Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Resumo

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Resumo

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Esse processo é crucial para o funcionamento adequado do cérebro, e sua desregulação pode resultar em distúrbios do neurodesenvolvimento e psiquiátricos após o nascimento. De fato, muitos genes responsáveis por essas doenças estão envolvidos nesse processo e, portanto, revelar como essas mutações afetam a dinâmica celular é importante para entender a patogênese dessas doenças. Este protocolo introduz uma técnica para imagens de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro obtidas de embriões de camundongos. As células são marcadas com proteínas fluorescentes usando eletroporação in utero , que visualiza células individuais migrando da zona ventricular com uma alta relação sinal-ruído. Além disso, este sistema de transferência de genes in vivo nos permite realizar facilmente experimentos de ganho de função ou perda de função nos genes dados por co-eletroporação de sua expressão ou vetores de knockdown/knockout. Usando este protocolo, o comportamento migratório e a velocidade de migração de células individuais, informações que nunca são obtidas de cérebros fixos, podem ser analisados.

Introdução

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, a glia radial (apical) na zona ventricular palial (VZ) que reveste o ventrículo lateral produz primeiro neurônios e depois progenitores gliais com algum período de sobreposição¹. Os neurônios também são gerados a partir de progenitores intermediários ou glia radial basal na zona subventricular (SVZ) adjacente à VZ, ambas originadas da glia radial (apical) ^2,3. Em camundongos, as células gliais radiais produzem apenas neurônios no dia embrionário (E) 12-14, neurônios e progenitores gliais em E15-16 e progenitores gliais de E17 em diante⁴. A maior população de progenitores gliais gerada durante esses estágios embrionários se diferencia preferencialmente em astrócitos, embora algumas células também se diferenciem em oligodendrócitos⁵. Neurônios e progenitores de astrócitos gerados nesses estágios migram em direção à superfície do cérebro e entram na placa cortical (futura substância cinzenta cortical). A migração neuronal da VZ para a placa cortical ocorre em várias fases. Os neurônios adotam primeiro uma morfologia multipolar logo acima da zona de acumulação celular multipolar (MAZ), sobrepondo-se à SVZ ou zona intermediária, onde se estendem e retraem vigorosamente vários processos finos e migram lentamente (migração multipolar) ^{6 , 7} . Após aproximadamente 24 h, os neurônios se transformam em uma morfologia bipolar, estendendo um processo principal espesso em direção à superfície do cérebro e um processo de rastreamento fino para trás, e migram linearmente em direção à superfície do cérebro usando um processo radial que se estende da glia radial à superfície pial como um andaime, que é chamado de modo de locomoção ^2,8. Como os neurônios em modo de locomoção sempre atingem a superfície mais externa da placa cortical, passando por seus predecessores logo abaixo da zona marginal, os neurônios são alinhados de dentro para fora dependentes da data de nascimento na placa cortical ^9,10,11.

Em contraste, os progenitores dos astrócitos migram rapidamente para a zona intermediária e a placa cortical, com frequentes mudanças direcionais. Esse comportamento migratório é completamente diferente da migração neuronal e é chamado de migração errática⁵. Os progenitores dos astrócitos também migram ao longo dos vasos sanguíneos em um processo chamado migração guiada pelos vasos sanguíneos. Os progenitores dos astrócitos alternam entre esses modos de migração e atingem a placa cortical ^5,12. Embora o posicionamento dos astrócitos não seja estritamente determinado pela data de produção, foi observada uma tendência leve de os astrócitos nascidos precocemente se estabelecerem na parte superficial da placa cortical⁵. Curiosamente, os astrócitos que se instalam na placa cortical são gerados em estágios embrionários e eventualmente se diferenciam em astrócitos protoplasmáticos, enquanto os astrócitos gerados no pós-natal não migram ativamente, permanecem na substância branca e se diferenciam em astrócitos fibrosos⁵. Como essa especificação dependente do estágio dos subtipos astrocíticos ocorre ainda não está claro.

