דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

Summary

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

Abstract

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. תהליך זה חיוני לתפקוד תקין של המוח, וחוסר ויסות שלו עלול לגרום להפרעות נוירו-התפתחותיות ופסיכיאטריות לאחר הלידה. למעשה, גנים רבים האחראים למחלות אלה נמצאו מעורבים בתהליך זה, ולכן חשיפת האופן שבו מוטציות אלה משפיעות על הדינמיקה התאית חשובה להבנת הפתוגנזה של מחלות אלה. פרוטוקול זה מציג טכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח המתקבלות מעוברי עכברים. תאים מסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים באמצעות אלקטרופורציה ברחם , המדמה תאים בודדים הנודדים מאזור החדר עם יחס אות לרעש גבוה. יתר על כן, מערכת העברת גנים in vivo זו מאפשרת לנו לבצע בקלות ניסויים של רווח תפקוד או אובדן תפקוד על הגנים הנתונים על ידי אלקטרופורציה משותפת של הביטוי שלהם או וקטורים knockdown/knockout. באמצעות פרוטוקול זה ניתן לנתח את התנהגות הנדידה ומהירות הנדידה של תאים בודדים, מידע שלעולם אינו מתקבל ממוחות קבועים.

Introduction

במהלך התפתחות קליפת המוח, גליה רדיאלית (אפיקלית) באזור החדר הפליאלי (VZ) המצפה את החדר הצידי מייצרת תחילה נוירונים ולאחר מכן אבות גליה עם תקופה חופפת^{כלשהי 1}. תאי עצב נוצרים גם מאבות ביניים או מתאי גליה רדיאליים בסיסיים באזור התת-חדרי (SVZ) הסמוך ל-VZ, שניהם נובעים מהגליה הרדיאלית (אפיקלית) ^2,3. בעכברים, תאי גליה רדיאליים מייצרים רק תאי עצב ביום העוברי (E) 12-14, גם תאי עצב וגם אבות גלייה ב-E15-16, ואבות גלייה מ-E17 ואילך⁴. האוכלוסייה העיקרית של אבות גליה שנוצרו במהלך שלבים עובריים אלה מתמיינת באופן מועדף לאסטרוציטים, אם כי תאים מסוימים מתמיינים גם לאוליגודנדרוציטים⁵. תאי עצב ואבות אסטרוציטים הנוצרים בשלבים אלה נודדים לעבר פני השטח של המוח ונכנסים ללוח קליפת המוח (החומר האפור קליפת המוח העתידי). הגירה עצבית מה- VZ לצלחת קליפת המוח מתרחשת במספר שלבים. תאי עצב מאמצים תחילה מורפולוגיה רב-קוטבית ממש מעל אזור הצטברות התאים הרב-קוטביים (MAZ), החופפים את SVZ או אזור הביניים, שם הם מאריכים במרץ ונסוגים תהליכים דקים מרובים ונודדים לאט (נדידה רב-קוטבית)^6,7. לאחר כ-24 שעות, תאי עצב הופכים למורפולוגיה דו-קוטבית, המאריכה תהליך מוביל עבה לעבר פני השטח של המוח ותהליך נגרר דק לאחור, ונודדים באופן ליניארי לעבר פני השטח של המוח באמצעות תהליך רדיאלי הנמשך מהגליה הרדיאלית אל פני השטח של הפיאל כפיגום, הנקרא מצב תנועה ^2,8. מאחר שתאי עצב במצב תנועה תמיד מגיעים לפני השטח החיצוניים ביותר של לוח קליפת המוח, ועוברים דרך קודמיהם ממש מתחת לאזור השוליים, תאי עצב מיושרים באופן תלוי תאריך לידה מבפנים החוצה בלוח קליפת המוח ^9,10,11.

