótomo vibratorio (véase la tabla de materiales).
11. Coloque las rebanadas en el filtro (máximo 6 rebanadas por filtro).
12. Retire el medio de cultivo del interior y del exterior del recipiente del filtro (600 μL en total). En este paso, las rodajas se prensan y se fijan a un filtro. Después de 5 minutos, agregue 100 μL de medio de cultivo en el interior del inserto de cultivo celular.

3. Imágenes de lapso de tiempo

1. Mantenga la cámara de cultivo montada en la platina de un microscopio de barrido láser invertido a 37 °C utilizando el calentador de la cámara o una capucha que encierra el microscopio al menos 30 minutos antes de la obtención de imágenes para evitar la deriva Z. Suministro de gas humidificado 5% CO₂ + 40%_O2 a la cámara de cultivo.
2. Coloque el plato de cultivo con rodajas preparadas anteriormente en la cámara de cultivo.
3. Utilizando un objetivo de 20x a larga distancia de trabajo (NA = 0,45), adquiera alrededor de 10 imágenes de pila Z con pasos de 5 μm cada 15-30 minutos durante 24 h.
   NOTA: Se recomienda encarecidamente el uso de una plataforma XY motorizada. Esto nos permite obtener imágenes de múltiples campos objetivo. Por lo general, obtenemos de 10 a 20 imágenes de diferentes campos objetivo en un experimento de lapso de tiempo.

4. Análisis de imágenes

1. Convierta imágenes XYZT a XYT mediante la proyección máxima del eje Z utilizando ImageJ u otro software.
   NOTA: Si los cortes se deslizaron durante la observación, ajuste la posición de las celdas dentro de las imágenes usando StackRed, un complemento de ImageJ, con su función de transformación de cuerpo rígido (ver Tabla de materiales).
2. Trazar la trayectoria de las células GFP- u otras células fluorescentes positivas para proteínas, ya sea de forma manual o automática. El rastreo manual y automático se puede realizar utilizando MTrackJ²⁴ y TrackMate ^25,26 (complementos de ImageJ), respectivamente. El rastreo automático con TrackMate es eficiente para analizar muchas celdas de manera imparcial. Sin embargo, el rastreo manual con MTrackJ sigue siendo útil para el seguimiento preciso de células individuales.

Resultados

Las células gliales radiales en la VZ paleal producen solo neuronas hasta E14, y tanto las neuronas como las células gliales en E15 y E16. Para observar los comportamientos migratorios de las neuronas y las células gliales simultáneamente, las marcamos con GFP mejorada (EGFP) y RFP, respectivamente, utilizando un promotor específico de neurona, el promotor²⁷ de Tα1, y el promotor²⁸ de la proteína ácida fibrilar glial humana (hGFAP), que se activa preferente...

Discusión

Este protocolo introdujo un método para la observación en lapso de tiempo de células derivadas de la VZ paleal (cortical). Para etiquetar las células migratorias de la VZ, utilizamos la electroporación en el útero, en la que las células individuales se marcaron claramente con una relación señal-ruido más alta que en el etiquetado mediado por vectores virales. Utilizando la electroporación intrauterina, cualquier tipo de vector en cualquier combinación puede introducirse fácilmente en las c?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.