Um número crescente de genes envolvidos na migração neuronal foi identificado, incluindo aqueles envolvidos em distúrbios do neurodesenvolvimento e psiquiátricos^13,14. Portanto, é crucial elucidar os efeitos de mutações nesses genes sobre o comportamento dos neurônios migratórios. Como mencionado anteriormente, a migração neuronal ocorre em várias fases. As observações de lapso de tempo podem determinar diretamente a fase mais afetada (saída do ciclo celular, transição multipolar-bipolar, velocidade de migração da locomoção, etc.). No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à especificação, migração e posicionamento dos astrócitos permanecem amplamente desconhecidos. Dado que os astrócitos desempenham papéis cruciais na sinaptogênese¹⁵ e na formação da barreira hematoencefálica durante o desenvolvimento do cérebro¹⁶, os defeitos de desenvolvimento nos astrócitos podem resultar em distúrbios do neurodesenvolvimento. Estudos de lapso de tempo em progenitores de astrócitos podem esclarecer esses mecanismos moleculares e sua relação com doenças mentais.

Este protocolo fornece um método para observação de lapso de tempo de células corticais derivadas de VZ. Um protocolo de vídeo semelhante para a observação da migração neuronal já foi publicado¹⁷. Aqui, descrevemos o método para neurônios migratórios e progenitores de astrócitos. Para marcar essas células com proteínas fluorescentes, como proteínas fluorescentes verdes e vermelhas (GFP e RFP), misturas de plasmídeos contendo componentes apropriados são introduzidas na VZ cortical por eletroporação in utero em estágios apropriados 18,19,20,21. Os embriões manipulados são removidos nos estágios desejados e os cérebros são fatiados e usados para observações de lapso de tempo usando um microscópio de varredura a laser. A velocidade de migração, direção e outros comportamentos, que nunca são abordados usando amostras cerebrais fixas, podem ser examinados usando este método. Usando eletroporação in utero, expressão e vetores knockdown/knockout podem ser facilmente transferidos concomitantemente com vetores de proteínas fluorescentes, permitindo-nos realizar estudos de ganho de função e perda de função de genes específicos.

Protocolo

O presente estudo foi realizado com a aprovação e seguindo as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Pesquisa do Desenvolvimento, Centro de Deficiência do Desenvolvimento de Aichi (# 2019-013) e Universidade de Keio (A2021-030). Camundongos ICR (tipo selvagem) prenhes cronometrados foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais). Para observar a relação entre células migratórias e vasos sanguíneos, foram utilizados camundongos Flt1-DsRed, nos quais as células endoteliais expressam DsRed²². Camundongos Flt1-DsRed machos foram cruzados com camundongos ICR fêmeas (ambos os camundongos tinham 8-24 semanas de idade). Todos os animais foram alojados e manipulados em condições específicas livres de patógenos (FPS) até a amostragem. Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Eletroporação in utero