לעומת זאת, אבות אסטרוציטים נודדים במהירות לאזור הביניים וללוח קליפת המוח, עם שינויי כיוון תכופים. התנהגות הגירה זו שונה לחלוטין מהגירה עצבית ונקראת הגירה לא יציבה⁵. אבות אסטרוציטים נודדים גם לאורך כלי הדם בתהליך שנקרא נדידה מונחית כלי דם. אבות אסטרוציטים עוברים בין מצבי נדידה אלה ומגיעים ללוח קליפת המוח ^5,12. למרות המיקום של אסטרוציטים אינו נקבע בקפידה על ידי תאריך הייצור שלהם, נטייה קלה עבור אסטרוציטים שנולדו מוקדם להתיישב בחלק השטחי של צלחת קליפת המוח נצפתה⁵. באופן מעניין, אסטרוציטים המתיישבים בלוח קליפת המוח נוצרים בשלבים עובריים ובסופו של דבר מתמיינים לאסטרוציטים פרוטופלסמיים, בעוד שאסטרוציטים שנוצרו לאחר הלידה אינם נודדים באופן פעיל, נשארים בחומר הלבן ומתמיינים לאסטרוציטים סיביים⁵. כיצד מתרחש מפרט תלוי שלב זה של תת-סוגים אסטרוציטיים עדיין אינו ברור.

מספר גדל והולך של גנים המעורבים בהגירה עצבית זוהו, כולל אלה המעורבים בהפרעות נוירו-התפתחותיות ופסיכיאטריות^13,14. לכן, חיוני להבהיר את ההשפעות של מוטציות בגנים אלה על ההתנהגות של נוירונים נודדים. כאמור, הגירה עצבית מתרחשת במספר שלבים. תצפיות בהילוך מהיר יכולות לקבוע ישירות את השלב המושפע בעיקר (יציאת מחזור התא, מעבר רב-קוטבי-דו-קוטבי, מהירות נדידה של תנועה וכו '). עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס המפרט, ההגירה והמיקום של אסטרוציטים עדיין אינם ידועים במידה רבה. בהתחשב בכך שאסטרוציטים ממלאים תפקידים מכריעים בסינפטוגנזה¹⁵ ובהיווצרות מחסום דם-מוח במהלך התפתחות המוח¹⁶, פגמים התפתחותיים באסטרוציטים עלולים לגרום להפרעות נוירו-התפתחותיות. מחקרים בהילוך מהיר על אבות אסטרוציטים עשויים להבהיר מנגנונים מולקולריים אלה ואת הקשר שלהם עם מחלות נפש.

פרוטוקול זה מספק שיטה לתצפית בהילוך מהיר של תאים שמקורם בקליפת המוח VZ. פרוטוקול וידאו דומה לתצפית על הגירה עצבית כבר פורסם¹⁷. במאמר זה אנו מתארים את השיטה הן עבור תאי עצב נודדים והן עבור אבות אסטרוציטים. כדי לתייג תאים אלה עם חלבונים פלואורסצנטיים, כגון חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים (GFP ו- RFP), תערובות פלסמיד המכילות רכיבים מתאימים מוכנסות לתוך VZ קליפת המוח על ידי אלקטרופורציה ברחם בשלבים המתאימים 18,19,20,21. העוברים שעברו מניפולציה מוסרים בשלבים הרצויים, והמוח נחתך ומשמש לתצפיות בהילוך מהיר באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר. את מהירות הנדידה, הכיוון והתנהגויות אחרות, שלעולם אינן מטופלות באמצעות דגימות מוח קבועות, ניתן לבחון באמצעות שיטה זו. שימוש באלקטרופורציה ברחם, ביטוי ווקטורים של הדחה/נוקאאוט יכולים להיות מועברים בקלות במקביל לווקטורים של חלבונים פלואורסצנטיים, מה שמאפשר לנו לבצע מחקרי רווח תפקוד ואובדן תפקוד של גנים ספציפיים.

Protocol

המחקר הנוכחי בוצע באישור ובהתאם להנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון למחקר התפתחותי, מרכז הנכות ההתפתחותית של אייצ'י (#2019-013) ואוניברסיטת קאיו (A2021-030). עכברי ICR (סוג בר) בהריון מתוזמן הושגו באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). כדי לבחון את הקשר בין תאים נודדים וכלי דם, נעשה שימוש בעכברי Flt1-DsRed, שבהם תאי האנדותל מבטאים DsRed²². עכברי Flt1-DsRed זכרים הוצלבו עם נקבות עכברי ICR (שני העכברים היו בגיל 8-24 שבועות). כל בעלי החיים שוכנו ועברו מניפולציה בתנאים ספציפיים נטולי פתוגן (SPF) עד לדגימה. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. באלקטרופורציה ברחם

