Imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires

Résumé

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. De nombreux gènes sont impliqués dans ce processus. Ce protocole introduit la technique d’imagerie en accéléré des neurones en migration et des progéniteurs gliaux.

Résumé

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. Ce processus est crucial pour le bon fonctionnement du cerveau, et sa dérégulation peut entraîner des troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques après la naissance. En fait, de nombreux gènes responsables de ces maladies se sont avérés être impliqués dans ce processus, et par conséquent, il est important de révéler comment ces mutations affectent la dynamique cellulaire pour comprendre la pathogenèse de ces maladies. Ce protocole introduit une technique d’imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des coupes de cerveau obtenues à partir d’embryons de souris. Les cellules sont marquées avec des protéines fluorescentes à l’aide de l’électroporation in utero , qui visualise les cellules individuelles migrant de la zone ventriculaire avec un rapport signal/bruit élevé. De plus, ce système de transfert de gènes in vivo nous permet d’effectuer facilement des expériences de gain ou de perte de fonction sur les gènes donnés par co-électroporation de leur expression ou de leurs vecteurs knockdown/knock-out. À l’aide de ce protocole, le comportement migratoire et la vitesse de migration des cellules individuelles, des informations qui ne sont jamais obtenues à partir de cerveaux fixes, peuvent être analysés.

Introduction

Au cours du développement du cortex cérébral, la glie radiale (apicale) dans la zone ventriculaire palléenne (VZ) tapissant le ventricule latéral produit d’abord des neurones, puis des progéniteurs gliaux avec une période¹ qui se chevauche. Les neurones sont également générés à partir de progéniteurs intermédiaires ou de la glie radiale basale dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) adjacente à la VZ, qui proviennent toutes deux de la glie radiale (apicale) ^2,3. Chez la souris, les cellules gliales radiales ne produisent que des neurones le jour embryonnaire (E) 12-14, des neurones et des....

Protocole

La présente étude a été réalisée avec l’approbation et en suivant les directives du Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut de recherche sur le développement, du Centre de déficience intellectuelle d’Aichi (#2019-013) et de l’Université Keio (A2021-030). Des souris ICR gravides (de type sauvage) ont été obtenues commercialement (voir la table des matières). Pour observer la relation entre les cellules migratrices et les vaisseaux sanguins, des souris Flt1-DsRed, chez lesquelles les cellules endothéliales expriment DsRed²², ont été utilisées. Des souris mâles Flt1-DsRed ont été croisées avec des souris fe....

Discussion

Ce protocole a introduit une méthode d’observation en accéléré des cellules dérivées de la VZ palléale (corticale). Pour marquer les cellules migratrices de la VZ, nous avons utilisé l’électroporation in utero, dans laquelle les cellules individuelles ont été clairement marquées avec un rapport signal/bruit plus élevé que dans le marquage par vecteur viral. En utilisant l’électroporation in utero, tout type de vecteur dans n’importe quelle combinaison peut être facilement introdu.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.