1. Prepare a solução salina tamponada com HEPES (HBS) adicionando um volume igual de água autoclavada ao 2x HBS disponível comercialmente.
2. Existem duas opções de anestésicos; isoflurano (inalação) e MMB (injeção). No caso de usar MMB, prepare-o da seguinte maneira. Adicionar 0,75 mL de medetomidina (1 mg/mL), 2 mL de midazolam (5 mg/mL) e 2,5 mL de butorfanol (5 mg/mL) em 19,75 mL de água^{autoclavada 23}.
   NOTA: Esta solução anestésica torna-se menos ativa em 2 meses. Conservar a 4 °C com proteção contra luzes.
3. Prepare a solução de atipamezol. Diluir 0,75 mL de atipamezol (5 mg/mL) com 24,25 mL de água autoclavada.
4. Prepare a solução Fast Green a 0,2% (p / v) em água autoclavada. Esterilize com um filtro (tamanho do poro 0,22 μm).
5. Preparar o plasmídeo utilizando um kit de purificação de plasmídeos convencional baseado em lise alcalina e purificação em coluna²³ de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Dissolva o plasmídeo purificado da cultura de bactérias de 100 mL em 30-50 μL de HBS para preparar o estoque de plasmídeo (3-5 μg/μL) (Arquivo Suplementar 1).
   1. Misture e dilua os estoques de plasmídeo com HBS e adicione 1/10 de volume de 0,2% Fast Green para colorir o injetante. Os componentes e as concentrações finais dos plasmídeos são determinados de acordo com sua finalidade (Tabela 1).
6. Faça as micropipetas puxando os capilares de vidro usando um extrator de pipeta.
   NOTA: A ponta da pipeta é cortada obliquamente com pinça fina. O diâmetro externo da ponta é de aproximadamente 70 μm. Marque as micropipetas em intervalos de 2 μL sugando 2 μL de água.
7. Injete o anestésico MMB na dose de 10 μL / g de peso corporal por via intraperitoneal em um camundongo prenhe em um estágio apropriado (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
   NOTA: Os estágios embrionários a serem manipulados devem ser determinados de acordo com a finalidade. Para rotular futuros neurônios piramidais II / III, E14.5 é adequado. Para rotular os progenitores gliais, a eletroporação deve ser realizada em E15-16. Alternativamente, os camundongos podem ser anestesiados por inalação de isoflurano (1%-2%).
8. Depois que o mouse estiver profundamente anestesiado, coloque-o em um prato quente a 38 °C.
   NOTA: Certifique-se de que o mouse não responda ao beliscar a cauda.
9. Depois de remover o pelo ao redor do local da cirurgia usando creme depilatório, desinfete a área cirúrgica várias vezes em movimentos circulares com um esfoliante à base de iodo e álcool 70%. Faça uma incisão na pele de 2 cm de comprimento ao longo da linha média a partir do nível do^2º par de mamilos mais posterior anteriormente, seguida por uma incisão na linha média de 2 cm na parede abdominal ao longo da linha alba (Figura 1A).
   NOTA: No processo de incisão na parede abdominal, levante-a levemente com pinças finas para não cortar os órgãos internos.
10. Coloque uma folha de plástico estéril sobre a pele e um pedaço de papel de seda estéril sobre ela (Figura 1A). Crie um orifício no centro para expor a área cirúrgica.
    NOTA: A folha de plástico estéril e o lenço de papel estéril são colocados após a incisão, pois é necessário um amplo campo de visão para posicionar a incisão referindo-se à posição dos mamilos.
11. Molhe o papel com PBS estéril, observe cuidadosamente os chifres uterinos da incisão e puxe o chifre uterino através dos orifícios da folha de plástico e papel.
12. Usando uma micropipeta conectada a um conjunto de tubo aspirador, injete 1 μL da mistura de plasmídeo no ventrículo lateral esquerdo ou direito através da parede uterina por pressão expiratória (Figura 1A).
    NOTA: Alternativamente, o plasmídeo pode ser injetado usando um microinjetor.
13. Aperte a cabeça do embrião com um eletrodo do tipo pinça e aplique pulsos eletrônicos usando um eletroporador (35 V para E14-16, 50 V para E17, pulsos quadrados de 50 ms com intervalos de 450 ms, 5 vezes) (Figura 1A).
    NOTA: Não aperte a cabeça dos embriões com força, o que danificará os embriões. A corrente real deve ser de 40-70 mA.
14. Coloque o corno uterino de volta na cavidade abdominal.
15. Suturar a parede abdominal com fio de seda 5-0.
16. Aplicar solução de atipamezol na dose de 10 μL/g de peso corporal por via intraperitoneal.
17. Suturar a pele com um fio de seda 5-0.
    NOTA: A pele pode ser fechada usando um clipe automático.
18. Mantenha os ratos manipulados em um prato quente por pelo menos 30 min. Os ratos começarão a se mover na gaiola.
    NOTA: O procedimento de eletroporação in utero (das etapas 1.7 a 1.16) deve ser feito dentro de 30 min. O tempo típico de operação é de 20 min.

2. Preparação de fatias

NOTA: O frescor das fatias é a chave para o sucesso deste experimento. As fatias devem ser preparadas (das etapas 2.5-2.12) dentro de 2 h.