1. הכינו תמיסת מלח חוצצת HEPES (HBS) על ידי הוספת נפח שווה של מים אוטוקלאביים ל-2x HBS הזמינים מסחרית.
2. ישנן שתי אפשרויות של הרדמה; איזופלורן (שאיפה) ו-MMB (הזרקה). במקרה של שימוש MMB, להכין אותו כדלקמן. הוסף 0.75 מ"ל של medetomidine (1 מ"ג / מ"ל), 2 מ"ל של midazolam (5 מ"ג / מ"ל), ו 2.5 מ"ל של butorphanol (5 מ"ג / מ"ל) ב 19.75 מ"ל של מים autoclaved²³.
   הערה: תמיסת הרדמה זו הופכת לפחות פעילה תוך חודשיים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עם מגן אור.
3. הכן פתרון atipamezole. לדלל 0.75 מ"ל של atipamezole (5 מ"ג / מ"ל) עם 24.25 מ"ל של מים autoclaved.
4. הכינו תמיסה ירוקה מהירה של 0.2% (w/v) במים אוטוקלאביים. לעקר עם מסנן (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר).
5. הכינו פלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד קונבנציונלית המבוססת על ליזה בסיסית וטיהור עמודים²³ בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). להמיס את הפלסמיד המטוהר מתרבית חיידקים של 100 מ"ל ב-30-50 מיקרוליטר של HBS כדי להכין את ציר הפלסמיד (3-5 מיקרוגרם/מיקרוליטר) (קובץ משלים 1).
   1. מערבבים ומדללים את ציר הפלסמיד עם HBS, ומוסיפים נפח של 1/10 של 0.2% ירוק מהיר כדי לצבוע את המזרק. המרכיבים והריכוזים הסופיים של הפלסמידים נקבעים בהתאם לייעודם (טבלה 1).
6. הפוך את micropipettes על ידי משיכת נימי זכוכית באמצעות מושך פיפטה.
   הערה: קצה הפיפטה נחתך בצורה אלכסונית באמצעות מלקחיים עדינים. הקוטר החיצוני של הקצה הוא כ-70 מיקרומטר. סמן את המיקרופיפטות במרווחים של 2 μL על ידי מציצת 2 μL מים.
7. יש להזריק חומר הרדמה MMB במינון של 10 μL/g משקל גוף תוך צפקי לעכברה בהריון בשלב מתאים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו במוסד).
   הערה: השלבים העובריים שיש לבצע מניפולציה צריכים להיקבע בהתאם למטרה. כדי לתייג נוירונים פירמידליים עתידיים II/III, E14.5 מתאים. כדי לסמן אבות גלייה, אלקטרופורציה חייבת להתבצע על E15-16. לחילופין, ניתן להרדים את העכברים בשאיפת איזופלורן (1%-2%).
8. לאחר שהעכבר מורדם עמוק, הניחו אותו על צלחת חמה ב 38 מעלות צלזיוס.
   הערה: ודא שהעכבר אינו מגיב לצביטת הזנב.
9. לאחר הסרת הפרווה סביב אתר הניתוח באמצעות קרם דפילטורי, יש לחטא את אזור הניתוח מספר פעמים בתנועה מעגלית עם פילינג על בסיס יוד ואלכוהול 70%. בצעו חתך עור באורך 2 ס"מ לאורך קו האמצע מגובה זוג הפטמות השני^{האחורי ביותר} מלפנים, ולאחר מכן חתך בקו האמצע של 2 ס"מ בדופן הבטן לאורך קו האמצע (איור 1A).
   הערה: בתהליך החתך בדופן הבטן, הרימו אותו מעט בעזרת מלקחיים עדינים כדי לא לחתוך את האיברים הפנימיים.
10. הניחו יריעת פלסטיק סטרילית על העור ופיסת נייר טישו סטרילית עליה (איור 1A). צור חור במרכז כדי לחשוף את אזור הניתוח.
    הערה: יריעת הפלסטיק הסטרילית ונייר הטישו הסטרילי מונחים לאחר ביצוע החתך מכיוון שנדרש שדה ראייה רחב כדי למקם את החתך המתייחס למיקום הפטמות.
11. הרטיבו את הנייר עם PBS סטרילי, התבוננו היטב בקרני הרחם מהחתך, ומשכו את קרן הרחם דרך חורי גיליון הפלסטיק והנייר.
12. באמצעות מיקרופיפטה המחוברת למכלול צינור אספירטור, הזריקו 1 מיקרוליטר של תערובת הפלסמיד לחדר הצדדי השמאלי או הימני דרך דופן הרחם באמצעות לחץ פקיעתי (איור 1A).
    הערה: לחלופין, ניתן להזריק פלסמיד באמצעות מיקרו-מזרק.
13. צבטו את ראש העובר עם אלקטרודה מסוג טוויטר והפעילו פולסים אלקטרוניים באמצעות אלקטרופורטור (35 וולט עבור E14-16, 50 וולט עבור E17, 50 מילישניות פולסים מרובעים עם מרווחים של 450 מילישניות, 5 פעמים) (איור 1A).
    הערה: אין לצבוט את ראש העוברים בחוזקה, דבר שיפגע בעוברים. הזרם בפועל צריך להיות 40-70 mA.
14. הניחו את קרן הרחם בחזרה לחלל הבטן.
15. תפרו את דופן הבטן באמצעות חוט משי 5-0.
16. החל תמיסת atipamezole במינון של 10 μL / g משקל גוף intraperitoneally.
17. תפרו את העור באמצעות חוט משי 5-0.
    הערה: ניתן לסגור את העור באמצעות קליפ אוטומטי.
18. שמרו את העכברים שעברו מניפולציה על צלחת חמה למשך 30 דקות לפחות. העכברים יתחילו לנוע בכלוב.
    הערה: ההליך של אלקטרופורציה ברחם (משלבים 1.7 עד 1.16) צריך להיעשות בתוך 30 דקות. זמן הפעולה הטיפוסי הוא 20 דקות.