1. Preparar a solução salina balanceada de Hanks com Ca²⁺ e Mg²⁺; HBSS (+). Adicione 5 mL de CaCl₂ (14 g/L, autoclavado) e 5 mL de MgSO 4,7H₂O (20 g/L, autoclavado) a 500 mL de HBSS(-). Conservar a 4 °C. Borbulhe a solução com gás 95% O₂ + 5% CO₂ por 5 min no gelo antes de usar.
2. Prepare o meio de cultura. É necessário pelo menos 2,5 mL/prato. Adicione 2 mL de soro fetal bovino, 25 μL de L-glutamina (200 mM), 200 μL B27 (50x), 50 μL de penicilina + estreptomicina (10 K unidades/mL e 10 mg/mL) a 8 mL de meio neurobasal.
3. Prepare gel de agarose a 3% de baixa temperatura de fusão. Faça um poro de 50 mL de HBSS (+), adicione 1,5 mg de agarose de baixa temperatura de fusão e autoclave. Derreta a agarose em um forno de micro-ondas e mantenha-a a 50 ° C em uma incubadora em banho-maria antes de usar.
4. Adicione 1,9 mL de meio de cultura a um prato de base de vidro. Coloque um inserto de cultura de células com cuidado para não prender os bulbos de ar sob o filtro e, em seguida, adicione 500 μL de meio de cultura ao filtro (Figura 1B). Coloque-o no gelo.
5. Após anestesiar os camundongos manipulados por inalação de isoflurano a 5%, sacrificá-los por luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) em estágios apropriados a serem observados.
   NOTA: Dois dias (48 h) e 3 dias após a eletroporação em E14.5 são adequados para observar a transição multipolar-bipolar e o modo de locomoção, respectivamente.
6. Retire os embriões e coloque-os em uma placa de Petri com PBS frio.
7. Selecione os embriões pela expressão de GFP ou outras proteínas fluorescentes sob um microscópio.
8. Após a decapitação dos embriões, dissecar os cérebros⁶ sob um microscópio de dissecação e mantê-los em HBSS (+) frio.
9. Despeje o gel de agarose derretido a 3% de baixa temperatura de fusão em um criomoldor (consulte a Tabela de Materiais) e, em seguida, coloque os cérebros nele e role-os várias vezes. Coloque-o em temperatura ambiente até que a agarose solidifique completamente e, em seguida, coloque-o no gelo.
10. Corte os cérebros coronalmente na espessura de 350 μm usando um micrótomo vibratório (consulte a Tabela de Materiais).
11. Disponha as fatias no filtro (máximo de 6 fatias por filtro).
12. Retire o meio de cultura do interior e do exterior do copo filtrante (600 μL no total). Nesta etapa, as fatias são prensadas e fixadas em um filtro. Após 5 min, adicione 100 μL de meio de cultura no interior do inserto de cultura de células.

3. Imagem com lapso de tempo

1. Manter a câmara de cultura montada na platina de um microscópio de varrimento a laser invertido a 37 °C, utilizando o aquecedor da câmara ou uma campânula que envolve o microscópio pelo menos 30 minutos antes da obtenção de imagens para evitar o desvio Z. Forneça gás umidificado a 5% de CO₂ + 40% de O₂ para a câmara de cultura.
2. Coloque o prato de cultura com as fatias preparadas acima na câmara de cultura.
3. Usando uma lente de 20x de longa distância de trabalho (NA = 0,45), adquira cerca de 10 imagens Z-stack com passos de 5 μm a cada 15-30 min por 24 h.
   NOTA: O uso de um estágio XY motorizado é altamente recomendado. Isso nos permite obter imagens de vários campos objetivos. Normalmente, obtemos de 10 a 20 imagens de diferentes campos objetivos em um experimento de lapso de tempo.

4. Análise de imagem

1. Converta imagens XYZT para XYT pela projeção máxima do eixo Z usando o ImageJ ou outro software.
   NOTA: Se as fatias deslizarem durante a observação, ajuste a posição das células dentro das imagens usando o StackRed, um plugin ImageJ, com sua função de transformação de Corpo Rígido (consulte Tabela de Materiais).
2. Trace a trajetória de GFP ou outras células positivas para proteínas fluorescentes manualmente ou automaticamente. O rastreamento manual e automático pode ser realizado usando o MTrackJ²⁴ e o TrackMate ^25,26 (plug-ins ImageJ), respectivamente. O rastreamento automático usando o TrackMate é eficiente para analisar muitas células de maneira imparcial. No entanto, o rastreamento manual usando o MTrackJ continua sendo útil para o rastreamento preciso de células individuais.

Resultados

As células gliais radiais na VZ palial produzem apenas neurônios até E14, e neurônios e células gliais em E15 e E16. Para observar os comportamentos migratórios de neurônios e células gliais simultaneamente, nós os rotulamos com GFP aprimorado (EGFP) e RFP, respectivamente, usando um promotor específico de neurônio, o promotor Tα1²⁷ e o promotor da proteína ácida fibrilar glial humana (hGFAP)²⁸, que é preferencialmente ativado em astrócitos. Os prog...

Discussão

Este protocolo introduziu um método para a observação de lapso de tempo de células derivadas do VZ palial (cortical). Para rotular as células migratórias do VZ, usamos a eletroporação no útero, na qual as células individuais foram claramente marcadas com uma relação sinal-ruído mais alta do que na marcação mediada por vetor viral. Usando a eletroporação in utero, qualquer tipo de vetor em qualquer combinação pode ser facilmente introduzido nas células gliais radiais (células-tronco ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.