2. הכנת פרוסות

הערה: טריות הפרוסות היא המפתח להצלחת ניסוי זה. יש להכין את הפרוסות (משלבים 2.5-2.12) תוך שעתיים.

1. הכינו את תמיסת המלח המאוזנת של הנקס עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺; HBSS(+). הוסף 5 מ"ל של CaCl₂ (14 גרם / ליטר, autoclaved) ו- 5 מ"ל של MgSO 4.7H₂O (20 גרם / ליטר, autoclaved) ל 500 מ"ל של HBS(-). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. יש לבעבע את התמיסה עם גז 95% O₂ + 5% CO₂ למשך 5 דקות על קרח לפני השימוש.
2. הכינו את מדיום התרבות. יש צורך בלפחות 2.5 מ"ל למנה. הוסף 2 מ"ל של סרום בקר עוברי, 25 μL של L-גלוטמין (200 mM), 200 μL B27 (50x), 50 μL של פניצילין + סטרפטומיצין (10 K יחידות / מ"ל ו 10 מ"ג / מ"ל) ל 8 מ"ל של מדיום נוירובזאלי.
3. הכינו ג'ל אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה 3%. נקבוביות 50 מ"ל של HBSS(+), ואז להוסיף 1.5 מ"ג של אגרוז טמפרטורת התכה נמוכה, ו autoclave אותו. המיסו את האגרוז במיקרוגל ושמרו אותו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס באינקובטור אמבט מים לפני השימוש.
4. מוסיפים 1.9 מ"ל של מדיום תרבית לצלחת בסיס זכוכית. הניחו עליו תוספת של תרבית תאים בזהירות כדי לא ללכוד נורות אוויר מתחת למסנן, ואז הוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית למסנן (איור 1B). מניחים אותו על קרח.
5. לאחר הרדמת העכברים שעברו מניפולציה על ידי שאיפת איזופלורן 5%, יש להקריב אותם על ידי נקע צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) בשלבים המתאימים למעקב.
   הערה: יומיים (48 שעות) ו-3 ימים לאחר אלקטרופורציה ב-E14.5 מתאימים לצפייה במעבר רב-קוטבי-דו-קוטבי ובמצב תנועה, בהתאמה.
6. הוציאו את העוברים והניחו אותם בצלוחית פטרי עם PBS קר.
7. בחר את העוברים על ידי ביטוי של GFP או חלבונים פלואורסצנטיים אחרים תחת מיקרוסקופ.
8. לאחר עריפת הראשים של העוברים, נתחו את המוחות⁶ תחת מיקרוסקופ מנתח ושמרו אותם בקור HBSS(+).
9. יוצקים את ג'ל האגרוז המומס בטמפרטורת התכה נמוכה של 3% לתוך קריומולד (ראו טבלת חומרים), ואז מכניסים לתוכו את המוחות ומגלגלים אותם מספר פעמים. מניחים אותו בטמפרטורת החדר עד שהאגרוז מתמצק לחלוטין, ואז מניחים אותו על קרח.
10. חתכו את המוח באופן קורונלי בעובי של 350 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום רוטט (ראו טבלת חומרים).
11. סדרו את הפרוסות על המסנן (מקסימום 6 פרוסות לכל מסנן).
12. הוציאו את מדיום התרבית מבפנים ומבחוץ של המסנן (600 מיקרוליטר בסך הכל). בשלב זה, הפרוסות נלחצות ומקובעות על מסנן. לאחר 5 דקות, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית לחלק הפנימי של תרבית התא.

3. הדמיה בהילוך מהיר

1. שמור את תא התרבית מותקן על הבמה של מיקרוסקופ סריקת לייזר הפוך ב 37 ° C באמצעות תנור החימום של התא או מכסה מנוע התוחם את המיקרוסקופ לפחות 30 דקות לפני הדמיה כדי למנוע Z להיסחף. אספקת לחות 5% CO₂ + 40% O₂ גז לתא התרבית.
2. מניחים את מנת התרבות עם פרוסות שהוכנו למעלה בחדר התרבות.
3. באמצעות עדשת 20x למרחקי עבודה ארוכים (NA = 0.45), קבל כ- 10 תמונות Z-stack עם צעדים של 5 מיקרומטר כל 15-30 דקות למשך 24 שעות.
   הערה: מומלץ מאוד להשתמש בשלב XY ממונע. זה מאפשר לנו לקבל תמונות משדות אובייקטיביים מרובים. בדרך כלל, אנו מקבלים 10-20 תמונות משדות אובייקטיביים שונים בניסוי אחד בהילוך מהיר.

4. ניתוח הדמיה

1. המרת תמונות XYZT ל- XYT על ידי הקרנה מרבית של ציר Z באמצעות ImageJ או תוכנה אחרת.
   הערה: אם הפרוסות החליקו במהלך התצפית, התאימו את מיקום התאים בתוך התמונות באמצעות StackRed, תוסף ImageJ, עם הפונקציה שלו של טרנספורמציית גוף קשיח (ראו טבלת חומרים).
2. עקוב אחר מסלולם של GFP או תאים חיוביים אחרים לחלבון פלואורסצנטי באופן ידני או אוטומטי. ניתן לבצע מעקב ידני ואוטומטי באמצעות MTrackJ²⁴ ו- TrackMate ^25,26 (תוספי ImageJ), בהתאמה. מעקב אוטומטי באמצעות TrackMate יעיל לניתוח תאים רבים באופן בלתי משוחד. עם זאת, מעקב ידני באמצעות MTrackJ נשאר שימושי למעקב מדויק של תאים בודדים.

תוצאות

תאי גליה רדיאליים ב-VZ הפליאלי מייצרים רק תאי עצב עד E14, וגם תאי עצב ותאי גלייה ב-E15 ו-E16. כדי לבחון את התנהגויות הנדידה של תאי עצב ותאי גלייה בו-זמנית, סימנו אותם עם GFP משופר (EGFP) ו-RFP, בהתאמה, באמצעות מקדם ספציפי לנוירונים, Tα1 promoter²⁷, ומקדם חלבון גליה פיברילרי חומצי אנושי (hGFAP)

Discussion

פרוטוקול זה הציג שיטה לתצפית בהילוך מהיר של תאים שמקורם ב- VZ הפליאלי (קליפת המוח). כדי לתייג את התאים הנודדים מה-VZ, השתמשנו באלקטרופורציה ברחם, שבה תאים בודדים סומנו בבירור עם יחס אות לרעש גבוה יותר מאשר בתיוג וקטורי נגיפי. באמצעות אלקטרופורציה ברחם, כל סוג של וקטור בכל שילוב יכול ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.